重离子诱变微生物的优良菌种的筛选汇总文档格式.docx
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1.1微生物的诱变2
1.1.1物理诱变2
1.1.2化学诱变3
1.1.3重离子诱变3
1.1.4重离子诱变的理论基础3
1.1.5重离子诱变与传统诱变相比具备的优点4
1.2嗜热厌氧梭菌简介4
1.3酵母菌简介5
1.4溶纤维丁酸弧菌简介5
1.5纤维素6
1.6纤维素乙醇简介6
1.6.1纤维素乙醇国内外研究现状6
1.6.2纤维素乙醇的前景7
1.7纤维素乙醇的工艺方法7
1.7.1分步糖化发酵法（SHF）7
1.7.2同步糖化发酵法（SSF）7
1.7.3共发酵法（SSCF）8
1.7.4联合生物加工法（CBP）8
1.8研究背景和内容8
1.8.1研究背景8
1.8.2研究内容9
第二章实验仪器与药品10
2.1实验仪器10
2.2实验药品13
第三章重离子对微生物的诱变16
3.1实验材料和方法16
3.1.1实验材料16
3.1.2培养基和培养条件16
3.1.3实验方法18
3.2重离子对嗜热梭菌的诱变20
3.2.1实验菌种20
3.2.2培养基20
3.2.3培养条件20
3.2.4嗜热梭菌菌悬液的制备20
3.2.5嗜热梭菌最适菌悬液稀释度的确定20
3.3重离子对溶纤维丁酸弧菌WH-1的诱变21
3.3.1实验菌种21
3.3.2培养基21
3.3.3培养条件21
3.3.4溶纤维丁酸弧菌WH-1菌悬液的制备21
3.3.5溶纤维丁酸弧菌WH-1最适菌悬液稀释度的确定21
3.4重离子对酵母菌的诱变21
3.4.1实验菌种21
3.4.2培养基22
3.4.3培养条件22
3.4.4酵母菌菌悬液的制备22
3.4.5酵母菌最适菌悬液稀释度的确定22
3.5重离子诱变高产菌株的筛选22
3.5.1诱变菌株的选育22
3.5.2致死率的计算22
3.5.3初筛23
3.5.4复筛23
3.6结果与分析23
3.6.1总结23
3.6.2菌落的形态24
3.6.3致死率的计算24
3.7本章小结27
第四章结论与展望28
4.1结论28
4.2展望28
参考文献29
致谢31
引言
嗜热梭菌、酵母菌和溶纤维丁酸弧菌WH-1具有很好的纤维降解能力，并具有一定的产乙醇能力。
人们通过对这类细菌的认知来了解纤维素微生物水解机制、生物质能源的转化和秸秆纤维素资源的最优化最大化利用具有重大的理论意义和潜在的经济价值。
因此引起国内外专家和学者的重视。
但是嗜热梭菌、酵母菌和WH-1的乙醇产量并不是非常高。
重离子诱变作为一种新兴辐射诱变，依据能量的高低和最终对生物体所产生的效应为能量沉积效应、质量沉积效应、电荷交换效应[2]。
重离子诱变的影响是非常特别的。
重离子诱变有很多的优点，远远比传统的辐射诱变更具优点。
它的优点的具体表现在具有传能线密度大、氧化作用小等很多方面。
重离子诱变还可以用在诱变育种选育方面，重离子诱变特别是低能碳、氮离子束对植物诱变育种和微生物方面诱变选育方面具有非常大的作用，它会使得植物和微生物的致突变作用变强。
将重离子诱变运用到微生物诱变育种和生物能源的开发中来具有潜在的经济和社会效益。
因此用重离子诱变技术对嗜热梭菌、酵母菌和溶纤维丁酸弧菌WH-1进行诱变，拟通过这个办法提高嗜热梭菌、酵母菌和溶纤维丁酸弧菌WH-1产乙醇的能力。
具有潜在的应用前景和研究价值，为下一步的研究和应用提供基础的数据！
第一章文献综述
1.1微生物的诱变
诱变育种对植物和微生物的高产品种选育是一直被广泛应用的途径之一。
目前国内学者对微生物育种主要应用的还是传统的化学和物理等诱变方法[5]。
1.1.1物理诱变
1、紫外诱变
