磁珠分离技术.docx

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磁珠分离技术

磁珠分离技术

磁珠分离技术

摘要：

主要介绍了磁珠分离技术的基本概念，基本原理还有它的特点。

磁珠分离技术中应用最广泛的是免疫磁珠分离技术，这里详细说明了免疫磁珠分离技术的结构以及有由它的结构决定的它的一些重要特性，以及免疫磁珠分离技术的制备原理和方法。

并且详细说明了免疫磁珠分离技术的重要应用，为帮助同学了解记忆，例举了一些该技术的应用实例。

基本概念：

磁珠是一种包被有生物活性基团的功能化载体,可分散于基液中形成磁性液体材料,它兼有液体的流动性和固体磁性颗粒材料的双重特点,从而使固一液相的分离变得十分方便快捷。

磁珠法的出现和应用,给生命科学的研究提供了一种新式的手段和武器,也给大、中学生对的直观认识提供了一个简捷、客观的实验途径。

其中最常用的事免疫磁珠技术。

原理：

利用人工合成的内含铁成分，可被磁铁磁力所吸引，外有功能基团，可结合活性蛋白质（抗体）的磁珠，作为抗体的载体。

当磁珠上的抗体与相应的微生物或特异性抗原物质结合后，则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，这种复合物具有较高的磁响应性，在磁铁磁力的作用下定向移动，使复合物与其他物质分离，而达到分离、浓缩、纯化微生物或特异性抗原物质的目的。

特点:

应用于磁分离技术的磁性载体微球应具备以下特点:

粒径比较小,比表面积较大,具有较大的吸附容量;物理和化学性能稳定,具有较高的机械强度,使用寿命长;具有可活化的反应基团,以用于亲和配基的固定化;粒径均一,能形成单分散体系;悬浮性好,便于反应的有效进行。

载体微球有纳米级、微粒级的,纳米级的载体微球与微粒级的载体微球相比具有以下优点:

尺寸小,扩散速度快,悬浮稳定性好;比表面积大,偶联容量大;超顺磁性,能快速实现磁性粒子的分散与回收。

免疫磁珠（Immonumagneticbeads，IMB简称磁珠），由载体微球和免疫配基结合而成。

载体微球的核心部分为金属小颗粒（Fe304，Fe203），是一种磁性高且较稳定的磁性材料，核心外包裹一层高分子材料（如聚氯乙烯，聚苯乙烯，聚乙烯亚胺），最外层是功能基层，如羟基（．OH），氨基（．NH2），醛基（-CHO），羧基（一COOH）。

由于载体微球表现物理性质不同，可共价结合不同的免疫配基（如酶、细胞、抗体、抗原、DNA、RNA等生物活性物质。

理想的免疫磁珠为一般粒径较小，均匀的球形，具有保护性壳及超顺磁性的粒子，其结构为：

核心为磁性材料，核心外层包裹高分子材料，最外层为免疫配基。

形成免疫磁珠的关键是磁性载体，按照其结构的不同可分为三种：

（1）壳一核结构，即将高分子材料作为核，外面包裹磁性材料。

（2）壳．核．壳结构，中间为磁性材料，内层和外层为高分子材料。

（3）核．壳结构，磁性材料为核外面包裹高分子材料。

作为免疫磁珠载体的磁性微球主要是核壳式结构为最多。

磁性材料多为Fe，Ni，Co等过渡金属特定晶型的氧化物。

目前应用最广泛的是铁及其氧化物（Fe，Fe304，Fe203等）。

磁性微球是内部含有纳米磁性颗粒、外部为高分子壳层作为载体的复合材料，其广泛应用于生物分子固定化和有机固相合成，在生物工程和生物医学的研究和实践中，固定化的生物分子通常用做亲和分析的配基，也可作为生物反应的催化剂或药物磁性微球主要有以下特性：

（1）粒径小，均一程度高，磁性微粒粒径（直径）范围在30．100rim之间，且粒径分布单分散，使微球具有很强的磁响应性，又不会因粒径太大而发生沉降，具有较大的比表面积，偶联容量大。

