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巴比妥类药物的分析药物分析
第1章巴比妥类药物的分析
1.1药物的基本结构与特征
1.1.1巴比妥类药物的结构与性质
巴比妥类药物为环状酰脲类镇静催眠药，是巴比妥酸的衍生物，其基本结构通式为：
由于5位取代基R1和R2不同，形成不同巴比妥药物，具有不同的理化性质。
临床上常用的本类药物多为巴比妥酸的5,5-二取代衍生物，少数为1,5,5-三取代物或C2位为硫取代的硫代巴比妥酸的5,5-二取代衍生物。
《中国药典》（2010年版）收载的本类药物有苯巴比妥及其钠盐，异戊巴比妥及其钠盐，司可巴比妥钠以及注射用硫喷妥钠等。
表1-1常见巴比妥类药物的化学结构
药物
R1
R2
备注
巴比妥（Barbital）
―C2H5
―C2H5
苯巴比妥（Phenobarbital）
―C2H5
―C6H5
异戊巴比妥（Amobarbital）
―C2H5
―CH2CH2CH（CH3）2
司可巴比妥钠（Secobarbitalsodium）
―CH2CH=CH（CH3）2
―CH（CH3）（CH2）2CH3
硫喷妥钠（ThiopentalSodium）
―C2H5
―C2H5
C2位S取代物的钠盐
巴比妥类药物的母核为巴比妥酸环状丙二酰脲结构。
此结构是巴比妥类药物的共同部分，决定巴比妥类药物的特性，可用于与其他类药物相区别。
另一部分是取代基部分，即R1和R2。
根据取代基不同，可以形成各种具体的巴比妥类的各种具体药物，并具有不同的理化性质。
这些理化性质可用于各种巴比妥类药物之间的相互区别。
1.1.2巴比妥类药物的特征
巴比妥类药物一般为白色结晶或结晶性粉末，具有一定的熔点。
在空气中较稳定，加热多能升华。
此类药物一般微溶或极微溶于水，易溶于乙醇等有机溶剂；其钠盐则易浴于水，而难溶于有机溶剂。
相对稳定的六元环结构，遇酸、氧化剂、还原剂时，一般不会破裂，但与碱液共沸时则水解开环，并产生氨气。
巴比妥类药物具体的理化性质如下。
1.弱酸性
巴比妥类药物的母核环状结构中含有l,3-二酰亚胺基团，能使其分子发生酮式-烯醇式互变异构，在水溶液中发生二级电离。
pK1=8pK2=12
由于本类药物为弱酸性物质（pKa值为7.3~8.4），故可与强碱反应生成水溶性的盐类，一般为钠盐。
由弱酸与强碱形成的巴比妥钠盐，其水溶液显碱性，加酸酸化后，则析出结晶性的游离巴比妥类药物，可用有机溶剂将其提取出来。
上述这些性质可用于巴比妥类药物的分离、鉴别、检查和含量测定。
2.水解反应
1）巴比妥类药物的水解本类药物的分子结构中具有酰亚胺结构，与碱溶液共沸即水解产生氨气，可使红色石蕊试纸变蓝。
2）巴比妥类药物钠盐的水解本类药物的钠盐，在吸湿的情况下也能水解。
一般情况下，在室温和pH10以下水解较慢；pH11以上随着碱度的增加水解速度加快。
3.与重金属离子的反应
巴比妥类药物的母核为丙二酰脲（－CONHCONHCO－）或酰亚胺基团，在适宜的pH值溶液中，可与某些重金属离子如Ag＋、Cu2＋、Co2＋、Hg2＋等反应呈色或产生有色沉淀。
虽然这类化学反应的专属性不强，但仍常用于本类药物的鉴别和含量测定。
1）与铜盐的反应巴比妥类药物在吡啶溶液中生成的烯醇式异构体与铜离子吡啶溶液反应，形成稳定的配位化合物，产生类似双缩脲的呈色反应。
在此反应中，巴比妥类药物呈紫堇色或生成紫色沉淀，含硫巴比妥药物呈绿色。
在不同pH的溶液中，5,5-二取代基不同的巴比妥类药物与铜盐生成的紫色化合物，在氯仿中则溶解度不同。
在pH较高的溶液中，5,5-取代基的亲脂性越强，与铜盐生成的紫色物质越容易溶于氯仿中。
此反应可用于本类药物的鉴别，也可以用来区别巴比妥类和硫代巴比妥类药物。
