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BBM培养基
第一章地衣共生菌藻的分离与培养
地衣是一种真菌，由地衣共生菌和一种藻类或蓝细菌（蓝藻）的共生而形成的联合体，属“二元”生物体。
在这个二元共生联合体中，真菌菌丝缠绕大量的光合细胞。
在上述地衣的定义我们可以提出这样的一个问题：
地衣是否可分为单个生物体？
地衣生物学研究的许多方面均涉及到这些不同有机组织的相互作用。
对于共生体的分离和培养研究，为科学家对于地衣共生关系本质的探讨提供了迷人的前景。
该研究的中心问题是地衣光合共生物以及地衣共生菌的培养，这也是解决地衣生理、形态、发育和分子生物学等方面研究的根本问题。
地衣共生体的培养曾经被认为难以进行，这主要是因为这是一项很耗时的工作，而且共生体的培养是否成功需要长期的技术探索。
然而，Ahmadjian（1967b）突破性的研究引起了许多地衣学者对共生菌藻培养的兴趣。
在过去的二三十年间，关于地衣共生菌藻的研究和地衣的人工重建已取得了相当的成就，如图一所示，地衣共生菌藻培养可以通过各种不同的方法而实现。
地衣共生体的培养很难，即使用具富营养的培养基。
主要是因为共生菌的生长远远快于共生藻或蓝细菌。
此外，霉菌、酵母菌和细菌等的污染也是很重要的因素。
因此在所有的操作过程中要进行无菌操作以防污染。
本章的目的在于讲述从地衣中分离出共生菌藻并进行培养的方案。
子方案I讲述了地衣共生菌培养的各种方法。
子方案II讲述了地衣共生藻培养的各种技术。
这些培养技术已有报道，但我们在此研究的基础上又添加了一些新的内容。
关于共生体的分离技术已有Ahmadjian（1967a,b）和Galum（1988）全面的描述了。
子方案I共生菌的培养
注意：
除了每一个清洗步骤，所有的操作都应在超净工作台上或无菌的条件下进行。
所有的仪器在用之前都应高压灭菌（15~20分钟，121℃，1atm）或干热灭菌（30分钟，180℃）。
一、仪器与材料
仪器：
显微镜、解剖镜、相差显微镜、高压灭菌锅、培养箱、超声波发生机、离心机、超净工作台或无菌工作室。
真菌来源：
我们建议所用的地衣应为野外新采集的而且在一周内利用。
然而地衣也可以在干燥状态下保存几周，或在冰箱内存放几年（Yoshimuraetal.1990）。
共生菌可以从子囊孢子、分生孢子、裂芽、粉芽和菌体碎片中分离出来（Ahmadjian1993）。
用来实验室培养最常见的共生菌分离方法是：
孢子释放法，主要是子囊孢子。
获得共生菌藻的另一个方法是解剖菌体切片，这样会形成大量较纯的共生菌，在第二章我们将详细介绍从菌体碎片中获得共生菌和藻的方法。
保存在AkitaprofectueUniversity和Kochigakuencollege的培养真菌可见表1。
（P7－13）。
真菌培养基：
Ahmadjian（1993）和Pyatt（1973）建议用来孢子收集和萌发的培养基应含营养量低。
可在15℃黑暗条件下，采用含水4%的琼脂培养基以取得了较好的效果。
这类共生菌的培养基如下：
WA4培养基——含4%蒸馏水的琼脂培养基
琼脂4克蒸馏水补足100ml
MY培养基——麦芽酵母提取物培养基（ahmadjian1967a）
麦芽提取物20克酵母提取物2克
琼脂20克蒸馏水蒸馏水补足1000ml
LB培养基——LillyandBarnett’s培养基（Lilly和Barnett1951）
葡萄糖10.0克天冬酰胺酸（Asparagine）2.0克
KH2PO41.0克MgSO4•7H2O0.5克
Fe（NO3）3•9H2O0.2mgZnSO4•7H2O0.2mg
MnSO44H2O0.1mg维生素B1（Thiamine）0.1mg
维生素H（Biotin）5ug蒸馏水补足100ml
