海洋浮游生物学实验指导2008.doc
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海洋浮游生物学实验指导
实验室规则和显微镜的镜检方法……………………………………………1
实验一藻类细胞的观察与计数………………………………………………2
实验二藻类细胞大小的测定…………………………………………………4
实验三微藻的分离培养………………………………………………………6
实验四浮游动物的观察1……………………………………………………12
实验五浮游动物的观察2……………………………………………………13
实验六浮游动物的观察3……………………………………………………16
附录水生生物的基本调查方法……………………………………………17
实验室规则
1．实验课前必须预习实验内容，实验课不得无故迟到、早退、旷课。
2．实验时做到细致，认真，避免吸烟，随地吐痰，大声喧哗。
3．爱护公物，不随便动用实验室的仪器，标本。
若损坏器材，立即向老师登记，若要借用实验器材，须征得老师同意。
4．每次实验后，须交实验报告，将所用器材擦洗干净，放回原处，值日生要负责清洁工作。
显微镜的镜检方法
显微镜的使用在基础课已经熟悉，不必赘述，观察浮游生物标本，镜检方法如下：
1．制片
（1）在制片前先将盖玻片、载玻片擦干净，用吸管吸取器皿中的标本液，滴一滴于载玻片上，然后用镊子将盖破片沿着水珠的边缘慢慢放下，若发现标本液溢出或盖玻片内有气泡时，应将标本液吸回到器皿中，擦净载玻片和盖玻片，重新制片，直至水滴恰好在盖玻片内，并无气泡出现为止。
观察丝状藻类时，先用镊子取3-5根藻丝放置于载玻片上，用解剖针将藻拨弄均匀，然后吸一滴水，盖上盖玻片即可观察。
（2）每次使用显微镜之前，首先检查镜子的各机械部分和镜头是否有毛病，如发现有毛病立即向老师报告，及时进行处理。
（3）在使用显微镜之前、之后必须按显微镜的保养方法把它擦干净。
2．镜检步骤
将做好的片子置于载物台上，用物镜的低倍、中倍、高倍依次检查。
注意：
在用高倍镜头观察时，只需用微调旋钮，以免镜头压坏盖玻片而粘水，引起镜头发霉以至影响使用效果和寿命。
实验一 藻类细胞的观察与计数
（一）实验的目的和要求
显微镜下观察并识别几种常见海洋微藻的主要形态特征，识别常见种类。
了解血球计数板的计数原理，掌握血球计数板的计数方法。
（二）原理
利用血球计数板在显微镜下直接进行测定。
它观察在一定的容积中的藻类细胞的个体数目，然后推算出藻类细胞密度。
计数板是一块特制的厚玻璃片，玻片上有四个槽构成三个平台，中央平台又由一短槽隔成两半，其上各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大格，中央的一大格作为计数用，称为计数室。
计数室刻度有2种：
一种是25中格X16小格，而另一种为16中格X25小格，它们都是由400个小格组成。
每个大方格边长为1mm，则每个大方格面积为1X1=1mm2。
盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间高度为0.1mm,所以每个计数室的体积为0.1X1X1=0.1mm3,每个大格有400个小格，所以每个小方格体积为0.1/400=1/4000mm3=1/4000,000ml。
（三）实验器材及药品
显微镜、载玻片、盖玻片、解剖盘、解剖针、小镊子、吸管、培养皿、纱布、擦镜纸、鲁格氏液、自备实验报告纸及绘图铅笔（H、2H），橡皮等。
（四）方法与步骤
1、用血球计数板测定藻细胞的数量
2、检查血球计数板
取血球计数板一块，先用显微镜检查计数板的计数室，看其是否沾有杂质或干涸着的细胞，若有污物则通过擦洗、冲洗，使其清洁。
镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物时才可使用。
3、稀释样品
将培养后的藻培养液振荡振摇混匀，然后作一定倍数的稀释。
稀释度选择以小方格中的分布的细胞清晰可数为宜。
一般以每小格内含4～5个细胞的稀释度为宜。
4、加样
取出一块干净盖玻片盖在计数板中央。
用滴管取1滴藻培养液稀释悬液注入盖玻片边缘，让藻液自行渗入，计数室内不能有气泡，若藻液太多可用吸水纸吸去。
静置5—10分钟。
对于具鞭毛运动迅速种类，应先用鲁格试液固定，摇匀再取样。
5、镜检
待细胞不动后进行镜检计数。
先用低倍镜找到计数室方格后，再用高倍镜测数。
一般应取上下及中央五个中格的总藻数。
计数时若遇到位于线上的菌体，一般只计数格上方（下方）及右方（左方）线上的细胞。
计数时应不时调节焦距，才能观察到不同深度的细胞。
每个样品重复3次。
6、计算
取以上计数的平均值，按下列公式计算出每毫升藻液中的含藻量。
样品中细胞数/ml=每中格平均细胞数x25x10000x稀释倍数（采用25x16规格）。
7清洗
计数板用毕后先用95%的形酒精轻轻擦洗，再用蒸馏水淋洗，然后吸干，最后用擦镜纸揩干净。
若计数的样品是病原微生物，则须先浸泡在5%石炭酸溶被中进行消毒，然后再行清洗。
清洗后放回原位，切勿用硬物洗刷。
8、思考
1、能否用血球计数板在油镜下进行计数？
为什么？
2、根据自己体会，说明血球计数板计数的误差主要来自那些方面？
如何减少误差？
结果记录：
结果记录
名称：
总细胞数：
个/ml
第一个
中格
第二个
中格
第三个
中格
第四个
中格
第五个
中格
第一次
第二次
第三次
平均值
鲁格氏液：
碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。
先将碘化钾溶于3~5ml蒸馏水中，然后加碘，摇匀，使碘完全溶解后，再加蒸馏水至足量。
装入棕色试剂瓶。
实验二 藻类细胞大小的测定
一、目的
学习使用显微镜测微尺测定微生物细胞大小，掌握用测微尺测定细胞的方法。
二、原理
微生物细胞的大小是微生物分类鉴定的重要依据之一。
微生物个体微小，必须借助于显微镜才能观察，要测量微生物细胞大小，也必须借助于特殊的测微计在显微镜下进行测量。
显微测微计由镜台测微计和目镜测微计两部分组成。
后者可直接用于测量细胞大小。
它是一块圆形玻片，其中央有精确等分到度，测量时将其放在接目镜中的隔板上。
由于目镜测微计所测量的是微生物细胞经过显微镜放大之后所成像的大小，刻度实际代表的长度随使用的目镜和物镜放大倍数及镜筒的长度而改变，所以，使用前须先用镜台测微计进行标定，求出某一放大率下，目镜测微计每一小格所代表的长度，然后用目镜测微计直接测被测对象的大小。
镜台测微计是一块中央有精确刻玻片（图7—1），刻度的总长为lmm，等分为100小格，每小格长10um，专用于对目镜测微计进行标定的。
三、材料
1、器械
显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺，载玻片、盖玻片、擦镜纸、洗瓶、火柴、滴管。
2、藻种
培养至对数生长期的藻类培养液。
3、流程
置目测微计→置台测微计→标定目测微计→测藻细胞大小→记录结果→用毕擦拭干净
四、步骤
1、藻细胞大小的测定
2、目镜测微尺的校正
3、更换目镜镜头
更换目镜测微尺镜头（标记为PF）；或者取下目镜上部或下部的透镜，在光圈的位置上安上目镜测微尺，刻度朝下，再装上透镜，制成一个目镜测微尺的镜头。
4、某一倍率下标定目镜刻度
