荧光定量PCR实验报告.doc
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荧光定量PCR实验报告
目前需要检测抗癌药A在不用时间点对某抑癌基因B表达的影响，根据该药物在文献记录中发挥作用的时间点0小时，6小时，24小时给予药物，并已提取各时间点细胞的总RNA，请设计相关实验来检测药物A对基因B转录水平影响。
一、实验原理
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。
因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：
荧光探针和荧光染料。
本实验主要采用SYBR荧光染料。
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
二、实验试剂和器材
因RNA已提取，即应准备反转录和做PCR的试剂：
逆转录酶（M-MLV），核糖核酸酶抑制剂（RNasin），dNTP，TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase），随机引物（Randomprimers），琼脂糖（agarose）均为美国Promega公司产品；
荧光定量试剂盒：
HotStartFluorescentPCRCoreReagentKits（SYBRGreenI）,BBI公司，合适的抑癌基因A的引物、β-actin引物。
器材：
ABI7300Real-TimePCRSystem
RS-28高速低温离心机
超低温冰箱
微量移液器
三、实验步骤
<1>，根据该药物在文献记录中发挥作用的时间点,用抗癌药A在0小时，6小时，24小时给予药物，并已提取各时间点细胞的总RNA
<2>反转录（RT）:
反转录反应液组成如下表：
Table1MixedcomponentsforsynthesisofcDNAfirstchain
Component
Volume（ml）
Concentration
5×R.T.buffer*
5
1×
dNTP
2.5
10mM/ml
RNasin
2
20U/ml
RNA
5.3
8mg
RandomPrimer
1
0.1ug/ml
M-MLV
6
5U/ml
Nucleasr-FreeWater
3.2
Total
25
42℃反转录50min，95℃5min灭活反转录酶。
<3>SyberGreen荧光定量PCR检测：
在冰上按下表加样，
PCR反应液组成如下表：
Table2Mixedcomponentsforpolymerasechainreaction
Component
Volume（ul）
R.T.product
1
2×MasterMix
10
Primer
1+1
H2O
7
Total
20
PCR板的设置如图中所示：
PCR热循环参数：
96℃4min，然后三步反应：
94℃30S，58℃30s，72℃30s，进行40个循环，于每个循环的第三步即：
72℃30s收集荧光信号。
最后在72℃保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
四、实时荧光定量PCR结果分析:
扩增完毕后，进入结果分析界面，看CT值、起始拷贝数、标准偏差等，如果是SYBR做的话，再看下溶解曲线。
以β-actin为内参照基因，与对照组相比，得到目的基因表达的相对定量值（RQ值），将RQ值用于统计分析。
五、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。
最好设立一个专用的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。
一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。
操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。
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