发酵工程.docx

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发酵工程

第一章

1、生物技术：

有时称生物工程，指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，利用生物体或体系或它们的衍生物来制造人类所需要的各种产品或达到某种目的的一门新兴的综合性学科。

2、五大体系：

生化工程、细胞工程、酶工程、基因工程、发酵工程。

3、发酵工程：

是指包括工程微生物在内的某些微生物或动植物细胞通过现代工程技术手段，生产各种特定的有用物质，或者把微生物直接用于某些工业化生产的技术。

4、发酵：

利用微生物在有氧或无氧的条件下，大规模培养微生物菌体或其代谢产物的过程。

发酵中的5次转折？

答：

第一次，纯培养技术；第二次，深层通风培养的好气性发酵过程的建立；第三次，代谢控制发酵技术的出现；第四次，发酵原料的转变；第五次，DNA重组技术的出现。

发酵工程应用？

答：

食品：

加工、饮料、乳制品、添加剂。

医药：

抗生素、氨基酸、维生素、疫苗、酶。

轻工业：

淀粉酶、果胶酶。

化工能源：

氨气、氢气、微生物电池。

农业：

农药、肥料、除草剂、肥料、食用菌。

环境保护：

污水处理、空气净化。

冶金：

微生物浸矿。

高新技术：

DNA芯片。

第二章

1、微生物资源的分离：

采样、富集、分离、菌株的筛选、性能鉴定

2、富集培养：

有称为增值培养，利用不同微生物生长对环境和培养基的特殊要求设计选择性培养基，创造有利生长条件，使目的微生物在最适环境中大量繁殖，由原来自然条件下的劣势种变为人工条件下的优势种，以利于分离。

3、自然选育：

不经过人工处理，利用微生物的自然突变选育的过程。

4、诱变育种：

利用物理或化学诱变剂处理微生物细胞群提高基因突变频率，然后再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优势菌种的育种方法。

（理论基础是基因突变）

5、杂交育种：

指两个基因型不同的菌种通过接合使遗传物质重新组合的过程。

6、原生质体融合：

指用酶解作用将两个亲株的细胞壁去除，在高渗作用下释放出原生质，将它们混合，在助溶剂或电场作用下使它们互相凝集，通过细胞质融合促使两套基因组之间的接触、交换、遗传重组，在适宜的条件下使细胞壁再生，在再生的细胞中获得重组体的过程。

（化学助溶剂：

聚乙二醇，生物助溶剂：

仙台病毒）

7、基因工程育种：

将外源DNA通过重组体导入受体细胞，使其在受体细胞内复制、转录、翻译、表达的技术。

也叫DNA体外重组技术。

试述菌种分离的几个步骤？

答：

出发菌

富集培养要通过哪几方面进行？

答：

富集培养：

有称为增值培养，利用不同微生物生长对环境和培养基的特殊要求设计选择性培养基，创造有利生长条件，使目的微生物在最适环境中大量繁殖，由原来自然条件下的劣势种变为人工条件下的优势种，以利于分离。

（1）样品预处理：

高温高压，加入抗生素

（2）控制培养基的营养成分（3）控制培养条件

自然选育的概念以及常有方法有哪几种？

答：

自然选育：

不经过人工处理，利用微生物的自然突变选育的过程。

方法：

通过表现形态淘汰不良菌株；通过目的代谢产物的产量考察；通过遗传基因型的纯度；传代的稳定性。

什么是诱变育种？

其程序如何？

影响诱变育种的因素？

答：

诱变育种：

利用物理或化学诱变剂处理微生物细胞群提高基因突变频率，然后再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优势菌种的育种方法。