（2）悬浮稳定性好，以便高效地与目标产物进行偶联，具有丰富的表面活性基团，以便磁性微球与具有生物活性的物质，如生物酶，蛋白质等，同时也可在其表面结合特异性靶向分子，如各种特异性抗体等，表面标记生物分子进而应用于酶的固定化，免疫检测，细胞分选，肿瘤的靶向治疗，药物载体及核酸的纯化与分离等生物和医学领域。

（3）具有超顺磁性：

在外加磁场的存在下，磁性微粒有较好的响应性，能迅速聚集，当撤去外加磁场时，磁性微粒无磁性记忆，能够均匀分散，不出现聚集现象。

（4）操作简便，在外磁场的作用下便可进行磁粒的反复分离，分离过程十分简单，可省去离心，过滤等繁琐操作，节约时间，与目前已有的医学与生物相关方法相比，具有较好的优势。

（5）磁性微球应用在生物工程，尤其是在生物医学工程时，必须具有良好的生物相容性。

这些生物高分子如脂类、多聚糖、蛋白质具有良好的生物相容性，它们在机体内安全无毒，可降解，不与人体组织器官产生免疫抗原性。

同时，磁性微粒可方便迅速地通过机体自然排出，而不会影响机体的健康，这种性质在靶向药物中尤其重要。

不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能。

（6）磁性微粒具有一定的机械强度和化学稳定性，能耐受一定浓度的酸碱溶液和微生物的降解，其结构内的磁性物质不易被氧化，磁性微粒的这种物理化学性质稳定特点，使其磁性能不易下降。

磁性微粒的制备原理与方法：

按研究磁性微粒的学科分类，可将其分为物理、化学以及其他一些特殊的制备方法。

磁性微粒的化学制备方法

1.化学共沉淀法

用化学共沉淀法合成超顺磁流体，该法指二价与三价铁离子在碱性条件下生成沉淀，或利用氧化．还原反应生成Fe304。

共沉淀反应原理方程式如下：

Fe2++2Fe3++80H’=Fe304+4H20，在合成过程中，条件的选择至关重要，物料比，碱用量，温度，晶化温度，搅拌速度，反应时间，时间等因素均会影响最终产物纳米级Fe304的生成和性质。

共沉淀法得到的磁性微粒通常粒径较小（10nm"--'100rim），因而具有较大比表面积和固载量。

但由于磁响应性较弱，含磁量低，操作时需要较强的外加磁场作用。

2.沉淀氧化法

一定浓度的铁盐在碱性条件下生成氢氧化亚铁沉淀，在恒温搅拌情况下，向氢氧化亚铁沉淀中加入双氧水使其氧化成Fe304微粒。

其反应式如下：

Fe2++20H。

=Fe（OH）23Fe（OH）2+O=Fe304+3H20采用沉淀氧化法合成Fe304磁性微粒，原材料的纯度，反应的碱比，温度，通气量，氧化时间等各个因素都对磁粒的性能有影响。

由于存在着粒度分布不均匀的问题，还有待于进一步研究解决

3.改进共沉淀法

改进共沉淀法是在共沉淀法制备Fe304纳米微粒的基础上，对其进行改进，沉淀物在洗涤、过滤、干燥时易产生团聚现象，一种通过加入表面活性剂，对制得的纳米Fe304微粒进行表面改性，使其具有亲水性或亲油性，最后通过胶溶等方式来获得磁性液体，另外一种是制得纳米Fe304复合粒子，这种纳米Fe304复合粒子能在更大pH范围内稳定分散。

蒋新宇等（2003）先通过化学反应生成Fe304微粒，充分洗涤后对其表面包覆双层表面活性剂，得到具有磁响应性和稳定性强的纳米级Fe304磁性粒子。

在改性过程中，PH值、表面活性剂的成分配比和表面活性剂的用量对颗粒改性效果影响很大，王伟等（2001）通过大量的研究，强碱性和酸性环境不利于改性，PH值在8"-'--12时效果最好，通过理论计算可以得出表面活性剂用量。