紫外诱变是最普遍应用的物理诱变的一种方法，对微生物体的致突变有很强的效应[5]。
生物体的遗传物质DNA嘧啶和嘌呤的最大吸收峰在260nm，所以在260nm的紫外线辐射是十分高效的致死剂[6]。
现在人们对紫外诱变对生物体的诱变机制有几种解释，但是人们普遍接受的定义是紫外诱变使生物体遗传物质DNA分子形成嘧啶二聚体[7]。
嘧啶二聚体的形成会影响碱基A、T、C、G之间的互补配对，因此可能会导致生物体的突变[8]。
2、电离辐射
γ-射线是电离生物学中最普遍应用的一种电离射线，有非常高的能量，能够引起电离作用，可非常有效地改变生物体遗传物质DNA的构型[9]。
它的直接作用是可以氧化DNA脱氧核糖的碱基或者DNA脱氧核糖的化学键、五碳糖-磷酸相连接的化学键[9]。
它的间接作用是可以让水分子或者有机分子产生自由基，正是因为这些自由基的产生可以和细胞中的溶质大分子发生化学反应，从而导致DNA分子片段的丢失和损坏。
3、微波辐射
微波诱变是一种低能量电磁诱变，当微波范围在300MHz~300GHz的时候，微波诱变对生物体有很强生物作用，即微波效应和热效应[10]。
微波效应指生物体在微波效应作用下，生物体会出现和温度毫无关联的物理化学反应；
它的热效应是指它能引起生物体局部温度升高。
从而引起物理化学方面反应。
在这两种效应的互相影响之下，生物体会生成一连串诱变效应。
所以，在农作物诱变育种、动物诱变育种和工业微生物诱变育种中，微波辐射被广泛的应用，并且收获了一定成效。
1.1.2化学诱变
在某种范围内，化学诱变的应用更加普遍。
化学诱变是指使用名叫化学诱变剂的化学化合物来增加微生物的自然突变率[5]。
可操作性特别强、操作简单和诱变的特异性较强是化学诱变相对于传统物理诱变突出的优点，并且能对遗传物质DNA的某些碱基进行定点诱变，后代的遗传性比较稳定，一般遗传到第三代就比较稳定。
化学诱变还应用到遗传标记。
1.1.3重离子诱变
重离子诱变技术是二十世纪中后期兴起的一种新兴的诱变技术，这种技术作用于生物体表面，对生物体具有很强的致突变效果。
余增亮等一些人率先把这一新兴的诱变技术应用在植物和微生物育种方面，并且取得了很大的成效。
重离子诱变技术具有传线密度大，对生物体的损伤不易修复等优点，因此引起了国内外学者的广泛关注。
低能量的离子束对植物和微生物的诱变机理独特且生物学效应显著，为微生物和植物诱变育种提供了一条崭新的途径。
在这种新兴诱变的带领之下，将会为微生物产品的工厂化生产提供有力支持。
1.1.4重离子诱变的理论基础
1能量沉积效应
当注入的重离子作用于生物体表面时，一部分离子能量将随着动量方向指向生物体表面并到达生物体表面，引起生物体表面的溅射[11]。
另外，注入粒子在每次碰撞时都会把动能传递给生物体表面粒子，也会发射能量较高的二次离子[12]。
离子束的溅射就好像一把手术刀，对生物体进行精细加工，使生物体表面层层剥落[13]。
随着注入离子剂量和能量的增加，引蚀程度逐渐加深，后来的入射的离子就可以穿行比较长的距离，落在指定的位置上[14]。
2质量沉积效应
质量沉积效应是重离子注入所发生的特别效应，在注入离子与靶细胞相互作用的过程中[15]，入射离子最开始能量是最高的，在注入离子和靶细胞的非弹性碰撞过程（电子阻止过程）中[16]，使细胞电离或者激发，从而导致细胞电离损伤。
随着入射深度的增加，注入离子能量也逐渐降低，这时候弹性碰撞起主导作用（核阻止过程），并通过碰撞、级联和反冲碰撞，导致生物体内原子移位，并且留下空留的位置和断裂的化学键键。
随着入射深度进一步增加，细胞核阻止本领上升，在注入离子达到终点时，离子能量的损失达到最大。
这时候，能量降低的注入离子也会以高斯分布的形式沉积下来。
