检验学资料Word文件下载.docx
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1°
C培养24~48h，或于20°
培养5天。
然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。
立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。
阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。
淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。
培养基pH必须为中性或微酸性，以pH7.2最适。
淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。
３、V-P试验
某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。
１）O’Meara氏法：
将试验菌接种于通用培养基，于36±
C培养48h，培养液1ml加O’Meara试剂（加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氢氧化钠水溶液）1ml，摇动试管1~2min，静置于室温或36±
C恒温箱，若4h内不呈现伊红、即判定为阴性。
亦有主张在48~50°
C水浴放置2h后判定结果者。
２）Barritt氏法：
C培养4天、培养液2.5ml先加入5°
Cα萘酚（2-na-phthol）纯酒精溶液0.6ml,再加40%氢氧化钾水溶液0.2ml，摇动2~5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±
C恒温箱，如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。
３）快速法：
将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中、挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。
不产酸的培养物不能使用。
本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。
在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌时，通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生，故应省去或以氯化钠代替。
４、甲基红（Methyl
Red）试验
肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。
挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于36±
C或30°
C（以30°
C较好）3~5天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂1~2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。
迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。
甲基红为酸性指示剂，pH范围为4.4~6.0，其pK值为5.0。
故在pH5.0以下，随酸度而增强黄色，在pH5.0以上，则随碱度而增强黄色，在pH5.0或上下接近时，可能变色不够明显，此时应延长培养时间，重复试验。
５、靛基质（Imdole）试验
某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。
吲哚的存在可用显色反应表现出来。
吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。
将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36±
1C培养24h时后，取约2ml培养液，加入Kovacs氏试剂2~3滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。
实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应，若先用二甲苯或乙醚等进行提取，再加试剂，则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色，因而结果更为可靠。
６、硝酸盐（Nitrate）还原试验
有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。
亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。
临试前将试剂的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（α－萘胺乙醇溶液）试液各0.2ml等量混合、取混合试剂约0.1ml、加于液体培养物或琼脂斜面培养物表面，立即或于10min内呈现红色即为试验阳性，若无红色出现则为阴性。
用α-萘胺进行试验时，阳性红色消退很快、故加入后应立即判定结果。
进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。