可以在以上组分上加入15~20g的琼脂，并补足1000ml，并制成固体培养基。
LBG培养基——LillyandBarnett’sGelrite培养基
LB培养基中以1%的w/vGelrite代替琼脂。
注意：
在利用和倒入皮氏培养皿（5mm）或试管（5ml）之前，应将所有培养基进行灭菌。
二、实验步骤
（一）通过孢子分离出共生菌
孢子释放：
1.把野外采集的地衣体洗净，放置几天使其于周围环境达到水分平衡。
也可以将材料清洗和冷冻，在用之前平衡几个小时。
2.从地衣体上取下子囊盘或子囊壳，并将其在放有蒸馏水的培养皿中浸泡4小时或在流动水中清洗。
通过挤压去除多余的水分。
3.将其用凡士林固定在皮氏皿底部，然后用含水4%的琼脂培养基盖在培养皿上部，将培养基放在培养皿的上面盖上，并防止琼脂污染。
4.确保琼脂在孢子的释放范围之内（大约5~10mm），释放的孢子会单个或成团的附着的琼脂的表面。
如果要进行单孢子分离可以通过减少孢子的释放时间或增加子囊果同琼脂之间的距离；否则会得到的是孢子团。
在适当的间隔（依据于释放时间，通常一天）多次的旋转琼脂层。
另外在潮湿的环境中也可以释放到玻璃片上或无菌的薄膜上，然后用蒸馏水将孢子冲下，立即转移到培养基上。
5.用超薄膜将皮氏皿封口，在培养箱中进行培养，条件为无光、15℃。
6.为了检验孢子萌发情况，可以在相差显微镜下，观察孢子的释放情况。
将释放的孢子转移到含有琼脂培养基的玻片上进行观察。
保持皮氏培养皿玻片的潮湿，并连续观察。
可以在水中或通过染色法（lactic-glycerol-cottonblue）观察孢子的萌发和菌丝体的生长情况。
孢子萌发和菌丝体生长：
有些地衣的孢子会在散出后的一天内萌发。
萌发后，将含有孢子的琼脂小块切下并转移到含有营养培养基的皮氏培养皿或试管中。
最常用的培养基为麦芽酵母提取物培养基MY培养基和LB培养基。
（二）从地衣体中分离出共生菌。
由于有些地衣不产生子囊盘或成熟孢子，或者孢子萌发率低，这时候分离共生菌可用另外一个材料来源，如分生孢子（Vobis1997）或粉芽（HoneggerandBartnicki-Garcia1991；Hoveggeretal.1993）。
由于裂芽经常被一些附生的微生物所污染，故不常用来分离共生菌。
Yamamotoetal（1985）已经列出了采用地衣碎片分离出共生菌的方法。
这可见于第二章。
1.用消毒的刮胡刀将新鲜的地衣切成薄片，然后存放于不含营养仅含水的小试管中或放在15℃环境下的潮湿的滤纸片上。
然后将冲洗后的地衣体碎片在研钵中磨碎并加水混匀成悬浮液。
经过滤后的滤液再经过第二次过滤。
从第二次过滤的滤纸上取出少部分接种至斜面培养基上。
新的髓状菌丝通常会在二三周后延长。
采用无菌技术切取一部分新长出的菌丝，转移到试管培养基上。
我们发现这种方法对于获的鹿蕊（Cladiarangiferina）和大叶梅（Paramotrematinctorum）的共生菌很适用。
2.应当对此实验进行多次重复，以保证生长的真菌最有可能为共生菌而不是生长于地衣体表面或内部的其他真菌。
（三）培养共生菌的保存
共生菌可以存放很长时间（大约一年左右）。
但是，最好在两三个月内按如下步骤进行一次继代培养。
利用解剖刀将培养的共生菌分为几部分（通常为5mg）。
将各个部分放在皮氏培养皿中的MY培养基或LB培养基中，在15℃无光条件下培养2~3个月。
每2至3个月重复一次该步骤。
通常共生菌在15~20℃时表现出最大生长率。
在共生菌的培养中，培养基的pH值对群体生长有着重要的影响。
每种共生菌均有其最适生长pH值，通常pH范围为5~6，太高或太低的pH均会阻碍其生长。
在共生菌群体保存培养中，光并不是必须的。
地衣共生菌可以在液氮中保存很长时间，仍具有活性。
三、注释
1.孢子的释放
对于许多地衣来说，在将子囊盘放在皮氏培养皿一天之内就可观察到孢子释放。