（理论基础是基因突变）

程序：

（1）出发菌株的选择（目标产物的合成能力强；性能好；对诱变剂敏感）

（2）诱变剂的选择与使用，物理诱变剂：

各种射线；化学诱变剂：

烷化剂，碱基类似物，吖啶类似物；生物诱变剂：

噬菌体，转座子。

诱变方法：

单一诱变剂处理；复合诱变剂处理（3）

各种突变株的筛选与鉴定：

摇瓶筛选法，平板菌落筛选法，突变株性能检测。

影响因素：

（1）微生物诱变处理时的外部环境条件（温度、氧气、酸碱度、水）

（2）出发株（生产上使用的菌株）的选择（3）合适的诱变剂与剂量（4）出发株的生理状态（5）诱变效应的测定方法。

哪些性能的菌种适合工业化生产？

答：

（1）生长快，发酵周期短；

（2）对培养基和营养要求低（3）孢子多，易培养繁殖（4）无色素，无毒素，其他代谢产物少或不产生（5）有较高的培养发酵温度，抗污染。

什么是原生质体融合，它有什么特点，操作程序如何？

答：

原生质体融合：

指用酶解作用将两个亲株的细胞壁去除，在高渗作用下释放出原生质，将它们混合，在助溶剂或电场作用下使它们互相凝集，通过细胞质融合促使两套基因组之间的接触、交换、遗传重组，在适宜的条件下使细胞壁再生，在再生的细胞中获得重组体的过程。

特点：

（1）受接合型或致育性限制小

（2）重组的频率高（3）遗传物质的传递更为完整（4）提高了筛选的效率（5）重组体的种类较多（6）诱变频率高。

程序：

（1）原生质体制备

（2）原生质体融合（3）原生质体再生（4）融合子的筛选

微生物菌种有哪些常规的保藏方法？

答：

斜面保藏法，穿刺保藏法，沙土管干燥保藏法，真空冷冻干燥保藏法，体温保藏法。

第三章培养基的制备与种子的扩大培养

按发酵生产用途可将培养基分为哪几种?

各有要求？

答：

可以分为三种类型：

孢子培养基，种子培养基和发酵培养基。

1、孢子培养基：

要富含有机氮源，可加入少量的无机盐类，并供给必要的生长因子和微量元素。

2、种子培养基的要求：

1）营养要丰富，全面，菌体容易吸收利用；2）PH值和渗透压要适当；3）斜面，药瓶，种子罐的营养要区别，最后一级要求接近发酵培养基，使培养的种子能叫魁岸适应发酵罐内的环境。

3、发酵培养基的要求：

1）含有一定量细胞生长所需的营养物质，通常是一些速效营养；2）含有合成产物所需的特定成分.如：

前提，促进剂等；3）各成分间的配比要适当；4）PH值，渗透压等要适当。

设计培养基配方应遵循的原则是什么？

答：

1.根据微生物的类型选择培养基的类型；

2.在考虑C、N源品种时应注意速效，长效相交配，发挥各自的优势，取长补短；

3.选用适当的C、N源的比例；

4.生理酸性盐，生理碱性与PH缓冲剂的搭配，这样才能保证PH值不能超过所允许的范围；5.培养基各成分的用量要根据实验结果而定；

6.也应该考虑来源，价格，对加工的影响等因素，确保生产的正常进行或降低生产成本。

影响种子质量的因素有哪些？

答：

1、培养基

2、种龄和接种量1%~2%。

接种量过少会延长发酵周期，过多会增加发酵成本，菌种会将代谢产物进入，影响发酵。

3、培养条件：

1）温度：

过低或过高会影响酶活性；2）不同微生物PH值不同；3）通气，大部分菌种为耗氧菌，适时搅拌；4）染菌控制：

培养设备严格消毒。

4、种子罐的级数：

一般为一级，二级和三级，最多不超过四级，级数越少越好，若级数过多会发生变异。

简述种子制备的工艺流程及工艺要点

答：

流程：

保藏——斜面——一种级种子摇床培养——二级种子罐培养——三级种子罐培养——发酵罐

工艺要点：

1、接种方法：

常规接种法、火焰接种法、管道压差法；

2、接种量：

依菌种生长速度而定，一般为1%~2%；

3、接种龄：

处于对数生长期（该期生长代谢旺，抗菌能力强）。

根据所学代谢调控理论说明那个在发酵过程中如何认为控制微生物的代谢。

答：

1、发酵条件的控制：

1）控制各种发酵工艺条件：

温度，PH，溶氧，CO2,泡沫，转速等。

（自己延伸）2）使用诱导物；3）添加生物合成的前体；4）控制培养基的营养成分组成和浓度配比；

2、改变细胞透性：

1）限制培养基中生物素的浓度来控制细胞膜中脂质的合成；2）细胞生长期加入青霉素抑制细胞壁中肽聚糖的合成；3）加入表面活性剂，将脂类从细胞壁中溶解，达到使细胞壁疏松，增加细胞壁的通透性；4）控制锰离子和锌离子的农大，干扰细胞膜或细胞壁的形成。