将镜台测微尺置于载物台上，使刻度面朝上，先用低倍镜对准焦距、看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器使两尺重叠，并使二尺的左边的某一刻度相重合，向右寻找另外二尺相重合的刻度。
记录两重叠刻度间的目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。
5、计算该倍率下目镜刻度
目镜测微尺每格长度=镜台测微尺格数/目镜测微尺格数xl0um
6、标定并计算其他放大倍率下的目镜刻度
以同样方法分别在不同倍率的物镜下测定目镜测微尺每格代表的实际长度。
如此测定后的测微尺的长度，仅适用于测定时使用的显微镜以及该目镜与物镜的放大倍率。
7、藻细胞大小的测定
8、将藻液制成水浸片。
9、大小换算
将标本先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺测定每个藻细胞长度和宽度所占的刻度，即可换算成藻细胞的长和宽。
10、求平均值
一般测量藻细胞的大小，用同一放大倍数在同一标本上任意测定l0一20个细胞后，求出其平均值即可代表该藻细胞的大小。
11、结果
（1）计算出目镜测微尺在低、高倍镜下的刻度值。
（2）记录藻细胞大小的测定结果。
12、思考
（1）为什么随着显微镜放大倍数的改变，目镜测微计每格相对的长度也会改变？
能找出这种变化的规律吗？
（2）根据测量结果，为什么同种藻其大小不完全相同？
附录：
目镜测数尺有两种：
一是特制的目镜镜头，镜片上刻有50等分或100等分的刻度，使用时直接安装在显微镜上，取代没有刻度的目镜镜头；另一种是一块直径大约17.5mm的圆玻璃片，其中央刻有50等分或100等分的刻度（图7-1A），使用时将该玻璃片安装在原来的目镜镜头上即可。
由于不同的显微镜放大倍数不同，既使同一显微镜在不同的目镜、物镜组合下其放大倍数也不同，故目镜测微尺每格实际表示的长度随显微镜放大倍数不同而异。
也就是说，目镜测微尺上的刻度只代表相对的长度。
因此在使用前须用镜台测微尺校正，以确定在一定放大倍数下目镜测微尺的每格长度。
实验三藻类的分离和培养
微型藻类的分离和培养方法基本上与菌类的方法相似，但还需加上光照条件，并以液体培养为主。
在大量培养时，可不必考虑无菌条件。
一、目的
学习单细胞微型藻类的单种分离和培养方法
二、药品、材料和用具
试管，小玻璃碎片（能载一滴水，且能放进试管内），细玻璃管（3~5mm），橡皮管（能套住细玻璃管，自行车气嘴用），显微镜，小烧杯，小电炉，试管，载玻片，棉塞，吸管，灭菌海水，培养箱。
f/2培养液：
f/2（Guillard.1962）改良配方（海水）
工作液（mg/L） 母液（g/L）
A:
NaNO3 75mg 75g
B:
NaH2PO4.H2O 5mg 5g
C:
Na2SiO3.9H2O 20mg 20g
D Na2EDTA 4.36mg 4.36g
E:
FeCl3.6H2O 3.16mg 3.16g
F:
CuSO4.5H2O 0.01mg 0.01g
ZnSO4.7H2O 0.023mg 0.023g
CoCL2.6H2O 0.012mg 0.012g
MnCL.4H2O 0.18mg 0.18g
Na2MoO4 2H2O 0.07mg 0.07g
G：
维生素B1 0.1μg 0.1mg
维生素B12 0.5μg 0.5mg
生物素 0.5μg 0.5mg
棉花过滤自然海水1升
在121℃下灭菌20分钟。
生长在静水或水流缓慢河流中的藻类，培养比较容易。
取到实验室后，要立刻从材料瓶中移到宽大的水生生物培养槽内。
为了培养大的丝状藻，要利用宽的、不高的容器。
这些容器要用玻片盖住，以防止培养物受灰尘沾污。
倒入容器的水要达到容器高度的一半，或稍多些，使水面上还有充分空气。