如果注入离子是活性离子，则它们在沉积过程中将不断与生物分子置换、键合或者填充空位，形成新的分子基团[17]。
这就是所谓的“质量沉积效应”。
3电荷交换效应
目前大部分学者研究的细胞和生物分子是负电性的。
注入重离子的电荷交换作用，可以使生物体电性发生变化[18]。
注入负电性的离子，可以使细胞和生物分子负电性增强；
如果注入的离子的电性是正离子，则可以使细胞和生物分子负电性降低，甚至会影响生物电性的极性。
细胞表面的电性如果发生改变则细胞跨膜的物理场相应的跟着改变，严重影响着细胞膜内外物质运输、能量的转换、代谢调控、信息传递等各种生物学反应[19]。
1.1.5重离子诱变与传统诱变相比具备的优点
传统的诱变技术在诱变育种工作中已经取得很多成就，但这些诱变源以及诱变手段的反复使用，导致微生物对此产生抗性，诱变产生新突变的能力减弱。
与传统的物理化学诱变相比之下，重离子诱变技术具有对生物体的突变率比较高，而且离子束对生物体细胞的损害不容易被修复[20]，所以重离子诱变之后的生物体遗传比较稳定。
重离子可以对生物体辐照位置进行选择，对生物分子和细胞进行定点诱变。
重离子诱变在质量沉积的同时又有能量的转移，具有传统化学和物理诱变双重特性[20]。
因此，将重离子诱变技术作为一种新兴的诱变手段具有广阔的前景和潜在的经济价值。
1.2嗜热厌氧梭菌简介
嗜热梭菌（Clostridiumthermocellum）是一种革兰氏阳性菌，菌种的最适生长pH为7.5~8.0，最适生长温度为55-60℃[21]。
作为一种厌氧菌，嗜热梭菌仅仅依靠糖酵解过程提供自身能量没办法合成充足的细胞外蛋白质，所以嗜热梭菌能自身合成一种纤维素酶复合体（Cellulosome），它的酶效率大约比木霉的纤维素酶效率大约高出50倍之多。
研究表明，嗜热梭菌能够直接降解纤维素，并且可以在细胞内通过对纤维寡糖的β-糖苷键进行磷酸化而获得额外能量[22]，不需要外加水解酶，所以它被公认为是CBP工艺比较理想的菌种。
以纤维素类原料为碳源底物，嗜热梭菌在厌氧发酵过程中特殊的纤维小体能够有效降解微晶纤维素。
相比较其他真菌，利用嗜热梭菌发酵产能，有着明显的优越性：
首先，它可直接以纤维素和半纤维素为碳源底物[23]；
其次，发酵工艺过程相对简单，对设备要求比较低，代谢速度快；
此外，高温厌氧的发酵环境能有效的避免污染杂菌，并且有利于发酵产物的回收。
1.3酵母菌简介
酵母菌（Scheffersomycesstipitis）是从寄生在树木和腐木中的寄生虫幼虫体内分离而得到的一种酵母菌，由于其具有特殊的生长环境和生长方式，赋予了酵母菌菌特殊的能力即可以利用木质纤维素水解液中大部分糖类物质产乙醇，如葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖，还可以利用纤维二糖等糖类物质。
酵母菌是天然存在的发酵木糖最好的酵母菌种之一，它可以生物转换木糖等糖类物质产生乙醇，其与传统酿酒酵母菌株相比较，由于其有较低的乙醇和糖耐受力，这一特性限制了酵母菌菌作为工业菌株在从木质纤维素大规模生产生物乙醇中的使用，所以为了利用酵母菌发酵纤维素得到高产量的乙醇，学者们把眼光放在了对酵母菌的改造上，试图通过应用重离子诱变、基因工程技术和细胞融合等方法构建重组酵母菌发酵糖类物质生产乙醇，使其在工业上大规模生产，减少木质纤维素等物质的浪费，变废为宝，解决能源危机等问题。
1.4溶纤维丁酸弧菌简介
本课题所用的实验菌株是从反刍动物瘤胃液中分离得到的瘤胃纤维降解细菌，此类微生物是专门降解植物细胞壁的菌种，它们被称为降解纤维的最具潜力的潜力股。
论文中的WH-1菌均是丁酸弧菌属中的溶纤维丁酸弧菌，菌细胞形态为弧状杆菌，属于革兰氏阳性菌。
不同菌株之间具有较大差异性。
