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脂肪酶电子克隆

灵芝脂肪酶基因的电子克隆及生物信息学特性分析

摘要：

利用生物信息学技术和网络生物信息数据资源EST数据库组装延伸EST序列，以米曲菌的基因序列为种子模版，并采用现代电子基因克隆的方法得到灵芝脂肪酶的cDNA序列，从而获得cDNA的方法，对灵芝脂肪酶的结构、表达和功能进行分析；电子克隆获得的灵芝脂肪酶cDNA基因长1105bp，包括可编码307个氨基酸的序列，该蛋白含有信号肽，是一种分泌蛋白，同源比对分析显示该脂肪酶基因编码的氨基酸序列与污叉丝孔菌、双孢菇和木耳等蘑菇类高等真菌中的脂肪酶基因所编码的氨基酸序列高度同源。

研究结果为该基因的实验克隆奠定基础。

关键字：

灵芝；脂肪酶；电子克隆；NCBI；BLAST；基因；蛋白；生物信息学

脂肪酶是一类特殊的水解酶且具有多功能高效催化能力的酶，脂肪酶又称三酰基甘油水解酶，脂肪酶有许多来源广泛存在于动植物中，具有高效的催化能力，其水解反应条件温和、副产物少，可催化一些自然界和生物体中的底物油脂。

脂肪酶由多个氨基酸构成，就我们所知的脂肪酶中大部分为其无数个氨基酸组成的脂肪酶基本上只有一条多肽链，脂肪酶催化分解的活性由自身的活性位点的结合位置与其自身蛋白质的结构决定。

自然界中，脂肪酶存在于绝大部分生物，而动植物和微生物尤甚。

但其催化特点也不同，对于其底物、空间位置、以及其自身特异性的反应都不一样，影响其催化速度、最适催化活性以及副产物的形成或其副产物的多少等[1-2]。

反应类型大致分为脂肪酶的酯交换反应、水解油脂反应和脂肪酸的酯化反应[3]。

在细菌、真菌和酵母等微生物中，脂肪酶的存在却更加丰富和广泛。

与动植物进行比较，大部分微生物繁殖周期短更容易产生变异，正是利用了微生物的这一特点控制生产发酵过程中的pH、温度、以及生长过程中代谢产物对其的抑制和促进作用，提取工业需要脂肪酶。

脂肪酶在反应体系的位置以及其自身生理特点决定了脂肪酶活性的高效性，如果脂肪酶存在于在油水界面上，那么它就具有最大的催化活力，通过这一特性我们可以用来区分脂肪酶和酯酶。

同时脂肪酶本身又是一种活性蛋白质，因此一切能影响蛋白质活性的因素都能影响到脂肪酶的活性[4-6]。

在植物中脂肪酶的作用：

脂肪酶存在植物中时，能通过其分解能力把其分解对象分解成植物生长、代谢所需要的能量，其分解成的糖类能为种子的生长提供源源不断的能量以及所需物质。

在动物体内脂肪酶的作用：

在动物体内也存在脂肪酶，主要分布在高等动物中的脂肪组织、胰脏还有少部分存在于肠道中。

它能提给胰脂肪酶帮助，增加胰脂肪酶对脂肪进行消化，以增加动物体内的胰脂肪酶[7-8]。

脂肪酶可作用于甘油三酯的酯键，是一种特殊的酯键水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯，同时也能催化酯合成和酯交换反应[8]。

脂肪酶这种糖蛋白，大部分的脂肪酶亲疏水性基本平衡，而真正具有活性基本上都是位于其疏水本部的一端，通过其活性位点与底物分子的接触激发其活性，在其之上激发起活性的方式也不同，直接结合在脂肪酶酶活性位点上或通过近接的方式与其目标靶物结合实现其作用。

灵芝是珍贵的中草药，一直有人间仙草的美称，具有很高的药用价值，它能提高人体的免疫系统，提高对疾病免疫能力，含有多种氨基酸、维生素，不仅对很多生理疾病有很好的药效，还能起到安神的作用等。

灵芝的各方面效用和脂肪酶在工业中占有举足轻重的地位，不同种类的灵芝和位于灵芝上不同部位的组织结构、不同来源的脂肪酶，他们功能、特性都有很重要的意义。

虽然有很多对研究灵芝有很多，但有关于灵芝脂肪酶蛋白基因序列的报道尚未发现。

本研究以真菌类中的米曲菌的cDNA片段序列作为种子序列，利用权威网站提供的数据以及可以对DNA进行分析的软件，克隆灵芝脂肪酶蛋白，并利用生物信息学相关软件对其进行生物信息学综合分析，为进一步研究灵芝中脂肪酶调节作用提供理论基础。

1灵芝脂肪酶序列获取的材料与分析方法

1.1灵芝脂肪酶基因的电子克隆方法

我们所需的数据主要采用NCBI提供的生物技术信息中心（http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/），