2）与银盐的反应巴比妥类药物分子结构中含有酰亚胺基团，在碳酸钠溶液中，生成钠盐而溶解，再与硝酸银溶液反应，首先生成可溶性的一银盐，加入过量的硝酸银溶液，则生成难溶性的二银盐白色沉淀。
此反应可用于本类药物的鉴别和含量测定。
3）与钴盐的反应巴比妥类药物在碱性溶液中可与钻盐反应，生成紫堇色配位化合物，可用于本类药物的鉴别和含量测定。
此反应在无水条件下进行，能使反应较灵敏，而且生成的有色产物也较稳定。
因此所用试剂均应不含水分。
常用试剂为无水甲醇或乙醇；所用钴盐为醋酸钴、硝酸钴或氧化钴；碱以有机碱为好，一般采用异丙胺。
4.香草醛（Vanillin）的反应
巴比妥类药物分子结构中丙二酰脲基团中氢比较活泼，可与香草醛在浓硫酸存在下发生缩合反应，产生棕红色产物。
英国药典（2005）异戊巴比妥采用此反应进行鉴别。
5.紫外吸收光谱特征
巴比妥类药物的紫外吸收光谱随着电离级数不同，而发生显著的变化。
在酸性溶液中，5,5-二取代和1,5,5-三取代巴比妥类药物不电离，无明显的紫外吸收峰。
在pH10的碱性溶液中，发生一级电离，形成共轭体系结构，在240nm处出现最大吸收峰；在pH13的强碱性溶液中，5,5-二取代巴比妥药物发生二级电离，引起共轭体系延长，导致吸收峰红移至255nm；1,5,5-三取代巴比妥类药物，因1位取代基的存在，故不发生二级电离，最大吸收峰仍位于240nm。
硫代巴比妥类药物的紫外吸收光谱则不同，在酸性或碱性溶液中均有较明显的紫外吸收。
硫喷妥的紫外吸收光谱：
在盐酸溶液（0.1mol/L）中，两个吸收峰分别在287nm和238nm；在氢氧化钠溶液（0.1mol/L）中，两个吸收峰分别移至304nm和255nm。
另外，在pH13的强碱性溶液中，硫代巴比妥类药物在255nm处的吸收峰消失，只存在304nm处的吸收峰。
巴比妥类药物在不同pH值溶液中的紫外吸收光谱发生的特征性变化，可用于本类药物的鉴别、检查和含量测定。
6.色谱行为特征
巴比妥类药物具有不同的分子结构，其色谱行为亦不同，可用于鉴别，常用方法有薄层色谱法和高效液相色谱法。
1）薄层色谱法取巴比妥类药物约50μg点于硅胶GF254薄层板上，以氯仿-丙酮（4∶1）混合液作流动相。
展开后，薄层板用温热空气流进行干燥，然后喷洒2％的氯化汞乙醇溶液，继之再喷洒2％的l,5-二苯卡巴腙乙醇溶液。
此时则在紫色的背景上观察到巴比妥类药物的白色斑点。
常见的巴比妥类药物的Rf值如下：
巴比妥，Rf＝0.59；苯巴比妥，Rf＝0.59；硫喷妥，Rf＝0.92。
2）高效液相色谱法取巴比妥类药物的乙醇溶液（1mg/ml）2μl，注入ODS柱（250mm×4.6mm，填充5μm的SpherisorbODS）中，用磷酸二氢钠（0.1mol/L）[用氢氧化钠溶液（5mol/L）调节pH至8.5]-甲醇（4∶1）混合溶液作为流动相，流速0.8ml/min，以UV检测器于210nm波长进行检测，其保留行为应与对照品一致。
7.显微结晶
巴比妥类药物可根据其本身或与某种试剂的反应产物的特殊晶型，进行同类或不同类药物的鉴别。
此法亦适用于生物样品中微量巴比妥药物的检验。
1.2鉴别试验
巴比妥类药物的结构特征和具有的理化特性，如分子结构中含有的酰亚胺基，硫元素与不同取代基等均可用于本类药物的鉴别实验。
常用的鉴别实验方法有丙二酰脲类鉴别实验，制备衍生物测定熔点，芳环反应，不饱和键反应，硫和钠元素反应等。
另外，巴比妥类药物光谱和色谱行为特征也可用于本类药物的鉴别。
1.2.1丙二酰脲类鉴别试验
丙二酰脲类反应是巴比妥类药物母核的反应，因而是本类药物共有的反应，收载在药典附录中“一般鉴别试验”项下。
丙二酰脲类的鉴别反应有银盐反应和铜盐反应，其试验原理前已阐述，鉴别试验已用于苯巴比妥、异戊巴比妥及其盐和司可巴比妥钠的鉴别。
1.2.2熔点测定
熔点是一种物质在规定的测定方法下，由固态转变为液态的温度。