程海斌等（2003）采用改进共沉淀法制得的纳米级Fe304复合微粒，在更宽的PH范围内能稳定分散。

研究表明，PH值、表面活性剂、芎电位对Fe304复合微粒分散性产生很大的影响。

另外，磁性微粒的化学制备方法还有化学还原法、电沉积法、水热合成法等。

磁性微粒的物理制备方法：

1.高能球磨法

高能球磨法是一个无外部热能供给和由大晶粒变为小晶粒的高能球磨过程，其原理是在高能球磨机中将金属粉末长时间运转，金属粉末在接受回转机械能传递后，在冷态下反复挤压和破碎作用下，成为弥散分布的超细微粒粒。

气流磨作为常用的纳米粉碎技术，其通过热蒸汽能量或者高速气流产生的粒度微细，粒度分布窄、粒子表面光滑、分散性好、活性大、形状规则、纯度高等优点。

2.物理气相沉积法

物理气相沉积法是利用真空蒸发、激光加热蒸发、溅射、电子束照射等方法使原料气化或形成等离子体，接着在介质中急剧冷凝。

虽然制得的纳米微粒纯度高，结晶组织好，易于粒度的控制，但是技术设备相对要求高。

根据加热源的不同，目前用于制备纳米铁微粒的方法可以分为：

1、热等离子体法，该法是将金属粉末用等离子体熔融、蒸发和冷凝以制得纳米微粒。

所制得的微粒粒度均匀、纯度高。

郝春成等（2000）采用心+H2电弧等离子体方法制备出平均粒径为40rim的球形超铁超微粒子。

2、溅射法，溅射法是替代蒸发利用溅射现象制得的纳米级微粒。

该法不仅可以制备纳米级金属微粒，而且可用于制备纳米金属薄膜。

3、惰性气体冷凝法，是将纯度高的惰性气体和蒸发物质引入到真空加热蒸发装置内，经过一系列能量反应，最后通过凝聚作用形成纳米级簇团。

刮下聚集在液氮冷却棒上的粉状微粒，在真空高压装置中制备成厚度为10微米～1毫米、直径为几毫米的圆片。

3.真空冷冻干燥法

先将湿物料在冷冻剂作用下降温冻结成凝胶或固体，然后将凝胶或固体在低温低压下真空干燥，使凝胶或固体中的溶剂成分升华除去，从而得到干燥的纳米粒子。

这种方法结合了真空技术和低温技术。

采用真空冷冻干燥法制备纳米粒子，具有微粒形状规则、粒径小且均匀、粒子间无硬团聚、化学纯度高、分散性好、比表面积高等优点。

该技术方法在大规模生产微细粉末时，不仅成本较低，而且操作简便、可靠，具有广泛的实用价值。

另外，磁性微粒的物理制备方法还有聚合法、盐析法、深度塑性变形法、分子自组装法（SA）、LB膜法等。

应用范围：

磁珠分离技术在生物学方面的应用始于20世纪70年代后期,目前已经在分子生物学、细胞学、免疫学、微生物学、生物化学等领域取得一些令人瞩目的研究成果。

免疫磁性珠（Immonumagneticbeads,IMB）是免疫微球的一种。

免疫微球是于70年代中期发展起来的一项免疫学技术,它具备了固相化试剂特有的优点以及免疫学反应的高度专一性,所以它在免疫检测、免疫吸附、细胞分离和培养等领域中得到越来越广泛的应用

1、用于细胞分离和提纯

使用IMB进行分离细胞有两种方式；直接从细胞混合液中分离出靶细胞的方法，称为阳性分离；用免疫磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以纯化的方法称为阴性分离。

免疫磁珠技术可用来分离人类各种细胞如红细胞、外周血嗜酸/碱性粒细胞，神经干细胞、造血细胞、T淋巴细胞、γδT淋巴细胞，人类关节滑膜细胞，树突状细胞，内皮细胞、及多种肿瘤细胞等。

