酶工程重点Word下载.docx
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（萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。
有时也可采用其它流体。
●反胶束萃取:
利用反胶束将酶或其他蛋白质从混合液中萃取出来的一种分离技术。
●反胶束:
指表面活性剂（由亲水的极性基团和疏水的非极性基团两部分组成）分散在连续有机溶剂中自发形成的一种稳定的纳米级的聚集体
●亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术.
●结晶:
是指物质以晶体的状态从蒸汽或溶液中析出的过程。
●ATPE:
双水相萃取技术等电聚焦IEF2-DE双向凝胶电泳
●IEC:
离子交换层析根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法.
●HPLC:
高效（压）液相层析利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程
●EP电泳指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程
●固定化酶：
通过物理的或化学的方法，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束缚于一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶发挥催化作用的酶
●修饰酶：
在体外用一定的化学方法将酶和一些试剂进行共价连接后而形成的酶
●模拟酶：
利用有机化学合成的方法合成的比酶结构简单的具有催化作用的非蛋白质分子叫模拟酶.
●抗体酶：
又叫催化抗体，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，是一类具有催化活力的免疫球蛋白，其可变区赋予了酶的属性。
●印迹酶：
以一种分子充当模板，其周围用聚合物交联，当模板分子除去后，聚合物就留下了与此分子相匹配的空穴。
若构建合适，这种聚合物就像锁一样对钥匙具有选择性识别作用。
这种技术称分子印迹，该技术的酶产物称印迹酶
●定点突变:
指在基因的特点位点引入突变,即通过取代、插入或者删除已知DNA序列中特定的核苷酸序列来改变酶蛋白结构中某个或某些特点的氨基酸，以此来提高酶对底物的亲和力，增强酶的专一性等。
●融合酶：
只要是指将两个或者多个酶分子组合在一起所形成的融合蛋白
●必需水：
对于维持酶活性所必需的最低水量为必需水，因为其于酶分子的结合十分紧密又称为结合水。
（在有机介质中，酶分子需要一层水化层以维持其完整的空间构象，一般将维持酶分子完整空间构象所必须的最低水含量称为必需水）
●水活度：
是指在反应体系中水的逸度与纯水逸度之间的比值。
●pH记忆：
将酶分子从水溶液转移到有机溶剂中，酶能保持原有的离子化状态，此时的环境因素也不能改变酶分子的这种状态，或者说酶在缓冲液中所处的pH状态仍被保持在有机溶剂中的这种现象（有机溶剂中的酶能够保持它冷冻干燥前或吸附到载体上之前所在缓冲液中的pH时的状态，酶在有机介质中能“记住”它最后存在过的水溶液的pH值，因该pH值决定了酶分子上有关基团的解离状态，这种状态在冻干过程和分散到有机介质中之后仍得到保持。
应用：
控制有机相中酶催化的最适pH。
●分子印记：
酶分子记忆原来水相中一些特性的现象称之为分子印记。
●酶反应器：
以酶为催化剂用来进行酶促反应的设备。
●酶传感器：
以酶作为分子识别元件上的敏感材料，同各种不同的转换器结合所构成的一类生物传感器。
第一章
酶工程的主要内容:
分为：
化学酶工程与生物酶工程。
1化学酶工程（初级酶工程）酶化学与化学工程技术相结合的产物。
主要研究内容：
酶的制备、酶的分离纯化、酶与细胞的固定化技术、酶分子修饰、酶反应器和酶的应用。
2.生物酶工程（高级酶工程）在化学酶工程基础上发展起来的、酶学与现代分子生物学技术相结合的产物。
生物酶工程的的主要研究内容:
（1）用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）如：
尿激酶原和尿激酶是治疗血栓病的有效药物。
用DNA重组技术将人尿激酶原的结构基因转移到大肠杆菌中，可使大肠杆菌细胞生产人尿激酶原，从而取代从大量的人尿中提取尿激酶。
（2）用蛋白质工程技术定点改变酶结构基因（突变酶）如：
酪氨酰－tRNA合成酶，用Ala5（第5位的丙氨酸）取代Thr51（第51位的丝氨酸），使该酶对底物ATP的亲和力提高了100倍。
（3）设计新的酶结构基因，生产自然界从未有过的性能稳定、活性更高的新酶。
酶简史：
1777年，意大利物理学家斯巴兰沙尼（Spallanzani）的山鹰实验。
1822年，美国外科医生博蒙特（Beaumont）研究食物在胃里的消化。
19世纪30年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。
1684年，比利时医生Helment提出ferment—引起酿酒过程中物质变化的因素（酵素）。
1833年，法国化学家Payen和Persoz用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶（diastase）。
1878年，德国科学家K?