纯物质的熔点是一定的，可作为一项鉴别药物的物理常数，常用于药物的鉴别；熔点也能反映药物的纯杂程度。
巴比妥类药物本身可直接用药典方法测定熔点，其钠盐可利用它易溶于水，酸化后析出相应的游离巴比妥母体，将沉淀过滤干燥后，测定熔点。
也可以将本类药物制备成衍生物后，再测定衍生物的熔点。
利用熔点测定法可鉴别苯巴比妥及其钠盐、异戊巴比妥及其钠盐、司可巴比妥钠及注射用硫喷妥钠等。
1.2.3利用特殊取代基或元素的鉴别试验
1.利用不饱和取代基的鉴别试验
具有不饱和取代基的巴比妥类药物，中国药典收载有司可巴比妥钠。
因其结构中含有丙烯基，分子中的不饱和键可与碘、溴或高锰酸钾作用，发生加成或氧化反应，而使碘、溴或高锰酸钾褪色。
1）与碘试液的反应取供试品加水溶解后，加碘试液所显棕黄色应在5min内消失。
司可巴比妥与溴试液，也可发生加成反应，使溴试液褪色。
2）与高锰酸钾反应含不饱和烃取代基的巴比妥类药物，具有还原性，在碱性溶液中与高锰酸钾反应，使紫色的高锰酸钾转变为棕色的二氧化锰。
2.利用芳环取代基的鉴别试验
1）硝化反应含芳香取代基的巴比妥类药物，与硝酸钾及硫酸共热，可发生硝化反应，生成黄色硝基化合物。
2）与硫酸-亚硝酸钠的反应苯巴比妥与硫酸—亚硝酸钠反应生成橙黄色产物，并随即转变为橙红色。
本反应确切的原理不清，可能为苯环上的亚硝基化反应。
此鉴别试验为中国药典收载的方法，可用于区别苯巴比妥和其它不含芳环取代基的巴比妥类药物。
3）与甲醛-硫酸的反应苯巴比妥与甲醛-硫酸反应，生成玫瑰红色产物。
此鉴别方法也为中国药典收载，可用于区别苯巴比妥和其它巴比妥类药物。
3.利用硫元素的鉴别试验
硫代巴比妥类分子结构中含有硫元素，如硫喷妥钠，可将其硫元素转变为无机硫离子，而显硫化物的反应。
如硫喷妥钠在氢氧化钠试液中与铅离子反应，生成白色沉淀；加热后，沉淀转变为黑色的硫化铅。
此鉴别试验可用于硫代巴比妥类与巴比妥类药物的区别。
1.3特殊杂质检查—苯巴比妥的特殊杂质检查
苯巴比妥的合成工艺为：
由以上合成工艺过程可以看出，苯巴比妥中的特殊杂质主要是合成中产生的中间体（Ⅰ）和（Ⅱ）以及副反应产物，常通过检查酸度、乙醇溶液的澄清度、有关物质及中性或碱性物质来加以控制（中国药典2010版二部）。
1.3.1酸度
酸度的检查主要是控制副产物苯基丙二酰脲。
苯基丙二酰脲是由于中间体（Ⅱ）的乙基化反应不完全，而与脲素缩合生成的。
因其分子中5位碳原子上的氢受相邻两羧基的影响，致使酸性比苯巴比妥强，能使甲基橙指示剂显红色。
检查方法为：
取本品0.2g，加水10ml，煮沸搅拌1min，放冷，滤过，取滤液5ml，加甲基橙指示剂1滴，不得显红色。
1.3.2乙醇溶液的澄清度
本项检查主要是控制苯巴比妥中乙醇不溶性杂质，利用苯巴比妥酸这些杂质在乙醇溶液中的溶解度比苯巴比妥小的特性进行检查。
检查方法为：
取本品1.0g，加乙醇5ml，加热回流3min，溶液应澄清。
1.3.3有关物质
取本品，加流动相溶解并稀释成每ml中含1mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1ml，置200ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
照高效液相色谱法（药典附录ⅤD）试验，用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
以乙腈-水（25:
75）为流动相，检测波长为220nm；理论塔板数按苯巴比妥峰计算不低于2500，苯巴比妥峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。