溶纤维丁酸弧菌可发酵的底物范围广，所代谢的产物种类丰富。
菌株以糖类为底物可以生长，也可在纤维素上生长。
除了国外一些研究中利用了微生物发酵甘油，国内张宏武等人利用浸麻芽孢杆菌与红曲菌9906双菌混合发酵[24]，以甘油为底物生成乙醇，该研究所得乙醇产量相对来说较高。
最近几年研究发现溶纤维丁酸弧菌可以以甘油为底物发酵生产乙醇。
通过研究发现，反刍动物瘤胃微生物Butyrivibriofibrisolvens被利用为二代生物燃料的生产菌株具有很大优点：
一是不但具有纤维降解活力，还具有多种水解酶活力，为植物细胞壁降解提供坚实基础；
二是B.fibrisolvens具有基因修改的潜力，故一直作为基因转移的目标，可以耐任何瘤胃细菌的质粒，因此，通过菌种改造来提高产量方面具有很大发展空间；
三是B.fibrisolvens包含不同作用模式的碳水化合物分解代谢调节系统，可以同时以葡萄糖和木糖为底物进行发酵；
四是此类菌体生长的氧需求和乙醇合成的氧需求一致，有乙醇代谢途径。
以上论述为本课题利用溶纤维丁酸弧菌提供了坚实的理论基础。
1.5纤维素
纤维素（cellulose）是以β-1，4-糖苷键连接葡萄糖残基组成的不分支的直链葡聚糖，是植物中存在最广泛的骨架多糖[25]，是支撑细胞骨架，纤维素是地球上分布最广、含量最多、最廉价的可再生的生物质资源，是碳循环中的主角。
每年我国有非常多的森林、农业生物质废弃物，其中农作物生产中产生的残渣如小麦秸秆、稻草、玉米秸秆、高粱秸秆等就约有7亿吨；
在森林中通过采伐、修剪、截枝后废弃的木质生物质有2000万吨；
在工业生产中产生的纤维素废弃物高达百万吨，而实际的利用率还不到总量的百分之一，大多数都被直接烧毁，用这种方式处理不但会污染环境，而且大大降低了资源的利用率。
所以，当今全世界重要的研究课题之一是如何科学、合理地开发利用这一生物质资源。
植物原料由三大部分组成，它们是纤维素、半纤维素、木质素，其中木本植物原料中以纤维素含量最多，而草本类原料主要为半纤维素。
1.6纤维素乙醇简介
纤维素乙醇的生产原料来源于农作物秸秆、草皮和废纸等纤维素城市垃圾等，在缓解能源短缺问题的同时，又对解决环境污染具有深远的意义，两全其美。
1.6.1纤维素乙醇国内外研究现状
在全球能源危机的大背景之下，纤维燃料乙醇在国内外的研究形势大好，降解纤维素生产乙醇发酵的研究已经取得很多成果，在一些关键技术上取得了重要突破和进展。
由于纤维素乙醇存在生产技术和工艺的限制，所以其研究大部分还停留在实验室和中试阶段无法进行商业化的工业生产，总而言之纤维素乙醇的研究目前没有取得革命性的进展，所以距离纤维素乙醇的工业化生产还有很大的差距。
生产乙醇的工艺还没有十分完善，很多关键性的技术有待研究，但是生产乙醇的工艺已经取得了阶段性的成果，此工艺具有十分广阔的工业化前景。
对我国来说，经过《可再生能源发展“十二五”规划》的实施，加大了生物质能源领域的研究投入，纤维素乙醇产业化生产将会在我国取得更大突破和发展。
1.6.2纤维素乙醇的前景
自工业革命以来，人类开始对石油、煤炭等化石能源的消耗越来越多，对它们的依赖越来越严重。
然而，随着化石能源的燃烧和消耗产生了大量的温室气体，结果导致了温室效应，进而引起冰川融化、海平面上升，威胁着人类的生存安全。
纤维素是全球最丰富最普遍而且不断再生可持续的生物质能源。
随着国际对能源的不断需求以及传统能源的枯竭，许多国家对新型可再生能源的生物能源重视起来，国外许多国家都制定了开发研究计划。
例如：
加拿大渥太华Iogen生物技术公司用麦秆、玉米秆等的生物质通过热燃烧、化学和生化技术转化为纤维素乙醇[26]。
比如美国的GulfoilChemical公司已经建成了可年产纯乙醇2亿升的中试车间。