在容器边缘，要用一小块纵切橡皮管垫住，可使玻片不致紧贴容器，空气才能进入容器中。
细微的藻类如团藻目、硅藻门能很好地生活于培养皿中。
很多藻类如颤藻属、水绵属的若干种、轮藻属等可在实验室中保存很多年。
在迅速流动水中生长的藻如丝藻属、毛枝藻属等比较难于培养，因为它们要求经常输入氧气。
在水层较高水中，在高容器中，这些藻类迅速地死亡。
为了把这些藻类保存到实验时，应当把它们分成一些小部分，放在水层较薄的、宽的容器内，并须常常换水，把空气吹入水中。
还可以用橡皮管把水生生物培养槽和水龙头连结起来，建立有流水的水生生物培养槽。
在水生生物培养槽中培养藻类时，应尽可能创造和保持藻类天然生存条件。
把藻类培养在从采集藻类那一水域取来的水中，或其他天然水（尤其不能用自来水，因其中含很多氯气，必要的话，也须置较长时间，或加以煮开），或在水中加入混合养料，这些养料是由制造有机物质所必需的矿质盐构成。
在夏季，不要把藻类培养物放在直射太阳光下，而要放在凉爽的场所，例如向北窗台上。
在秋、冬季节，如希望藻类保持积极生活活动状态，就要把培养物移到有人工光照处。
三、操作
1．藻种的分离
藻类培养首先要有藻种。
从天然水域的混杂生物群中，用一定方法把所需藻类个体分离出来，而获纯种培养。
这种方法称为藻种分离和纯化，又称纯培养法。
真正的“纯种培养”是指在排除包括细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。
这是进行科学研究不可缺少的技术，而在生产性培养中不排除细菌的称之为“单种培养”。
（1）采样和预备培养：
首先要采集有需要分离藻类的水样，采回后在显微镜下检查。
如发现需要分离的藻类数量较多时，可立即分离。
若数量很少，最好先进行预备培养，待其增多后，再分离。
用作预备培养的培养液，各种藻类是不同的，对一些难以培养的藻类一般加入土壤抽出液较好。
预备培养液营养成分浓度应小些，一般只有原配方的1/4～1/2。
如水样中藻类种类较多，就应使用几种不同的培养液，使藻类在适合于自己繁殖的培养液中繁殖起来。
可用三角烧瓶或试管作培养容器，加入容量1/4～1/3培养液。
然后把经筛绢过滤除去大型浮游生物的水样接种进去，放在合适温度下或室内靠北窗口下培养。
在培养附着藻类时，容器可静止不动；而培养浮游藻类时，应该每天摇动一次。
有的藻类在普通培养液中完全不能繁殖，有的繁殖非常困难。
此时需改变培养液浓度，加入葡萄糖、蛋白胨等有机物，补充微量元素和辅助生长物质，加入土壤抽出液，就有可能获较好效果。
土壤抽出液制作方法：
先在试管底部，加入高约1cm土壤（采用腐殖化的农田和庭院土）。
再加入水使达5cm，塞上棉塞，采用蒸气间隙灭菌，每天灭菌1小时，连续二天。
由于气泡上升，棉塞可能弄脏。
因此，最好先在水中煮一段时间，使气泡跑掉后，再加棉塞进行灭菌。
（2）分离方法：
常用下列四种。
1）微吸管（毛细管）分离选直径较细玻管，在火焰上加热，待快熔时，快速拉成口径极细的微吸管。
将稀释适度藻液水样，置于载玻片上，镜检。
用微吸管挑选要分离的藻细胞，认真仔细地吸出，放入装有培养液的试管内。
如不成功，应反复几次，直至达到分离目的为止。
光照、恒温下培养2周，直至长出颜色为止。
此法操作技术要求高，要细心。
往往吸取一个细胞，要反复几次才能成功，且适于分离个体较大藻类。
（本实验采用该方法）
2）水滴分离法用微吸管吸取稀释适度藻液，滴到消毒过载片上，水滴尽可能滴小些，要求在低倍镜视野中能看到水滴全部或大部分。
一个载片上滴2～4滴，间隔一定距离，作直线排列。
如一滴水中只有几个所需同种藻类个体，无其他生物混杂，即用吸管吸取培养液，把这滴水冲入装有培养液并经灭菌试管或小三角瓶中去。