α-萘胺具有致癌性、故使用时应加注意。
７、明胶（Gelatin）液化试验
有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。
挑取18~24h待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。
于20~22℃培养7~14天。
明胶高层亦可培养于36±
1℃。
每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。
平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂，若为阳性，10~20min后，菌落周围应出现清晰带环。
否则为阴性。
８、尿素酶（Urease）试验
有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。
尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。
其活性最适pH为7.0。
挑取18~24h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中，摇均，于36±
1℃培养10，60和120min，分别观察结果。
或涂布并穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，留底部作变色对照。
培养2，4和24h分别观察结果，如阴性应继续培养至4天，作最终判定，变为粉红色为阳性。
９、氧化酶（Oxidase）试验
氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。
在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂1~2滴，阳性者Kovacs氏试剂呈粉红色~深紫色，Ewing氏改进试剂呈蓝色。
阴性者无颜色改变。
应在数分钟内判定试验结果。
10、硫化氢（H2S）试验
有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。
在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中，沿管壁穿刺接种，于36±
1℃培养24~28h，培养基呈黑色为阳性。
阴性应继续培养至6天。
也可用醋酸铅纸条法：
将待试菌接种于一般营养肉汤，再将醋酸铅纸条悬挂于培养基上空，以不会被溅湿为适度；
用管塞压住置36±
1℃培养1~6天。
纸条变黑为阳性。
11、三糖铁（TSI）琼脂试验
以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置36±
1℃培养18~24h，观察结果。
本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；
产生硫化氢（变黑）。
葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。
12、硫化氢-靛基质-动力（SIM）琼脂试验
以接种针挑取菌落或纯养物穿刺接种约1/2深度，置36±
培养物呈现黑色为硫化氢阳性，混浊或沿穿刺线向外生长为有动力，然后加Kovacs氏试剂数滴于培养表面，静置10min，若试剂呈红色为靛基质阳性。
培养基未接种的下部，可作为对照。
本试验用于肠杆菌科细菌初步生化筛选，与三糖铁琼脂等联合使用可显著提高筛选功效。
三、血清学试验
血清学反应是指：
相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。
在食品微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果。
血清学反应的一般特点：
1）抗原体的结合具有特异性，当有共同抗原体存在时，会出现交叉反应。
2）抗原体的结合是分子表面的结合，这种结合虽相当稳定，但是可逆的。
3）抗原体的结合是按一定比例进行的，只有比例适当时，才能出现可见反应。
4）血清学反应大体分为两个阶段进行，但其间无严格界限。
第一阶段为抗原体特异性结合阶段，反应速度很快，只需几秒至几分钟反应即可完毕，但不出现肉眼可见现象。
第二阶段为抗原体反应的可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合反应等。
反应速度慢，需几分、几十分以至更长时间。
而且，在第二阶段反应中，电解质、PH、温度等环境因素的变化，都直接影响血清学反应的结果。
习惯上将经典的血清学反应分三种类别：
凝集反应、沉淀反应和补体结合反应。
１、凝集反应
颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合，在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应（Agglutination
reaction）。
其中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。
在该反应中，因为单位体积抗体量大，做定量实验时，应稀释抗体。
１）直接凝集反应
颗粒性抗原与相应抗体直接结合所出现的反应，称为直接凝集反应（Direct
agglution
a.玻片凝集法。
是一种常规的定性试验方法。
原理是用已知抗体来检测未知抗原。
常用于鉴定菌种、血型。