3、菌种遗传特性的改变：

代谢控制育种，培育出高产菌株。

初级代谢产物：

微生物产生的对自身生长繁殖必须的物质。

初级代谢：

产生初级代谢产物的代谢体系。

次级代谢产物：

微生物产生的对微生物题本身不是必须的一些物质，通常在微生物生长后期合成。

次级代谢：

通常把一初级代谢产物为前提，合成刺次级代谢产物的代谢体系。

微生物代谢的自我调节方式：

通道、通量、限制基质的有形接近。

培养基营养：

1、C源：

糖类，油脂，有机酸，烃类；

2、N源：

有机氮源（黄豆饼粉，花生饼粉，鱼粉，麸皮，蛋白胨等属于长效氮源，尿素，属于速效氮源）；无机氮源（硫酸铵，氨水，NH4CL，硝酸盐）；

3、无机盐与微量元素；

4、生长因子（维生素，氨基酸，嘌呤，嘧啶等）；

5、水；

6，促进剂，抑制剂，前体。

前体：

加入培养基后能直接被微生物在生物合成中结合到产物中去提高产量的物质。

促进剂：

一类刺激因子，他们或者影响微生物的正常代谢，或者可以促进中间物的积累或提高次级代谢产物的产量。

抑制剂：

一只某些不需要产物的形成，同时次级有益于积累代谢产物的途径，促使目标产品产量的提高。

微生物的代谢类型：

初级代谢产物，次级代谢产物。

第五章发酵过程及工艺控制

1、发酵过程的类型

（1）据微生物种类分：

好氧发酵（如青霉素，谷氨酸）和厌氧发酵（如酒精、乳酸、丙酮）

（2）按培养基性状分：

液体发酵和固体发酵（如白酒、醋、酱）

（3）按终产品分：

微生物菌体发酵、微生物酶发酵、代谢物发酵、转化发酵、生物工程发酵

（4）按发酵设备分：

敞口发酵、密闭发酵、浅盘发酵、深层发酵

（5）按操作方式分：

分批发酵、连续发酵、补料分批发酵

2、发酵过程按操作方式分为哪三种？

各有什么优缺点？

A、分批发酵：

一次补料、一次接种、一次收获的发酵方式

优点：

不易产生污染

缺点：

设备的利用率低

B、连续发酵：

发酵过程中以一定的速率向发酵罐内连续加入培养基，同时从相同的速度排出含有产品的培养基液从而使发酵罐内发酵液总量保持恒定的一种发酵方式

优点：

提供了一个相对恒定的环境使微生物保持高速生长，有利于保持产品的产量和质量。

有利于实现自动控制。

减少了分批培养中每次清洗、装料、消毒、接种、放罐的时间，提高了生产效率。

缺点：

微生物的发酵时间长，多次传代会使菌种发生变异。

新旧培养基不容易完全混合，会影响培养基的利用。

B、补料分批发酵：

在微生物的分批培养基过程中向生物反应器中间隙或连续补加一种或一种以上特定的限制性底物，反应结束后一次性排出培养液的过程。

优点：

与分批培养相比，能使基质保持在较低水平，解除或减少了底物与产物的抑制与阻碍作用。

与连续培养相比，不会产生菌种变异、原料污染等问题。

缺点：

设备昂贵，操作难度大。

2、试述发酵过程中的影响因素有哪些？

它们如何影响发酵过程？

我们对其如何控制？

（1）温度对发酵的影响及调控

A影响发酵温度的因素：

发酵热（发酵过程中释放出的净热量）

发酵热的形成：

生物热（主要）、搅拌热、蒸发热、显热（忽略）、辐射热

Q发酵热=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q显-Q辐射

B影响：

对微生物细胞的生长产生影响;