（1）从NCBI数据库中搜索FUNGILIPASE得到一系列真菌的cDNA或者氨基酸序列，利用NCBI上的BLAST和TBLASTN与灵芝的基因进行比较分析、筛选得到不同菌的蛋白序列再一一进行比对构建种子库；

（2）从中筛选出相似度最高的完整基因序列，挑取我们所需的基因片段，以FASTA的格式保存文件；（3）利用BioEditsequencealignmenteditor进行基因拼接得到的contig-0在NCBI中进行ORFfinger与核酸、蛋白库作同源比较，判定是否存在预期功能的基因。

最后确定为新的基因片段。

1.2灵芝脂肪酶蛋白的生物信息学分析

生物信息学利用现代计算机技术分析、推测生物信息，综合应用生物学、统计学与生物学等方法，以DNA序列为分析对象，对其结构进行模拟和完善、对其功能进行分析与预测。

充分利用网络强大的资源设计引物得到需要的功能部分进行药物设计体现其价值[9]。

1.2.1基因蛋白生物学分析方法

利用不同网站提供的数据对灵芝脂肪酶的蛋白进行分析。

基因序列分析：

利用ORFfinder（http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）在线工具预测其开放阅读框。

并用软件DNA2.0翻译其氨基酸序列。

蛋白质理化性质分析：

利用ExPASy网站的Protparam（http:

//web.expasy.org/protparam/）测出其蛋白质分子。

蛋白质的亲、疏水性分析：

对灵芝蛋白的亲、疏水性可以使用ExPASy网站在线工作预测软件ProtScale进行计算蛋白质的亲、疏水性分析，从得出的图我们可以直观的看出其亲疏水性。

二级结构分析：

（http:

//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?

page=npsa_gor4.html）使用GOR4分析其二级结构。

亚细胞定位分析：

以ExPASy网站的PSORT（http:

//psort.hgc.jp/form.html）进行亚细胞定位分析。

跨膜区结构分析：

TMHMM-2.0（http:

//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）利用在线工具分析跨膜区。

预测信号肽分析：

通过SignalP（http:

//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行分析其信号肽。

三级结构分析：

通过SWISS-MODEL提供的免费在线自动建模的服务，该网站是利用了同源建模的方法实现对一段未知序列的三级结构的预测。

并通过软件pymol丰富该三级结构，同时分析出其活性位点结构。

（http:

//swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?

func=modelling_simple1）

进化树分析：

通过利用软件clustalx1.83和MEGA4进行进化树分析。

2结果与分析

2.1灵芝脂肪酶的拼接结果

2.1.1以米曲霉的脂肪基因作为探针

以米曲霉的脂肪基因作为探针在灵芝EST序列数据库中进行BLAST搜索后，得到有意义的同源性序列34条拼接得到有意义片段contig-0。

再一次一得到的拼接序列作为探针进行精度比对，得到的31条同源序列如图1。

米曲菌脂肪酶基因：

>gi|157741874|gb|ABV69592.1|lipase[Thermomyceslanuginosus]GenBank:

ABV69592.1

MRSSLVLFFLSAWTALARPVRRAVPQDLLDQFELFSQYSAAAYCAANNHAPVGSDVTCSENVCPEVDAADATFLYSFEDSGLGDVTGLLALDNTNKLIVLSFRGSRSVENWIANLAADLTEISDICSGCEGHVGFVTSWRSVADTIREQVQNAVNEHPDYRVVFTGHSLGGALATIAAAALRGNGYNIDVFSYGAPRVGNRAFAEFLTAQTGGTLYRITHTNDIVPRLPPRDWGYSHSSPEYWVTSGNDVPVTANDITVVEGIDSTDGNNQGNIPDIPSHLWYFGPISECD

2.1.2对EST片段进行拼接及开放读码框的确定

将BLASTN得到的31条EST序列保存在FASTA文件中（图1），利用软件BIOEdit电子克隆拼接获得了1个最终长度为1105bp的重叠群在BIOEdit拼接出的重叠群conting-0,并利用NCBI中提供的ORFFinder软件对该序列进行开放阅读框预测，发现在19～942bp之间存在1个最大的开放阅读框，可编码307个氨基酸，且含有起始密码子ATG和终止密码子TAG。