hne提出enzyme—从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”（希腊文）。
19世纪，Pasteur和Liebig学术长期争论：
1857年，法国化学家和微生物学家Pasteur认为没有生物则没有发酵。
德国化学家Liebig认为发酵是由化学物质引起的。
此争议由德国学者Buchner兄弟于1896年解决。
Buchner兄弟的试验：
用细砂研磨酵母细胞，压取汁液，汁液不含活细胞，但仍能使糖发酵生成酒精和二氧化碳。
证明：
发酵与细胞的活动无关。
因此巴克纳获得1907年的诺贝尔奖，是酶学研究史上第一次的诺贝尔奖。
酶学的迅速发展（理论研究）
1926年,美国康乃尔大学的“独臂学者”Sumner（萨姆纳）博士从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明酶的本质是蛋白质。
由此获得了1946年的诺贝尔奖，是酶学研究史上第二次的诺贝尔奖。
1930年，美国的生物化学家Northrop分离得到了胃蛋白酶（pepsin）、胰蛋白酶（trypsin）、胰凝乳蛋白酶结晶，确立了酶的化学本质。
2002年，美国科学家芬恩，日本科学家田中耕一以及瑞士科学家维特里希获得了诺贝尔奖，其主要研究成果为“发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法”，“对生物大分子质谱分析法”，以及“利用磁核共振测定溶液中生物大分子三维结构的方法”。
1982年，ThomasR.Cech等人发现四膜虫细胞的26SrRNA前体具有自我剪接功能，将这种具有催化活性的天然RNA称为核酶—Ribozyme。
1983年，Altman等人发现核糖核酸酶P的RNA组分具有加工tRNA前体的催化功能。
而RNaseP中的蛋白组分没有催化功能，只是起稳定构象的作用。
为此，切克和阿尔特曼获得了1989年的诺贝尔奖。
1890年，Fisher——锁钥学说。
1902年，Henri——中间产物学说。
1913年，Michaelis和Menten——米氏学说。
1958年，Koshland——诱导契合学说。
1960年，Jacob和Monod——操纵子学说。
酶催化的特点：
1、效率高2、专一性强（结构专一性和立体异构专一性）3、活性可调节4、活性不稳定
影响酶催化作用的因素：
1、底物浓度2、产物浓度3、酶浓度4、温度（在达到最适温度以前，反应速度随温度升高而加快、酶是蛋白质，其变性速度亦随温度上升而加快、酶的最适温度不是一个固定不变的常数）5、pH值（过酸过碱导致酶蛋白变性、影响底物分子解离状态、影响酶分子解离状态、影响酶的活性中心构象）6、抑制剂7、激活剂
凡是能提高酶活性的物质，称为酶的激活剂）
激活剂的影响：
无机离子：
要是金属离子，它们有的本身就是酶的辅助因子，有的是酶的辅助因子的必要成分。
如:
激酶需要Mg2+激活、唾液淀粉酶需要Cl-激活、Ca离子是淀粉酶的激活剂
有机小分子：
一些还原剂，如抗坏血酸、半胱氨酸，使含-SH的酶处于还原态，从而提高酶的活力。
金属螯合剂，如EDTA（乙二胺四乙酸），可络合一些重金属杂质，解除它们对酶的抑制，从而使酶活升高。
生物大分子：
某些蛋白可以激活某些酶的活性，在生物体代谢活动起重要的作用。
终止酶反应方法：
1、加热2、加酶变性剂：
三氯醋酸等3、加酸碱4、降至10?