如将含有痢疾杆菌抗体的血清与待检菌液各一滴，在玻片上混匀，数分种后若出现肉眼可见的凝集块，即阳性反应，证明该菌是痢疾杆菌。
此法快速、简便，但不能进行定量测定。
b.试管凝集法。
是一种定量试验方法。
多用已知抗原来检测血清中有无相应抗体及其含量。
常用于协助诊断某些传染病及进行流行病学调查。
如肥达氏反应就是诊断伤寒、付伤寒的试管凝集试验。
因为要测定抗体的含量，故将待检查的血清用等渗盐水倍比稀释成不同浓度，然后加入等量抗原，37℃或56℃，2~4小时观察，血清最高稀释度仍有明显凝集现象的，为该抗血清的凝集效价。
２）间接凝集反应
将可溶性抗原（抗体）先吸附在一种与免疫无关的，颗粒状微球表面，然后与相应抗体（抗原）作用，在有电解质存在的条件下，即可发生凝集，称为间接凝集反应（Indirect
agglutination）。
由于载体增大了可溶性抗原的反应面积。
当载体上有少量抗原与抗体结合。
就出现肉眼可见的反应，敏感性很高。
２、沉淀反应
可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应（Precipitation）。
反应中的抗原称为沉淀原，抗体为沉淀素。
由于在单位体积内抗原量大，为了不使抗原过剩，故应稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。
１）环状沉淀反应：
是一种定性试验方法，可用已知抗体检测未知抗原。
将已知抗体注入特制小试管中，然后沿管壁徐徐加入等量抗原，如抗原与抗体对应，则在两液界面出现白色的沉淀圆环。
２）絮状沉淀反应：
将已知抗原与抗体在试管（如凹玻片）内混匀，如抗原抗体对应，而又二者比例适当时，会出现肉眼可见的絮状沉淀，此为阳性反应。
３）琼脂扩散试验：
利用可溶性抗原抗体在半固体琼脂内扩散，若抗原抗体对应，且二者比例合适，在其扩散的某一部分就会出现白色的沉淀线。
每对抗原抗体可形成一条沉淀线。
有几对抗原抗体，就可分别形成几条沉淀线。
琼脂扩散可分为单向扩散和双向扩散两种类型。
单向扩散是一种定量试验。
可用于免疫蛋白含量的测定。
而双向扩散多用于定性试验。
由于方法简便易行，常用于测定分析和鉴定复杂的抗原成分。
３、补体结合反应
补体结合反应（Complement
fixation
reaction）是在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。
补体无特异性，能与任何一组抗原抗体复合物结合而引起反应。
如果补体与绵羊红细胞、溶血素的复合物结合，就会出现溶血现象，如果与细菌及相应抗体复合物结合，就会出现溶菌现象。
因此，整个试验需要有补体、待检系统（已知抗体或抗原、未知抗原或抗体）及指示系统（绵羊细胞和溶血素）五种成份参加。
其试验原理是补体不单独和抗原或抗体结合。
如果出现溶菌，是补体与待检系统结合的结果，说明抗原抗体是相对应的，如果出现溶血，说明抗原抗体不相对应。
此反应操作复杂，敏感性高，特异性强，能测出少量抗原和抗体，所以应用范围较广。
细菌纯培养群体生长规律
将少量纯培养接种到一恒定体积的新鲜液体培养基中，适宜条件下培养，定时取样测定细菌含量，以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标，得繁殖曲线，对单细胞而言，又称生长曲线。
根据生长速率不同，分为几个时期。
（一）延迟期
lag
phase（停滞期、调整期）
表现：
不立即繁殖，生长速率近于0，菌数几乎不变，细胞形态变大。
特点：
分裂迟缓，合成代谢活跃，体积增长快，对外界不良环境敏感。
原因：
调整代谢，合成新的酶系和中间代谢产物以适应新环境。
消除：
增加接种量；
采用最适菌龄接种；
培养基成分（种子、发酵）
（二）对数期
log
phase
代谢活性最强，几何级数增加，代时最短，生长速率最大。
细菌数目增加与原生质总量增加，与菌液浊度增加呈正相关性。
代时（generation
time）：
单个细胞完成一次分裂所需时间，亦即增加一代所需时间。
G=t1-t0/n
y=xo2n
n=lgy
-
lgx/lg2
导出
G
=
t1
t0
/3.3（lgy
lgx）
影响G因素：
菌种、营养成分、营养物浓度（很低时影响）、培养温度。
（三）稳定期
stationary
phase（最高生长期、静止期）
新增殖细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，活菌数动态平衡。
生长速率又趋于0，细胞总数最高。
养分减少；
有毒代谢物产生。
稳定期细胞内开始积累贮存物，此阶段收获菌体，也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段。
延长：
补料，调pH、温度等。
此时，菌体总数量与所消耗的营养物之间存在一定关系，称为产量常数（生长效率）。
Y
X
X0
/C
其中X-稳定期细胞干重/ml，
-接种时干重/ml，C-限制性营养物浓度。
根据这一原理，可进行生物测定。
将未知混合物加到只缺乏特定限制性营养物的完全培养基中，测定培养基所能达到的生长量，就可以计算出原混合物中特定限制性营养物的浓度。
（四）衰亡期
decline
出现
"
负生长
，有些细胞开始自溶。
对于丝状真菌，细胞数目不呈几何级数增加，无对数生长期，一般有调整期，最高生长期，衰退期。
各种标本细菌学检查
血液及骨髓标本细菌学检查
【标本采集】以无菌方法取静脉血。
成人5～6ml，婴幼儿1～2m1，骨髓1～2m1。
注入血培养瓶立即混匀送检（标本量：
培养液量以1：
10为宜），必须在应用抗生素前取血。