图1以米曲霉的脂肪酶基因作为基础重复操作探针在灵芝EST序列数据库结果

表1对图1的cDNA序列进行分析

源序列

拼接片段

gi|366339064|gb|HO745265.1

gi|366363482|gb|HO745979.1

gi|366328069|gb|HO718003.1

gi|366389390|gb|HO715038.1

gi|366382003|gb|HO717329.1

gi|366386157|gb|HO744248.1

gi|366375561|gb|HO713496.1

gi|366391723|gb|HO726283.1

gi|366391723|gb|HO726283.1

gi|366358332|gb|HO718942.1

gi|366385530|gb|HO744243.1

gi|366382637|gb|HO717531.1

gi|366327253|gb|HO717942.1

gi|366362316|gb|HO740569.1

gi|366323443|gb|HO711790.1

gi|366381393|gb|HO717198.1

gi|366336524|gb|HO715150.1

gi|366347265|gb|HO742835.1

gi|366327254|gb|HO717943.1

gi|366390836|gb|HO726066.1

gi|366367137|gb|HO743863.1

gi|366388464|gb|HO744981.1

gi|366360849|gb|HO719226.1

gi|366390803|gb|HO726033.1

gi|366390803|gb|HO726033.1

gi|366324754|gb|HO741948.1

gi|366391253|gb|HO726144.1

gi|366339658|gb|HO745642.1

gi|366362653|gb|HO716082.1

gi|366328068|gb|HO718002.1

4

777

1

794

8

816

4

890

5

890

240

964

250

1075

174

1094

257

1097

266

1116

473

1144

90

718

112

891

30

960

41

930

1

971

28

970

28

968

36

970

42

970

45

971

66

742

87

800

161

900

176

960

321

972

345

976

345

971

347

967

844

970

2.1.3电子克隆的灵芝脂肪酶基因cDNA序列

通过以米曲霉的脂肪酶基因作为探针，利用NCBI中的BLAST工具搜索灵芝EST数据库，得到与探针序列同源性较高的一系列灵芝EST序列。

然后利用BioEdit软件进行拼接，再以拼接好的contig基因作为新探针，再次利用BLAST工具进行比对搜索，直到新的EST无法继续延伸。

从而生成最后新的基因序列，此EST为我们所要的目的基因。

2.2蛋白质分析结果

2.2.1基因序列分析

利用ORFfinder（http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/）在线工具预测其开放阅读框（图2）;并用软件Prime5翻译其氨基酸序列。

电子克隆的灵芝脂肪酶基因cDNA序列：

图2克隆出灵芝脂肪酶cDNA序列的ORF分析

注：

atg为其起始密码子，tga为终止密码子，其之间为拼接所得氨基酸序列，可以直观的看出每个氨基酸对应的碱基。

图3序列开放阅读框预测结果

利用NCBI上的BLAST的http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi可得到的推测灵芝脂肪酶的基因的同源性很高（图4）。

图4灵芝脂肪酶基因比对

2.2.2蛋白的理化性质分析

蛋白质的疏水性分析利用ExPASy网站的ProtScale在线分析;等电点和分子量计算采用ComputePI/MWtool分析。

表2灵芝脂肪酶酶蛋白氨基酸组成

氨基酸比例（%）

氨基酸比例（%）

氨基酸比例（%）

氨基酸比例（%）

Ala（A）11.2

Arg（R）4.7

Asn（N）5.0

Asp（D）6.1

Cys（C）2.0

Gln（Q）4.7

Glu（E）2.0

Gly（G）7.8

His（H）2.8

Ile（I）4.7

Leu（L）8.7

Lys（K）2.5

Met（M）1.1

Phe（F）3.1

Pro（P）7.0

Ser（S）7.8

Thr（T）4.7

Trp（W）2.2

Tyr（Y）2.8

Val（V）8.9

由表可知氨基酸中含量较高的是Ala（A）含11.2%与Val（V）含8.9%，含量较低的是Cys（C）和Glu（E）均为2.0%。

利用Protparam软件对蛋白质进行分析，可以测出其相对分子质量为38482.5，等电点为6.35，其分子表达式为C1175H2661N481O507S11，含有20种基本氨基酸，有29个的带负电荷的残留物（Asp+谷胺酸）；有26个数量的带正电的残留物（Arg+赖氨酸），该蛋白质水溶液在280nm处所有成对的半胱氨酸形成半胱氨酸吸光系数为59275，所有半胱氨酸藏残留减少吸光系数58900。

该蛋白的不稳定系数为41.51，为不稳定蛋白。

脂肪系数为89.39，平均总亲水性为－0．047[10]。

表3蛋白质分子分析

项目

数值

相对分子质量

等电点（PI）

脂肪指数

平均总亲水性

吸光系数（所有转化）

吸光系数

38482.5

6.35

89.39

-0.047

59275

58900

亲水性分析：

由（图5）我们可以看出图纹波动较为平衡，表明该蛋白总体上亲水性和疏水性比较平衡。

图5蛋白亲水性

亚细胞定位、跨膜区和前导肽分析利用软件SubLoc1.0对拼接出的灵芝脂肪酶分析，对灵芝脂肪酶氨基酸跨膜使用TMHMM在线预测工具对灵芝脂肪酶的氨基酸序列进行跨膜分析，在1.0处为细胞膜外分界线，0是细胞膜内，本研究的脂肪酶在此范围内并无发现跨膜结构，其主要是胞内活动，无细胞质之外缺少关联。