取对照溶液5μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的15%；精密量取供试品溶液与对照品溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积（0.5%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2倍（1.0%）。
1.3.4中性或碱性物质
中性或碱性物质是由中间体（I）形成的副产物2-苯基丁二酰胺、2-苯基丁二酰脲或分解产物等杂质，不溶于氢氧化钠试液但溶于乙醚；而苯巴比妥具有酸性，溶于氢氧化钠试液，利用这些杂质与苯巴比妥在氢氧化钠试液和乙醚中的溶解度不同，采用萃取重量法测定杂质含量。
检查方法为：
取本品1.0g，置分液漏斗中，加氢氧化钠试液10ml溶解后，加水5ml与乙醚25ml，振摇lmin，分取醚层，用水振摇洗涤3次，每次5ml，取醚液经干燥滤纸滤过，滤液置105℃恒重的蒸发皿中，蒸干，在105℃干燥1h，遗留残渣不得超过3mg。
1.4含量测定方法
1.4.1银量法
采用银量法测定本类药物及其制剂的含量，主要基于巴比妥类药物在适当的碱性溶液中，可与银离子定量成盐。
如苯巴比妥及其钠盐、异戊巴比妥及其钠盐以及它们的制剂，中国药典均采用银量法测定其含量。
在滴定过程中，巴比妥类药物首先形成可溶性一银盐，当被测定的巴比妥类药物完全形成一银盐后，稍过量的银离子就和巴比妥类药物形成难溶性的二银盐沉淀，使溶液变浑浊，以此指示滴定终点。
本法虽然操作简便，专属性强，巴比妥类药物的分解产物或其他一些可能存在的杂质不与硝酸银反应，但本法受温度影响较大，而且是以溶液的出现浑浊指示滴定终点的到达难于观察。
为了克服滴定过程中温度变化的影响和改善终点的观察，历版药典对测定方法进行了不断修订，本法首先用一定浓度丙酮作为溶剂，克服了温度变化的影响，但未解决终点观察问题，结果不够满意。
中国药典（1985年版）进行了修订，改用甲醇作溶剂，并用银-玻璃电极系统电位法指示终点，使本法获得明显改进，因此继续为2010年版药典沿用。
具体测定方法如下：
苯巴比妥及其钠盐的测定：
取本品约0.2g，精密称定，加甲醇40ml使溶解，再加新制的3％无水碳酸钠溶液15m1，照电位滴定法，用硝酸银滴定液（0.1mol/L）滴定。
每1ml硝酸银滴定液（0.1mol/L）相当于23.22mg的C12H12N2O3。
1.4.2溴量法
基于巴比妥类药物在5位取代基含有双键，其不饱和键可与溴定量地发生加成反应，可采用溴量法测定其含量。
中国药典（2010版）收载的司可巴比妥钠采用本法测定。
其测定原理可用下列反应式表示：
司可巴比妥钠的测定方法：
取本品约0.1g，精密称定，置250ml碘瓶中，加水10m1，振摇使溶解，精密加溴滴定液（0.05mol/L）25m1，再加盐酸5m1，立即密塞并振摇1min，在暗处静置15min后，注意微开瓶塞，加碘化钾试液10ml，立即密塞，摇匀后，用硫代硫酸纳滴定液（0.1mol/L）滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白试验校正。
每1ml溴滴定液（0.05mol/L）相当于13.01mg的C12H12N2NaO3。
1.4.3酸碱滴定法
巴比妥类药物的母核结构决定了该类药物呈弱酸性，可作为一元酸直接被标准碱溶液滴定，或在非水溶液中用强碱溶液直接滴定。
此法虽然未被中国药典收载，但也可用于本类药物的含量测定，常用的方法如下：
1.非水滴定法
巴比妥类药物在非水溶液中的酸性增强，用碱性滴定液滴定时，终点较为明显，可得到比较满意的结果。
测定时常用的有机溶剂有二甲基甲酰胺、甲醇、氯仿、丙酮、无水乙醇、苯、吡啶、甲醇-苯（15∶85）、乙醇-氯仿（1∶10）等；常用的滴定液有甲醇钾（钠）的甲醇（或乙醇）溶液、氢氧化四丁基铵的氯苯溶液等；常用的指示剂为麝香草酚蓝等，也可用玻璃-甘汞电极电位法指示终点。
2.在水-乙醇混合溶剂中的滴定法