对已用抗生素者应在下次用药前取血，并在申清单上注明（因需特殊培养基）。
亚急性细菌性心内膜炎及布鲁氏菌感染病人，除在发热期采血外，要多次采血（24h采血3-4次）和增加采血量（10m1）。
【细菌学检查】血或骨髓培养应孵育7天，此期间如发现细菌生长，经徐片革兰染色镜检后立即口头报告“疑有革兰x性菌生长“，此后约6～8h应报告药敏试验初步结果，次日发出正式细菌鉴定及药敏报告。
培养3天无菌生长通知医生，7天无菌生长正式发出阴性报告。
尿液标本细菌学检查
【标本采集】一般采用中段尿采集法：
用肥皂水及1：
1000高锰酸钾或新洁尔灭液清洗会阴部后，收集中段尿10～20m1盛于无菌容器，加盖立即送检，不超过lh。
还可根据需要采用导尿法、肾盂尿采集法、膀肮穿刺法及24h尿收集法。
【细菌学检查】
1．涂片检查：
革兰染色：
查革兰阳性菌、阴性菌或假丝酵母菌。
抗酸染色：
查结核分枝杆菌。
淋球菌涂片：
用革兰染色和吕氏美蓝染色，如发现革兰阴性成双
排列的圆形或椭圆形球菌，应进一步培养证实。
2．中段尿细菌计数：
用来助诊尿路感染。
3．细菌培养：
48h无细菌生长，报告阴性。
此间有细菌生长，需进
行鉴定相做药敏试验。
【临床意义】
1．正常人膀胱尿液通常无菌，尿液细菌学检查有助于泌尿生殖
道感染的诊断；
同时药敏试验可选择有效的抗菌药物，并可作为疗效
观察。
2．中段尿细菌计数，如为球菌感染，＞10^3／m1；
如为杆菌感染，
＞10^5／m1，常为诊断泌尿系感染的依据。
也可进行离心尿计数，＞10个菌／HPF为泌尿系感染。
但对于免疫功能低下、用抗生素后病人的尿，尿浓度变化大及尿pH值在5.0以下、8.5以上等不利于细菌生长的尿，尿频，病原菌发育要求条件高，采尿时外阴部消毒剂混入等情况时，细菌计数需结合临床具体分析。
3．10％的尿路感染者可能在同份尿标本中分离到两种细菌，并都是病原菌。
若同份标本中检出三种以上不同微生物，应认为标本被污染。
通常尿标本中革兰阴性杆菌苗落计数＞10’CFU／m1，革兰阳性球菌苗落计数＞10^4CFU／ml有诊断意义。
粪便标本细菌学检查
【标本采集】自然排便，挑取有脓血、粘液部分，放入无菌容器中，或置于保存液、增菌液中立即送检。
排便困难者可采用直肠拭于法。
湿片检查、制动试验和革兰染色镜检：
可确诊霍乱弧菌。
可查结核分枝杆菌。
可查葡萄球菌、艰难梭菌、弯曲菌和酵母样菌等。
2．细菌培养：
根据需要检查的细菌选择粪便培养条件，一般需培养2～3天，如有阳性菌生长，需进一步进行生化鉴定和药敏试验后报告。
【临床意义】人肠道中存在大量细菌，正常情况下处于生态平衡，不会致病。
当机体抵抗力低下，某引起细菌入侵或滥用抗生素致肠道菌群失调时，产生腹泻。
脑脊髓液标本细菌学检查
【标本采集】以无菌方法取脑脊髓液3～5m1立即送检。
查找一般细菌，尤其脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌和
链球菌多见。
查找结核分枝杆菌。
墨汁染色：
查找新型隐球菌。
脑脊髓液培养多数需3～4天，在此期间如有细菌生长，需经鉴定报告“×
×
菌”，同时报告药敏试验结果。
胸、腹水标本细菌学检查
【标本采集】以无菌方法穿刺抽取胸水或腹水5一10m1，注入含106mmol／L枸橼酸钠抗凝剂的无菌容器中，抗凝剂与标本之比为1：
10，立即送检。
注意应在用药前或停药后1～2日采集。
查找一般细菌。
一般培养2～3天，培养2天无细菌生长可报告之，此间如有细菌生长，需进一步鉴定和药敏试验后报告。
【临床意义1正常胸腹腔仅有极少量无菌液体。
漏出液无细菌，渗出液多可找到病原菌（肿瘤性除外）。
如有细菌，则源于原发性或继发性（邻近器官的炎症性病变）胸、腹膜炎。
心包穿刺液细菌学检查
【标本采集】在B超引导下行穿刺术。
抽取心包液2～5m1，加抗凝剂（106mm01儿枸橼酸钠：
标本为1：
10）立即送检。
【细菌学检查】内容同胸腹水检查。
【临床意义】正常心包液极少量，无菌。
漏出液无细菌，渗出液如为感染所致常可见细菌。
常见的细菌感染有：
乙型溶血性链球菌、葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌，流感杆菌、铜绿假单胞菌、偶见大肠埃希菌和伤寒沙门菌。
急性心包炎常继发于风湿热或猩红热、败血症、牙齿感染灶、肺炎、脓胸、外伤、纵隔淋巴炎或膈下脓肿。
慢性心包炎可见结核分枝杆菌，常继发于结核性胸膜炎。
关节液标本细菌学检查
【标本采集】行关节穿刺术抽取关节液2～5ml，加抗凝剂
（106mm01／Ｌ枸橼酸钠：
【细菌学检查】内容同胞腹水检查。
【临床意义】关节渗出性炎症时可见细菌。
常见的病原菌有：
淋
病奈瑟菌、葡萄球菌及链球菌，有时也可见结核分枝杆菌。
胆汁标本细菌学检查
【标本采集】行十二指肠引流术，分A（胆总管）、B（胆囊）、C（肝胆管）三管收集胆汁于无菌容器送检。
也可在胆囊及胆管手术时直接采取或胆囊造影时穿刺采取。
一般不做，必要时可革兰染色镜检。
一般需2～3天，48h无菌生长可报告阴性，此间有细菌生长需进一步鉴定和做药敏试验后报告结果。
【临床意义】正常人胆道无细菌。
当胆道梗阻细菌侵入，则发生感染。
入侵胆道的细菌主要由肠道上行而来，也可由门静脉或肠淋巴系统进入胆道，故胆道感染细菌多为肠道菌且与肠道常在菌丛相吻合。
眼、耳、鼻、咽拭子标本细菌学检查
【标本采集】
1．采集眼分泌物：
先用无菌生理盐水冲洗眼部，然后用棉拭于拭干，再用无菌棉拭于采集分泌物。
2．采集咽分
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