C以下终止反应
测定方法：
（一）终止法：
1、化学法2、放射性化学法3、酶偶联法
（二）连续反应法：
1、光谱吸收法2、量气法3、量热法4、偶联的连续法
米氏常数的测定
基本原则：
将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，再用作图法求出Km。
1Km11
—=——.—+——
vmax[S]Vmax
米氏常数的意义
当v=Vmax/2时，Km=[S]（Km的单位为浓度单位）
是酶在一定条件下的特征物理常数，通过测定Km的
数值，可鉴别酶。
可近似表示酶和底物亲合力，Km愈小，E对S的
亲合力愈大，Km愈大，E对S的亲合力愈小。
在已知Km的情况下，应用米氏方程可计算任意[s
]时的v，或任何v下的[s]。
（用Km的倍数表示）
练习题：
已知某酶的Km值为
0.05mol.L-1，要使此酶所催化的反应
速度达到最大反应速度的80％时底物
的浓度应为多少？
固定化酶活力的计算：
酶结合效率与酶活力回收率：
酶结合效率=总酶活力－未结合的酶活力/总酶活力×
100%
酶活力回收=固定化酶总活力/用于固定化的总酶活×
酶活力计算（自己看）
酶活力测定：
步骤：
a，选择适宜底物及一定浓度；
b，确定反应条件；
c，确定酶催化反应的时间；
d，终止反应。
（3）固定化酶的活力测定：
与水不溶性载体结合在一定空间范围内起催化作用的酶。
方法：
a，振荡测定法；
b，酶柱测定法；
c，连续测定法。
第二章
诱导酶生产中的应用
已知分解利用乳糖的酶有：
-半乳糖苷酶-半乳糖苷透过酶；
硫代半乳糖苷转乙酰酶。
利用纤维素或者半纤维素的物质有：
纤维素酶和半纤维素酶（即加入秸秆或者玉米芯）
常用产酶微生物：
细菌：
枯草芽孢杆菌（产中性蛋白酶和α-淀粉酶）地衣芽孢杆菌（产耐高温α-淀粉酶）大肠杆菌（产青霉素酰化酶和L-天冬酰胺酶）
放线菌：
链霉菌（生产葡萄糖异构酶，青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶）
真菌：
米曲霉、、黑曲霉（α-淀粉酶、糖化酶、乳糖酶、脂肪酶、蛋白酶）里氏木霉（木聚糖酶、纤维素酶）青霉（葡萄糖氧化酶、5’-磷酸二酯酶）
酵母菌：
啤酒酵母（凝血激酶、尿激酶等药用酶）巴斯德毕赤酵母（植酸酶）
优良产酶菌种应具备的条件
1酶产量高2易培养和管理，产酶细胞容易生长繁殖，适应性较强，便于管理。
3.菌种不易变异退化，产酶性能稳定，不易受噬菌体感染侵袭。
4能够利用廉价的原料进行酶的生产，并且发酵周期短，生产成本低。
5发酵产物利于酶产品的分离纯化，最好是分泌型的胞外酶。
6.菌株安全可靠，不是病原菌，不产毒素及其他有害物质，不影响生产人员的身体健康。
7.基因工程菌株必须符合安全性要求
pH对产酶的影响和调节控制p28
提高产酶的措施
1、添加诱导物：
分为三类（酶的作用底物、酶的催化反应产物、作用底物的类似物）2、控制阻遏物浓度：
（产物阻遏－添加产物类似物、分解代谢阻遏－分批流加少量碳源，添加一定量的环化cAMP）3、添加表面活性剂：
（离子型和非离子型－增加细胞通透性）4、添加产酶促进剂：
（可以促进产酶的物质）
提高产酶措施的原理
酶生物合成的模式
细胞生长曲线：
细胞在一定条件下培养生长，其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段通过分析比较细胞生长与酶产生的关系,可以把酶生物合成的模式分为4种类型。
即同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。
同步合成型:
酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。
该类型酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系，又称为生长偶联型。
属于该合成型的酶，其生物合成伴随着细胞的生长而开始；
在细胞进入对数生长，酶大量生成；
当细胞生长进入稳定器后，酶的合成随着停止。
酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。
当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。
延续合成型（最理想的合成模型）
酶的合成伴随着细胞生长而开始，但在细胞生长进入稳定期后,酶的合成仍将延续较长一段时间。
可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏，所对应的mRNA相当稳定，可在生长稳定期间相当长的一段时间内用于酶的合成。
中期合成型：
酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入稳定期后,酶的合成也终止。
酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。
所对应的mRNA是不稳定的。