影响产物的和成

C最适温度的选择：

参考生长于合成的主次进行选择;

参考结合其他发酵条件进行选择（溶解氧、培养的成分和浓度等）

（2）pH对发酵的影响及调控

影响：

a、对微生物生长产生影响。

b、对产物合成产生影响（方向、途径）

引起发酵液pH变化的因素：

a、微生物的代谢特性（在一定pH范围内，微生物有自我调节能力）；b、培养基的成分；c、发酵条件（通气和搅拌）

最适pH的选择

a、调节培养基的原始pH或加入缓冲液制成缓冲液能力强、pH变化不大的培养基；

b、在发酵过程中加弱碱、弱酸来调节pH；

c、控制发酵液中各营养物的配比，特别是C、N比

d、通过补料调节pH值

（3）氧气对发酵的影响及调控

影响微生物需氧的因素：

菌种的特性、培养基的浓度和成分、菌齡、培养条件、有毒物质

影响供氧的因素：

搅拌、通气量、发酵液的物理性质

发酵过程中溶氧的控制：

从供氧方面考虑：

a、提高罐压;b、增加通气量；c、通入纯氧；d、增加搅拌功率。

从需氧方面考虑：

a、降低培养温度;b、补水稀释培养液

（4）二氧化碳对发酵的影响及调控

影响：

对微生物的生长的影响：

有刺激或抑制的作用，除少数菌如环状芽孢杆菌

影响菌体的形态

影响发酵产物的合成

控制：

采用通气搅拌的方法控制二氧化碳的浓度

使用酸碱中和排出二氧化碳

补料控制二氧化碳的浓度

（5）泡沫对发酵的影响及调控

影响：

a、增加了菌群的不均一性和生长的异步性；b、造成了大量的逃液，减少发酵液的体积；c、由于泡沫的冒顶、逃液增加了杂菌污染机会；d、使用消泡剂增大了提取工艺的难度；e、降低了装料系数，因而降低了生产能力

泡沫产生的原因：

a、通气搅拌；b、微生物呼吸代谢产生的一些气体（二氧化碳、氨气等）；c、培养基的原理性质（气泡：

玉米粉＞花生粉＞黄豆粉）

控制：

预防泡沫的形成：

a、选择不产生泡沫的培养基；b、选择适宜的灭菌条件；c、选育不产生泡沫的菌株。

控制泡沫的方法：

a、机械消泡；b、消泡剂消泡（天然消泡剂：

玉米油、豆油。

化学消泡剂：

泡敌）

概念

呼吸强度：

单位质量的细胞在单位时间内消耗氧的量

摄氧率：

单位体积培养液在单位时间内消耗氧的量，取决于微生物的呼吸强度和单位体积内菌的浓度

第六章、发酵工艺设备

一、发酵设备的类型

1.固体发酵设备2、液体发酵设备（厌氧发酵设备和好氧发酵设备）

二、好氧发酵设备分哪几种类型？

个有和特点？

1、机械搅拌式发酵罐（通用式）

特点：

罐内装有搅拌器

2、外部液体搅拌式发酵罐

特点：

没有机械搅拌装置，是利用罐外的循环泵搅动发酵液，适用于粗放型的发酵

3、空气喷射提升式发酵罐

特点：

没有机械搅拌装置，通过压缩空气使液体和气体混合，是发酵液流动起来，适用于高位塔式的发酵罐

三、简述通用式发酵罐的基本结构和特点？

1、通用式发酵罐的基本条件

a、罐体的各部都要有一定的比例；b、发酵罐要能承受一定的压力；c、发酵罐的搅拌通风装置能使气液充分混合，实现传质、传热的作用，保证微生物发酵过程中需要的溶氧量；d、发酵罐应有足够的冷却面积；e、发酵罐应尽量减少死角，避免藏污积垢，既便于清洗又能保证灭菌彻底，防止污染；f、搅拌器的轴封要严密，以减少泄露