如未成功，需反复重做，直到达到目的。
此法简便易行，尤其适宜于分离已在培养液中占优势种类。
分离受少量生物污染培养液中的藻类多用此法。
操作时同样要求细致、认真，使用工具及培养液经严格消毒。
3）稀释分离法把含有需要分离的藻类而又混杂有其他生物的水样，取其一定量，用培养液稀释。
通过稀释到适宜程度的方法，达到把原混杂生物单个分离培养的目的。
首先把水样稀释到每一滴含有一个左右的生物细胞（也可能一个都没有，也可能有两个），在稀释过程中配合显微镜检查，调节稀释度，然后准备装有1/4容量培养液的试管20支，每一试管加入稀释适宜水样一滴，摇匀，进行培养。
待藻类生长繁殖达一定浓度时，再检查是否达到分离目的，若未达到，再重复做。
此法操作简单易行，但有一定程度盲目性，比不上水滴分离法效果好。
4）平板分离法这个方法的培养基制备和分离方法，与菌类的平板分离法基本相同，只是培养基配方不同。
也可将稀释藻液装入消毒过的小型喷雾器中（可使用医用喉头喷雾器），打开培养皿盖，把藻液喷射在培养基平面上，形成分布均匀的薄层水珠。
接种后，盖上盖，放在适宜的光、温条件下培养。
一般经过十余天，就可在培养基上发生互相隔离的藻类群落，通过显微镜检查，寻找需要的纯藻群落，然后用消毒过的接种环移植到另一平板培养基培养，也可直接移植到装有培养液并经过灭菌的试管或小三角烧瓶中，加消毒棉花塞子，进行培养。
此法较繁，但难度不大，而且可看到是否污染杂菌，对于分离已污染杂菌培养液的藻类更合适。
5）底栖藻的分离在显微镜或放大镜下挑取个体，一般可接种在固体培养基平板上，反复挑选、培养。
6）分离浮游蓝藻可利用其浮力大，易浮起在水面的特性；分离硅藻则可利用其易沉淀的特性。
用以上各种方法分离到藻种，需放在适宜光照条件下（靠南或北窗口附近光线充足处，但严防阳光直射）培养，有条件的可控制温度和利用人工光源。
培养时，每天轻轻摇动1～2次，但需注意勿把培养液沾湿棉塞，避免杂菌污染。
经一段时间后，培养物颜色逐渐变深。
再经一次显微镜检查，如无其他混杂生物，才达到单种培养目的。
2．藻种的培养
获得单种培养后，一方面扩大培养，另一方面可把藻种作较长时间保存，需要时随时取出使用。
藻种培养要求比较严格，培养容器可用各种不同大小的三角烧瓶，容量有100、300、500、1000毫升，适于逐渐扩大培养。
培养容器和工具需经煮沸灭菌或使用化学药品灭菌后，用煮沸水冲洗，培养液用加热灭菌法灭菌。
按种后瓶口用灭菌纸包扎，放在适宜光、温条件下培养，每天轻轻摇动二次。
大约二周后进行一次移植。
藻种在培养过程中必须定期用显微镜检查，保持不受其他生物污染。
3．藻种的保藏
可接在固体培养基上，在常温、弱光下保藏半年到一年；也可在低温下（冰箱内）保藏，每天接受短时间（几个小时）弱光，可保藏2～3年；如不照光，只能保藏几个月。
保藏藻种所用培养基的营养成分浓度应比正常培养基高一些，一般可增加一倍，琼脂量为1～1.5％。
也可在固体培养基上，再加培养液，然后接种到培养液中，可以避免固体培养基干涸，保藏效果比单用固体好。
4．培养液和培养基的配方
配方极多，每种配方主要适用于一定藻种，这里介绍比较常用的几种：
水生4号和克诺普（Knop）培养液，一般用于绿藻；蓝藻可用朱氏10号或水生105号无氮培养基（后者适于固氮蓝藻）；硅藻可用朱氏10号和水生硅1号培养基；另外还有海产绿藻、硅藻的培养基。
常用培养基配方见表1。
以上用水量都是加至1000mL，海藻培养液用海水，如无海水可用淡水1000mL加30克食盐代替。
土壤抽出液用菜园土1份和水2份比例混合搅匀，静置，取上清液；海泥抽出液也可用同样比例制备。
如配制固体培养基，可在培养液内加入1.5％琼脂。
从以上各种配方，可看到配制藻类培养液的几条原则：