滞后合成型（若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型）
对数期不合成，可能是由于受到分解代谢物阻遏作用的影响，只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。
许多水解酶的生物合成都属于这一类型。
受分解代谢物的阻遏作用，所对应的mRNA稳定性高，所以能在细胞停止生长以后，继续利用积累的mRNA进行翻译而合成酶。
影响酶生物合成模式的主要因素
高：
可在细胞停止生长后继续合成酶
1）mRNA的稳定性
差：
随着细胞停止生长而终止酶的合成
2）培养基中阻遏物的存在不受阻遏：
随着细胞的生长而开始酶的合成受阻遏：
细胞生长一段时间或平衡期后，酶才开始合成。
酶生产中最理想的合成模式：
延续合成型：
发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。
细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。
对于：
同步合成型：
提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵温度，也可以考虑从基因水平改造mRNA的稳定性。
滞后合成型：
可考虑从基因水平改造及发酵过程控制两个方案解除阻遏，将产酶模式变成延续合成型。
要在提高mRNA稳定性以及解除阻遏两方面努力，可考虑从基因水平及发酵温度提高对应的mRNA的稳定性；
可通过改造基因的启动子，可解除生物合成的阻遏现象，也可以通过降低阻遏物的浓度解除发酵过程的酶工程合成的阻遏。
产酶动力学
一般产酶动力学方程可表达为：
式中X——细胞浓度（g/L）μ——细胞比生长速率（h-1）α——生长偶联的比产酶系数（IU/g）β——非生长偶联的比产酶速率（IU/（g*h））E——酶浓度（IU/L）t——时间（h）
生长偶联型：
（同步合成型、中期合成型）
部分生长偶联型：
延续合成型
非生长偶联型（滞后合成型）α=0
第三章
酶分离纯化的一般原则：
（1）建立一个可靠，快速的酶活性测定方法；
（2）准确的对酶原料进行选择；
（3）最大限度提取酶；
（4）最大限度酶的提纯；
（5）酶纯度的科学检验。
酶促破碎细胞（p41，填空，不同酶的破碎方法）
外加酶法：
根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶。
自溶法（autolysis）:
细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发生溶解的现象。
酶的主要提取方法以及提取对象
酶分离纯化方法的依据：
酶分子的大小、形状、电荷性质、溶解度、亲和专一性等
酶纯化的方法：
（1）调节酶的溶解度的方法：
a，盐析法；
b，改变pH值；
c，温度调节法；
d，有机溶剂沉淀法；
e，等电点沉淀法；
f萃取
（2）根据分子大小，形状不同的分离方法：
a,离心分离；
b，凝胶过滤；
c，超滤d，透析。
（3）根据酶分子亲和专一性结合的方法：
a，亲和层析；
b，免疫吸附层析；
c，燃料配体亲和层析；
d，共价层析；
e，无机吸附层析；
。
（5）电荷极性：
电泳、电子交换层析、等电聚焦、色谱聚焦。
（需自己举例）
离心机的种类：
名称
转速（r/min）
注意事项
低速离心机
8000
常温，注意样品热变性和离心管平衡
主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离，也用于酶的结晶等较大颗粒的分离
高速离心机
（高速冷冻离心机）
10000-25000
冷冻（防止温度升高使酶失活），离心管的精确平衡
主要用于分离沉淀细胞碎片和细胞器等
超速离心机
25000-120000
冷冻＋真空系统（减少空气阻力和摩擦），离心管的精确平衡
主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子及细胞器病毒等分离纯化，样品纯度检测，沉降系数和相对分子质量的测定
超速离心分离的类型和比较（区别、联系）
答：
（1）差速离心：
采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。
用于分离大小和密度差异较大的颗粒。
优点：
操作简单。
缺点：
1）分离效果较差，不能一次得到纯颗粒。
2）壁效应严重。
3）沉降的颗粒受到挤压。
（2）密度梯度离心：
样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。
特点：
区带内的液相介质密度小于样品物质颗粒的密度。
适宜分离密度相近而大小不同的固相物质。
（3）等密度梯度离心：
根据颗粒的密度不同而进行分离。
离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。
或称为平衡等密度离心。