本类药物在水中的溶解度较小，故滴定时多在醇溶液或含水的醇溶液中进行，这样可避免反应中产生的弱酸盐易于水解而影响滴定终点。
常以麝香草酚酞为指示剂，滴定至谈蓝色为终点。
测定方法：
取本品约0.5g，精密称定，加乙醇20m1溶解后，加麝香草酚酞指示剂6滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定，并将滴定结果用空白试验校正。
每1m1氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当于22.63mg的C11H18N2O3。
本法操作简便，但终点较难判断，为了便于确定终点，可采用空白对照。
由于操作过程中吸收二氧化碳会使终点的淡蓝色较易褪去，采用空白对照也难以克服。
因此可采用电位法指示终点。
3.在胶束水溶液中进行的滴定法
本法是在有机表面活性剂的胶束水溶液中进行滴定，用指示剂或电位法指示终点。
因表面活性剂能改变巴比妥药物的离解平衡，使药物的Ka增大，即使巴比妥药物酸性增强，因此使滴定终点变化明显。
常用的有机表面活性剂有：
溴化十六烷基三甲基苄铵（CTMA）和氯化四癸基二甲基苄铵（TDBA）。
采用本法测定测定巴比妥和苯巴比妥的结果的相对标准偏差（RSD）均小于0.3％，并优于在水-乙醇混合溶液中的滴定法。
1.4.4紫外分光光度法
巴比妥类药物因其在酸性介质中几乎不电离，紫外吸收不明显。
但在碱性介质中电离为具有紫外吸收特征的结构，故可采用紫外分光光度法测定其含量。
本法灵敏度高，专属性强，广泛应用于巴比妥类药物的原料及其制剂的含量测定，以及固体制剂的溶出度和含量均匀度检查，也常用于巴比妥药物的体内分析检测。
1.直接紫外分光光度法
本法是将样品溶解后，根据溶液的pH值，在最大吸收波长（λmax）处，直接测定对照品溶液和供试品溶液的吸收度，再计算药物的含量。
中国药典2010版对注射用硫喷妥钠的含量测定采用方法。
2.经提取分离后的紫外分光光度法
根据巴比妥药物具有酸性，在氯仿等有机溶剂中易溶，而其钠盐在水中易溶的特点。
测定时取供试液适量，加酸酸化后，用氯仿提取巴比妥类药物。
氯仿提取液加pH7.2~7.5的缓冲溶液（水10~25ml，加碳酸氢钠lg，10％盐酸液3~4滴），振摇，分离弃去水相缓冲液层。
再用0.45mol/L氢氧化钠溶液提取氯仿层中的巴比妥类药物，将碱提取液调节适宜pH，然后选用相应的吸收波长进行测定。
本法可消除干扰物质对巴比妥类药物进行测定的影响。
3.差示紫外分光光度法
本法是利用巴比妥类药物在不同pH值溶液中的电离级数不同，从而产生紫外吸收光谱的情况不同，以此为依据设计的测定方法。
一般有以下两种测定形式：
1）在波长240nm处，测定pH10和pH2两种溶液的吸收度之差（△A值）
巴比妥类药物在pH2的溶液中不电离，故在240nm处几乎无吸收，如这时有吸收则为杂质吸收。
因此，可利用巴比妥类药物在两种pH值溶液中的吸收度之差消除杂质吸收的干扰。
2）在波长260nm处，测定pH10和强碱溶液的吸收度之差（由于两种溶液在260nm处的吸收度的差值最大，灵敏度高，故不采用255nm波长处的吸收度之差）
pH10的溶液可用硼酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液或0.1％~1％的氨试液配制；pH2的溶液可用盐酸或硫酸配制。
被测巴比妥类药物溶液的浓度，在两种不同pH值的溶液中必须相同，应为1mg/100ml~2.5mg/100ml。
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（南京中医药大学 姚卫峰）
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