其结果是表明灵芝脂肪酶蛋白不存在跨膜区（图6）[11]。

图6蛋白跨膜结构预测

2.2.3信号肽分析

由SignalP4.1软件对灵芝脂肪酶蛋白的氨基酸序列进行分析，可以发现信号肽的存在（图7），所以基本可以推测此蛋白是分泌蛋白，能进行蛋白转运。

图7信号肽分析

注:

C-score:

原始剪切位点的分值；S-score:

信号肽的分值；Y-score:

综合剪切位点的分值

2.2.4蛋白的结构

蛋白质二级结构：

对灵芝脂肪酶的二级结构预测（图8），利用GORⅣ对克隆的基因进行分析，得到该蛋白的α螺旋占18.16%，得到的扩展束占19.83%，无规则卷曲占51.36%[12]。

Alphahelix（Hh）:

65is18.16%

Extendedstrand（Ee）:

71is19.83%

Randomcoil（Cc）:

222is62.01%

图8灵芝脂肪酶二级结构预测图

注：

竖线从长到短依次为：

a螺旋，β折叠与转角，无规则卷曲。

蛋白质的三级结构：

以米曲菌蛋白为模板对脂肪酶蛋白进行了同源模建，结果见图9。

通过SWISS-MODEL网站提供的数据资料我们可以得到拼接脂肪酶的三级结构结果显示与其源基因米曲菌的三级结构比对（图9），其结构相似，左图即为拼接所得三级蛋白质结构。

由图可知，灵芝脂肪酶蛋白近似球形。

其中该三级结构有9个α螺旋、9个延伸链和一些无规则卷曲组成形成了紧凑的球形空间结构以发挥其生理活性。

在该蛋白质三级结构中，蛋白质都有其特定的活性位点，利用ORFFinder查看其序列，在这之中找出其活性位点（图10），通过软件pymol在其三级结构中标出其活性位点（图11），并利用软件功能突出其位点隐藏其他片段。

做成活性位点直观的结构图（图12）[13]。

图9灵芝脂肪酶三级结构与米曲菌三级结构的比对

注：

左边为灵芝脂肪酶三级结构、右边为米曲菌三级结构

图10脂肪酶的活性位点（黄色底纹字）

图11灵芝脂肪酶的三级结构及活性中心区域

图12灵芝脂肪酶活性位点直观图

2.2.5灵芝蛋白质进化树分析

通过ORFFinder出来的结果中，通过BLAST分析得到得到各物种同源性，这11种真菌的同源性都较高，分别是牛樟芝、皱革菌、滑菇、云芝、白腐菌、污叉丝孔菌、双孢菇、粉孢革菌、皱木耳、印度梨形孢、桂花耳。

下载文本，再利用clustalx1.83将文本文档格式转换为aln的格式文件，再通过软件MEGA4进行分析进化树结构（图13）[14]。

通过进化树直观看出研究拼接的脂肪酶基因是灵芝脂肪酶的基因家族成员。

图1312个物种脂肪酶蛋白的系统进化树

3.讨论

电子克隆主要引用了基因库的EST数据和基因组的生物技术手段得到所需预先预测物种中肯能存在的基因片段，利用了现代电子技术的方法，与之前的的生物技术比起来具有成本低、速度快效率高、操作简单的有点，随着NCBI文库中基因的累积越来越多，实验更容易得到广泛应用，在本研究中就是利用了之前累积真菌的基因片段加以筛选、拼接得到灵芝预先预测的脂肪酶克隆假想基因，得到的灵芝脂肪酶基因全长1105bp，和得到它的一些预测生物学性质：

蛋白质的疏水性、二级结构、亚细胞定位、跨膜区结构、信号肽、三级结构以及构建进化树进行基因同源性比对。

此基因序列与污丝叉孔菌和牛樟芝有非常高的同源性，可以在这两物种间多找一些基因进行研究，该研究的序列可以为今后灵芝脂肪酶的研究提供支持。

虽然本研究使用了权威的NCBI强大数据库以米曲菌为模版，克隆出一段长为1105bp的灵芝脂肪酶基因，但是不能否认的是NCBI中拼接的片段不存在前人克隆过程中有所纰漏的基因片段或者多次操作中存在的失误，本研究的结果有待于在实验中设计引物利用载体进行表达得到验证，可在根据本研究的序列编码信息选取合适的引物，通过反转录PCR检测组织中存在的该基因产物是否表达。

通过实际验证能获得更多关于灵芝脂肪酶基因的功能，以便探索灵芝在其生长阶段不同时期或者不同组中表达的情况、功能等。

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