我国在纤维素乙醇技术也取得了很多成果。
这表明了中国生物质原料生产乙醇已经步入产品多元化，不久的将来，纤维素乙醇生产将会取得更大突破和发展。
1.7纤维素乙醇的工艺方法
目前，利用木质纤维素发酵生产生物燃料的工艺主要有4种：
分步糖化发酵法、同步糖化发酵法、共发酵法和联合生物加工法。
1.7.1分步糖化发酵法（SHF）
分步糖化发酵法先利用纤维素酶将纤维素水解为葡萄糖等可发酵糖，然后再将菌种接入水解液中进行发酵，这个过程需要两步进行，需要在两个不同的反应器中进[27]。
这个方法虽然弥补了菌种不能直接水解纤维素的缺陷，但是该反应还得分两步进行，需要在两个不同的反应器内经行，这毫无疑问会增加设备的复杂性和成本费用，并且发酵过程的产物会抑制纤维素酶的活性，并对后期产物生成的效率产生影响[28]。
1.7.2同步糖化发酵法（SSF）
同步糖化发酵法与上述发酵法的不同之处在于，同步发酵发是将纤维素酶和菌种同时放入一个以纤维素为碳源的反应器内，这样菌种就可以直接利用纤维素酶水解的产物，这样就避免了水解产物对酶活性的抑制作用，也节省了生产成本和操作费用[29]。
但是菌种的最适生长温度和最适pH和纤维素酶活性的最适温度和pH无法吻合，也没办法找到一个折中的pH和温度，这样也会影响后续发酵产物的速率。
1.7.3共发酵法（SSCF）
共发酵法是将纤维素和半纤维素水解的葡萄糖和木糖放在一起进行发酵，因此菌种可以同时利用葡萄糖和木糖进行发酵生产乙醇从而提高产物的产率。
葡萄糖和木糖共同发酵简化了操作流程，降低了生产成本。
但共发酵法最大的缺点是大多数的微生物不能代谢木糖[30]，用于发酵的微生物是转木糖降解酶系基因的酵母菌。
1.7.4联合生物加工法（CBP）
联合生物加工法是将纤维素酶的生产、碳源底物的水解和发酵组成一步在同一个反应器进行，这样就要求纤维素酶的产生和发酵产物乙醇由同一种微生物来进行。
这样就简化了工艺流程和生产成本。
但由于副产物的产生和菌体对产物的耐受力较差，所以产物的产率很低[31]。
1.8研究背景和内容
1.8.1研究背景
当人类社会踏进二十世纪大门的时候，人类社会也进入了一个经济发展的高速期。
特别是我国，中国是全世界最大的发展中国家，经济的快速增长对化石能源有很大的依赖性。
随着经济的快速发展，煤、石油等化石能源的快速的消耗，人类社会和自然环境的矛盾越来越尖锐。
比如近两年频发的雾霾天气，呼吸道类疾病的发病率直线上升，对人类的自身健康问题和生存环境带来了巨大的挑战。
因此，寻找一种代替化石能源的可再生清洁能源的任务迫在眉睫。
当然乙醇就是一种很好的替代品。
以生物乙醇为代表的“第一代生物燃料”已经相当成熟。
这类乙醇使用粮食或者甘蔗作为原料，通过淀粉或者蔗糖发酵得到的，大大降低了一氧化碳、二氧化硫、碳氢化合物的排放，对环境污染的改善起到了很大的作用。
然而大力发展第一代生物燃料--生物乙醇势必会导致与人争粮，与粮争地的局面。
因此纤维素乙醇是一个很好的替代品。
据相关学者分析，地球上的石油资源将在数年内枯竭，为了缓解这一能源危机，各国科研人员开发出了新的能源生成途径——以纤维素为主要碳源发酵生产乙醇。
近几十年来，纤维素燃料乙醇的研究虽然取得了显著成果，但其生产成本高，一些关键技术仍影响着乙醇的大规模生产。
我国是一个农业大国，以纤维素为主要成分的农作物资源非常丰富，农作物秸秆的年产量约为1.8×
108亿吨，居全球首位[1]。
特别是内蒙古地区，除了玉米秸秆资源丰富之外，沙漠中用于固沙的沙柳种植面积也较大，而且每年都会再生，能产生大量沙柳秸秆。
而且目前内蒙古大部分的玉米和沙柳
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