2、发酵罐的结构

（1）罐体

要求：

密封性好、耐压性好

形状：

圆柱体，上下都是碟形

材料：

不锈钢或碳钢

高径比：

2.5：

4

罐顶：

进料口、接种口、排气口、压力表、溶氧电极、pH电极

罐身：

冷却水进口（下进上出）、温度计、空气进口

罐底：

出料口（偏向一侧）

（2）搅拌器

作用：

a、打碎空气气泡，增加气液接触面积；b、为了使发酵液充分混合，液体中的固形物保持悬浮状态

搅拌叶：

平叶、弯叶、箭叶。

叶片数量一般为6个，分三组

（3）挡板

一般为4-6块

作用：

消除涡流、增加溶氧

（4）消泡器

作用：

打碎泡沫

形状：

锯齿状、耙状、梳状

（5）轴承与连轴器

（6）变速装置

改变搅拌速度

（7）空气分布装置

作用：

将无菌空气引入发酵液中，并使它分布均匀

分：

单管和环状

（8）轴封

作用：

密封，防止泄露或杂菌污染

（9）换热装置

主要是冷却管，对小发酵罐：

夹套或夹层；对大发酵罐：

内部有蛇形管或列管

第七章发酵过程的灭菌技术

1、灭菌方法有哪些？

答：

1）物理方法：

加热灭菌、射线灭菌、过滤灭菌

2）化学方法：

甲醛、硫磺、84消毒灭菌

2、灭菌的操作的方式有：

分批灭菌和连续灭菌。

3、连续灭菌的流程与操作要点有什么？

答：

1）灭菌流程：

配料罐——连消泵——蒸汽——加热塔——维持罐——冷却水

2）操作要点：

用70度蒸汽管配料罐中预热

加热塔中加热

保温

喷淋冷却

4、空气过滤除菌的工艺流程与操作要求：

答：

1）工艺流程：

采气——前置过滤器——空气压缩机——储气管——冷却器——油水分离器——加热器——过滤器——发酵罐

2）操作要求：

采气：

高空20~30米

前置过滤器：

粗过滤器，除尘保护空压机

空气压缩机：

压缩空气

储气管：

储存空气

冷却器：

降低空气温度

油水分离器：

空压机润滑油

加热器：

降低湿度，保持空干燥

过滤器：

除菌和杂志

5、提高除菌效果的主要措施有哪些？

答：

1）减少进口空气的含菌数；

加强生产场地的卫生管理，减少空气的含菌数

正确选择通风口，压缩空气站应在生产车间的上风口

提高进口空气的位置

加强空气压缩前的预处理

2）设计安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的除菌介质

3）选用合理的空气预处理设备的相对湿度，以起到除油除水与杂质的目的

4）降低进入空气过滤器空气的相对湿度，保证过滤介质在干燥状态下工作

5）提高进入过滤空气的温度，降低其湿度

第八章下游工程的加工

1、下游加工过程：

只从发酵液中分离纯化目的产品的工程

2、下游加工过程的特点：

！

）含量低

2）目标产物不稳定

3）投入高产率低

4）排放废液存在环保与生物安全问题

3、下游工程有哪些流程?

答：

1）发酵液的预处理与固液分离

2）提取

3）精制

4）成品加工

第九章发酵工程生产实例

1、简述谷氨酸的生产流程：

母种——斜面种子培养——摇瓶种子培养——种子罐——原料处理——发酵培养——下游加工处理

2、简述谷氨酸发酵的操作要点及工艺控制

1）发酵初期：

菌体生长慢

2）2~4H后：

进入对数生长期。

加尿素；PH=7.5~8.0；T=32~35

3）12H后：

PH=7.2~7.4；T=36~38；加尿素：

大量通气

4）发酵后期：

减少加尿素：

及时放罐

3、青霉素生产的工艺控制要点有哪些？

答：

1）PH=6.4~6.6；

2）T=25~268；

3）加葡萄糖：

4）大量通气

5）加尿素、氨水、硫酸铵（0.05%）

6）加前体