2、体外细胞扩增

树突状细胞（Dendriticcells，DC）、造血干、祖细胞等细胞在科研及临床上都具有巨大的应用价值，但是在体内含量较少而且分布广泛，难以获得大量高纯度的细胞，限制了该领域的发展。

体外扩增辅以免疫磁珠技术有望解决这一难题。

在这一过程中，用免疫磁性微球分离纯化出待扩增的细胞，用特定的因子组合培养，许多研究者用这样的方法寻找扩增的最佳细胞因子组合和移植的最佳时机。

3、免疫检测

免疫磁性微球可以简单快速地从血液或者骨髓中富集、清除癌细胞，广泛地应用于疾病检测、癌症治疗和自身骨髓移植中，还被用于从母体外周血中分离胎儿细胞进行无创性产前诊断。

免疫磁珠分离技术用在微生物检测方面能准确快速地检测出样品中的ColiO157，这对于食品卫生和预防疾病的传播具有重要的意义。

PCR技术与免疫磁珠技术结合在分子生物学、医学诊断学等方面有非常重要的作用，这方面的研究在医学检测方面的应用，可以简便快速地诊断膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、腹膜胃癌、上皮肿瘤细胞等，使免疫磁性分离技术的应用更加广泛。

4、在核酸与基因工程上的应用

免疫磁球可以看作是亲合层析技术中的微型配基裁体，借助亲合素-生物素（Biotin-Avidin）系统免疫磁球可与非蛋白质结合，生物素和亲合素间有着高度的亲和力，两者的结合迅速、专一、稳定，在分子生物学、医学、免疫组织化学等领域中的应用也越来越广泛，与生物磁珠技术结合后，更是产生了诱人的发展前景，并广泛地应用于分离纯化RNA、mRNA、核酸片段等及相关研究。

河南惠尔纳米科技有限公司很早就在从事该方面的研究，并且已经研发出多款磁珠法核酸提取试剂盒，性能相当稳定。

下面是核酸提取的一般流程：

5、用于分型

免疫磁珠法可被应用于临床器官移植供受者的快速选配。

在高梯度磁场下,用免疫磁珠法分离静脉或腹腔血中T、B淋巴细胞，并利用分离的淋巴细胞进行HLA-ⅠⅡ类抗原分型。

如采用磁珠技术和单抗试剂建立起可在1.5h完成HLA-ⅠⅡ类抗原一类分型的新方法，还可应用免疫磁珠分离技术进行肾移植供受体的HLA分型、探讨血液病患者反复血小板输注的治疗效果与HLA之间的相关性。

6、用作靶向释药系统的载体

免疫磁性微球作为靶向释药系统的载体可使免疫磁性微球上的抗癌药物更易与癌细胞接触，服用这种制剂后，在体外适当部位用一适宜强度的磁铁，将磁性微球引导到体内特定靶区，提高了杀伤癌细胞的效果。

很多研究者使用不同的方法制成了针对不同癌细胞的免疫磁性微球，作为靶向释药系统的载体并在实验中证实这种释药载体具有良好的功效。

应用实例

1.成人骨髓基质干细胞的分离与纯化

【摘要】目的：

利用免疫磁珠分离成人骨髓神经生长因子受体（nervegrowthfactorreceptor，NGFR）阳性细胞，获得同质性骨髓基质干细胞（bonemarrowstromalcells，BMSCs）。

方法采用Percoll密度梯度离心法分离成人骨髓中单个核细胞（瑚nnonuclearcells，MNCs）。

对MNCs进行常规贴壁培养或应用磁分离技术分离NGFR+细胞。

分别检测

NGFR+细胞和常规贴壁培养所获BMSCs体外扩增和集落形成能力，分析其细胞表型和细胞周期，并进行成骨、成脂肪诱导。

结果免疫磁珠分离获得NGFR+细胞的纯度为（90．4±4．7）％，NGFR+细胞较贴壁培养获得BMSCs具备更强增殖能力和成骨及成脂肪分化潜能。

结论：

利用免疫磁珠分离骨髓NGFR+细胞可以获得同质性原始BMSCs。

2.用于溶藻弧菌快速检测的免疫磁珠技术

摘要：

近年来，我国海水养殖业发展迅速，特别是高密度养殖模式的推广，造成养殖生物细菌性疾病发生的频率和范围逐渐扩大。

由于溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）是海洋优势弧菌之一，故由溶藻弧菌引起的养殖品种的病害也占有很高比例。