常用氯化铯（CsCl）作为梯度介质。
介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。
适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。
区别：
等密度梯度离心是一种测定颗粒浮力密度的静力学方法，关键在于选择氯化铯浓度，使之包括待分离物的密度范围。
差速离心是一种动力学方法，关键在于选择适合于各分离物的离心力。
密度梯度离心兼有以上两种方法的特点，关键在于制备优质的密度梯度溶液。
联系：
①都是用离心的方法进行分离②都跟分离颗粒的密度大小有关
过滤的分类及特性
类别
截留颗粒大小
截留的主要物质
过滤介质
传质推动力
应用举例
粗滤
＞2μm
酵母、霉菌、动植物细胞、固形物
滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷
压差
发酵残渣去除、菌体回收
微滤
0．2-2μm
细胞、灰尘
微滤膜
压差（0.05-0.5Mpa）
菌体、细胞和病毒的分离
超滤
0．002-0．2μm
病毒、生物大分子
超滤膜
压差（0.1-0.6Mpa）
蛋白质、多肽、多糖的回收和浓缩
透析
＞1000
大于1000的溶质
半透膜
浓度差
脱盐、除变性剂
反渗透
＜2μm
生物小分子、盐、离子
反渗透膜
压力差（大于1000Kpa）
纯水制备
沉淀分离的方法p46-p47
⑴中性盐沉淀（盐析法）⑵有机溶剂沉淀⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性）
⑷等电点沉淀⑸有机聚合物沉淀
反胶束萃取原理：
当蛋白质样本与反胶束混合时，由于反胶束溶液表面与蛋白质表面的相互作用，在两相界面形成了包含蛋白质的反胶束团，此时蛋白质以最大限度进入反胶束中，从而实现蛋白质的正萃取。
然后，含有蛋白质的反胶束与另一水相接触，通过改变水相条件（如pH、离子强度等），可以调节蛋白质反萃回水相，从而实现正萃取和反萃取的过程，回收目的蛋白质。
层析分离的方法
层析方法
分离依据
凝胶层析
相对分子质量和形状
亲和层析
亲和力
媳妇层析
吸附力
层析聚焦
等电点
分配层析
分配系数
疏水层析
疏水作用
离子交换层析
离子交换
凝胶层析原理
是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。
大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；
小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱，从而先后被洗脱出来得到分离。
电泳中聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用来测分子量。
超滤浓缩的优点
超滤浓缩以压力差为动力，将待浓缩溶液通过超滤膜，酶分子较大被滞留，水分子和小分子选择性透过，达到浓缩目的。
设备简单，操作方便，能耗少，对酶没有热破坏和相变化，还可以防止杂菌的污染，并进行除盐和分级纯化。
少量样品的处理，也可用于工业上大批量样品的浓缩。
酶浓缩的方法：
（一）蒸发浓缩
（二）超滤浓缩（三）吸水剂1.胶过滤浓缩2.聚乙二醇浓缩（四）反复冻融浓缩（五）沉淀法（盐析法，有机溶剂法）p64-p65
酶干燥的方法：
酶的干燥多采用冷冻干燥法。
将酶溶液在较低温度下（-10℃~-50℃）冻结成固态，然后在高度真空条件下，将其中固态水分直接升华为气态而除去，也称酶的升华干燥。
其他：
真空干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥p65
结晶的条件
1．酶的纯度纯度越高越易结晶（>
50％）2.酶的浓度（恰到好处）浓度越高越易结晶，控制在饱和区以上，过饱和区以下的介稳区内。
1%-5%为宜，最低不小于0.2%。
3.结晶温度4.溶液pH5.离子强度6.晶核7.结晶时间
第四章
1.相比游离酶，固定化酶有哪些优点？
游离酶的缺点酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。
2.不能回收，也使产物中混杂酶蛋白。
3.分离纯化困难。
固定化酶的优点：
1.极易将固定化酶与底物、产物分开；
2.可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；
3.在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；
4.酶反应过程能够加以严格控制；
5.产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
6.较游离酶更适合于多酶反应；
7.可以增加产物收率，提高产物质量8.酶的使用效率提高，成本降低。
2
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