（1）要有适量氮源（除固氮蓝藻外），如氨盐、硝酸盐、有机氮等。
（2）应包括主要元素钾、磷、镁、硫、钙等。
（3）要考虑各种盐类总浓度和pH是否适合藻类需要，可用碳酸氢钠调节pH。
（4）要加入各种藻类需要的微量元素，如铁、锰、铜、锌等（后几种包括在土壤抽出液中）。
（5）要满足某些藻类特殊需要，如蓝藻需钼，硅藻需硅。
（6）要添加适量生长物质如维生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。
5．大量培养过程
包拈接种、培养、采收等。
（1）接种：
一般要求选取生活力强、生长旺盛藻种。
可先将浓缩藻种用连续稀释法，制备一定浓度的悬浮藻液，然后接入培养容器。
接种时注意藻种和培养液比例要适当，使藻细胞在新培养液中达到一定数量。
使一开始培养，藻类在培养液中占优势，另一方面还可缩短培养周期，这是培养得到成功的经验之一。
在环境条件不很适合情况下，更需提高接种量。
一般所用藻种浓度，根据藻类体积大小，每毫升30万～300万个，采用1∶2～1∶5的比例。
还需注意接种时间，在自然光条件下，最好在上午8～10时，不宜在晚上。
尤其是能运动种类，此时明显向上浮游，接种时可把上浮优质藻类吸出做藻种，起选种作用。
（2）培养管理：
主要是使已接种培养物在相对稳定适宜环境中大量繁殖生长。
要注意以下因素：
1）二氧化碳浓度在开放式不通气方法培养中，搅拌是十分必要的，可以增加水和空气的接触面，使空气中二氧化碳溶解到培养液中，而且帮助沉淀藻类细胞上浮获得光照。
在通气培养中，培养液内应维持二氧化碳浓度在0.1～5％之间。
2）光照强度利用太阳光源培养时，一般在室内培养可放在近窗口地方，防止强直射光照射。
或利用人工光源（60～100瓦电灯或日光灯），需1500～3000勒克斯/厘米2。
3）温度适温一般在10～30℃之间，最适温常为20～25℃。
若在室外培养，夏季中午高温，冬季早晚低温，常造成不利影响，需设法调节。
4）无机营养应不断添加新鲜培养液，及时补充被藻吸收后减少了的某些元素。
5）注意pH变化如变动过大，可用酸、碱调节。
6）适当控制培养物中藻细胞浓度过高会引起光照和无机营养不足，并导致pH上升。
一般控制在0.3g（干重）/L范围内。
7）及时观察和检查藻类生长情况可以通过培养物呈现的颜色、藻类细胞运动情况、是否有沉淀附壁、菌膜及敌害生物污染迹象等观察而了解一般的生长情况。
藻种和中继培养每半月进行一次全面显微镜检查。
大量培养中发现有不正常现象，应立即镜检，目的有两个：
了解藻细胞生长情况，并检查有无敌害生物污染。
（3）采收：
培养液中藻体的适时采收，既是培养的目的，也是继续培养的手段。
因为通过采收一部分藻体，可使藻细胞浓度保持恒定。
通常在培养物细胞浓度达到干重0.4～0.5克/升时，即可采收培养总量1/3的藻体。
采收时，先搅拌培养物，取出1/3量藻液，置于沉淀缸中，加入2％～3％明矾或6％饱和石灰水。
约1～2小时，藻细胞即可完全沉淀，取出沉淀，离心、浓缩、烘干。
在大型培养池中采收藻体，可另外设计适当的工艺流程。
实验四 浮游动物的观察1
原生动物
（一）实验目的和要求：
1．掌握采集和识别浮游动物的方法。
2．经多次观察，要求掌握原生动物的基本特征、构造及常见种类．
（二）实验器材及药品
13号浮游生物网，碎盖破片，其余同实验一。
（三）观察材料：
1．池塘中或培养缸中的各种活体浮游运动。
2．固定的浮游运动标本。
（四）实验的步骤和方法：
1．浮游动物的采集方法同浮游植物。
2．浮游动物的镜检方法。
观察原生动物的方法同
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