由溶藻弧菌引起的鱼、虾、贝类等养殖品种致病，对我国养殖经济造成很大损失。

目前我国对于养殖经济品种溶藻弧菌等的细菌性疾病的治疗，主要依靠投放大量的抗生素，长此以往不仅使病原菌产生了耐药性，而且由于药物的残留同时也对人类的健康造成重大威胁。

因此建立溶藻弧菌的快速、准确、敏感检测方法是十分重要的。

即能够在早期诊断出溶藻弧菌潜在的致病威胁，还可以在早期进行治疗和预防，这样可以在一定程度上减少抗生素的使用，提高养殖品种的存活率。

而且建立起的检测方法还可以用于水产品的安全检测，避免食物中的溶藻弧菌对人类健康造成威胁。

免疫磁珠分离技术（immunomagneticseparation，MS）是以免疫磁珠为基础发展起来的免疫检测技术，是以抗体包被的磁珠为载体，利用抗原抗体的特异性反应,在反应体系中形成抗原-抗体磁珠复合物，该复合物在磁场的作用下做定向运动，从而达到分离抗原的作用。

免疫磁珠分离技术不仅兼具固相化试剂特有的优点和免疫学反应的高度专一性等特点，而且分离时间短、速度快、分离效率高，不影响被分离生物材料的生物学性状和功能，因此成为近年来国内外比较热门的一种新的免疫学技术，并在生物大分子与细胞的分离检测方面表现出广阔的应用前景。

本研究就是以该技术为基础，建立快速、高效的溶藻弧菌免疫磁珠快速检测技术，实验结果如下：

（1）通过石碳酸灭活法制备溶藻弧菌抗原，用以免疫新西兰大白兔，颈动脉取血法共集150mL抗血清，其凝集效价为1:

5120。

通过蛋白A柱亲和层析法从10mL抗血清纯化出浓度为2.8579mg/mL的兔抗溶藻弧菌IgG共40mL。

改良ELISA法测定IgG的效价为1:

256000。

（2）利用ELISA法检测溶藻弧菌兔抗IgG的包被效果。

结果为2μL免疫磁珠的最大结合量为0.5μg/mL。

最佳结合时间为5min。

不同pH值，离子浓度对IgG与磁珠的结合无明显影响。

（3）初步建立了溶藻弧菌免疫磁珠的检测技术：

用已包被兔抗溶藻弧菌IgG的免疫磁珠检测溶藻弧菌，结果为1mL菌液中免疫磁珠的最佳加入量（最佳工作浓度）为20μL，最佳反应时间为20min。

免疫磁珠检测敏感性为2.8cfu/mL

3.磁珠分离DNA技术检测HIV-1逆转录酶基因耐药性突变

摘要HIV．1逆转录酶基因突变导致的耐药性严重影响了药物对病人的治疗效果，耐药性突变的检测对于指导合理用药具有重要意义。

发展了一种检测HIV．1逆转录酶基因耐药性突变的新方法，在两步MS—PCR方法的基础上，引入磁珠分离DNA技术并结合酶联免疫吸附检测方法（ELISA）检测逆转录酶基因耐药性突变T215F和Y181C。

结果显示：

MS—PCR结合磁珠分离技术和ELISA具有较高的灵敏度和特异性，阳性／阴性比值（P／N值）达到要求，突变型模板检测限为5％左右，耗时短且能进行高通量检测。

方法原理:

本研究采用的MS．PCR结合磁珠分离DNA技术检测耐药性突变。

原理如图1所示。

81：

在第一轮PCR得到待检测位点基因后，第二轮PCR引入MS—PCR检测点突变技术的原理，设计了一对长度一致的MS—PCR引物。

其中Pw和P。

的3’末端第一位碱基分别与野生型和突变型模板的碱基序列相对应，P。

和P。

分别在3’末端2～4位的不同位置再引入一个突变，这样两个引物就有3个位点不匹配。

两个引物通过竞争，分别扩增与自身序列更相似的模板。

在PM的5’端标记地高辛，BIO．RT2的5’端标记生物素，当有突变型模板存在

时，P。

引物竞争突变型模板能力强于Pw，PCR产物为一端生物素另一端地高辛标记的双链DNA，利用亲和素包被磁珠捕获DNA产物，通过碱性磷酸酶标记的地高辛抗体可以利用酶联免疫吸附检测（ELISA）方法对DNA产物中的地高辛进行检测，从而检测点突变的存在。

总之，MS—PCR结合磁珠分离DNA技术能够实现对逆转录酶基因的耐药性突变检测，具有灵敏度高、特异性好、无污染、能实现高通量等一系列优点，有较好的临床应用前景，下一步工作将进行较多临床样品实测，并通过与国际认可标准方法的平行比较，以完善该方法以求达到临床应用要求。

4.致病性大肠杆菌与免疫磁珠分离技术

致病性大肠杆菌特别是O157：

H7已成为世界性的传染性病原，是食品安全和公共卫生的重要监测对象之一。

免疫磁珠分离技术是一项新的技术，可以特异性地、有效地分离出相应的0157和其它微生物及生物活性组分，提高检测的准确性和工作效率。

免疫磁珠分离技术是一项新的技术，可以特异性地、有效地分离出相应的0157和其它微生物及生物活性组分，提高检测的准确性和工作效率。

免疫磁珠（ImmunomagneticBeads，IMB）就是将直径0．05—4微米具有超顺磁性的微粒的表面经化学修饰，使之与特异性抗体牢固结合，成为能与特异性抗原结合且有磁性的微珠。

样品经6～18小时增菌后，分别取1一1．2毫升增菌液和50微升免疫磁珠加入带盖塑料瓶中，在磁板背景下混合，如果有相应抗原存在，免疫磁珠就会将其捕获，然后利用磁性将免疫磁珠聚集，经清洗后接种到选择性分离平板上.

5.磁分离技术及其在食源性致病菌监测中的应用进行分离

免疫磁珠分离技术的最突出的优点是特异性强，可以明显提高检免疫磁珠分离技术在传统分离培养方法中的应用免疫磁珠分离技术可以选择性的富集样品溶液或增菌液中的目标致病菌,通过洗脱可以除去检样中的各种杂菌和干扰物质,因此可以显著提高食源性致病菌的检出率。

Skjerve[21]等报道采用免疫磁性分离技术,从乳及乳制品、肉类和蔬菜中分离沙门菌,其检测灵敏度为100cfu/g。

Chapman[22]分别用选择性平板直接分离和免疫磁珠分离的方法从84份牛粪中分离O157:

H7,分离菌株数分别为23和61,说明免疫磁珠分离O157:

H7的灵敏度、特异性都较好。

陈纯[23]等应用自动酶标免疫检测系统（VIDAS）、自动免疫磁珠收集系统（AIMS）、传统的常规分离方法对肠出血性大肠杆菌O157:

H7检测进行了比较,结果应用自动免疫磁珠收集系统对79份样品检测,检出率为6133%,而自动酶标免疫检测系统（VIDAS）和传统分离方法未检出。

测靶细菌的准确性，此外，在有些情况下可以节约12～18小时的时间。

结论：

免疫磁珠分离技术（Immunomagneticbeadssep—arationtechniques，IMB）是将免疫学反应的高度特异性与磁珠特有的磁响应性相结合的一种新的免疫学技术；是一种特异性强、灵质纯化敏度高的免疫学检测方法和抗原纯化手段。

是近年来国内外研究较多的一种新的免疫学技术。

目前该项技术在细胞分离、蛋白、免疫学及微生物学检测等方面均取得了较大的进展，是目前最有推广价值的技术之一。

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