然而，有些地衣却只有在二三周后才可观察到孢子释放表2（P18）。
将子囊盘放在皮氏培养皿后，孢子第一次释放时间变化很大。
孢子释放的时间主要取决于地衣种类以及子囊盘采集时发育和代谢状况，以及采集后的地衣体处理和子囊果的年龄。
同样，孢子释放的数目和释放的持续时间也有很大的变化也取决以上因素。
将其浸放水中约15分钟至24小时，然后吸干并放在潮湿空气中（90%RH）慢慢变干，可以获得最大孢子释放量。
许多地衣，如Porpidiaalbocaulescents，graphiscervina（Ahmadjian1993），孢子在释放后很容易分散开来落在琼脂表面。
这种情况下，很容易进行单孢子培养。
然而在毛根石耳（Umbiliacariavellea）和其他一些种类中，孢子却形成一个8孢或少于8孢的孢子团，在这些种类中单孢子分离就有些难度。
Ahmadjian（1993）提出了孢子进一步分离的一些方法（如以下所要提到的微量吸管吸取法）。
Yamamotoetal.（1998）发现许多地衣的孢子释放情况受到采集季节、存放温度和存放时间的影响。
通过对一些种类的实验可知，它们的孢子形成或多或少有着内部的节奏。
对一些温带地衣来说，春夏季是孢子释放的最佳季节。
但是，在加拿大采集的石耳属（Umbilicaria）孢子却在夏季很容易萌发。
2.孢子萌发
据Pyatt（1968）报道，有些孢子在释放后的2~4小时内很快就会萌发，而另外一些则需要花费4~5天才能萌发。
对于大多数地衣来说，孢子在释放几天后就会萌发。
在我们实验中，孢子萌发期约为散发后1~21天（见表2）。
有些孢子也许在释放时就已萌发。
Lawarey（1984）报道Cetrariaciliris的孢子在释放后的六周后才萌发。
Roussard（1969）和MathyHoder（1978）称许多孢子甚至在子囊内就萌发了。
通常，壳状地衣的单细胞孢子比二孢子或多孢子萌发的要快。
叶状和枝状地衣的孢子比壳状地衣的孢子萌发的要慢。
有多核的砖壁型多孢子或单孢子则需更长时间萌发。
孢子的萌发受到培养基组成、培养基初始pH值和培养温度的影响。
实验中大部分种类的孢子均在pH为6、温度为15℃的普通琼脂培养基上萌发。
Letharia的孢子不能在琼脂培养基上萌发，但可以在Gelrite培养基上萌发。
一些种类的孢子不能在麦芽酵母提取的培养基上萌发。
许多Peltigera种类的孢子可以在添加了树脂的培养基上萌发，因为树脂可以吸收抑制孢子萌发的石炭酸（phenols）。
3.培养基的改进
通过对氨基酸或其他含氮类物质形式存在的氮素利用的研究，所得出的结果各异，因而没有一个统一的结论。
添加大部分氨基酸会促进共生菌的生长。
只有半胱氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等，不会维持其生长。
大部分己糖碳源也会促进其生长。
麦芽糖、甘露糖和乳糖也可以促进其生长，而柠檬酸盐、醋酸盐、红藓醇（erythritol）、三糖类则是不理想的碳源（Ahmadjian1967b；Hale1983）。
通过改变和改进碳源和氮源均可改变共生菌丝的形态和生理特点。
各种地衣共生菌对VB1，和维生素H均有一定需求，有些仅对其中一种有需求。
4.过滤膜的应用
共生菌丝可直接接种到琼脂培养基或滤膜上培养。
过滤膜可用纤维素、醋酸和硝酸纤维脂类、玻璃纤维制成（Oliveretal.1989,HoneggerandKutasi1990）。
采用滤膜的优点在于它可以容易的转移到新培养基上。
5.液体培养基的应用
若采用液体培养基进行浸润培养，需要经常更换培养基（HoneggerandKutasi1990,HoneggerandKutasietal.1993）。
由于大部分分离单位易于形成较硬的、只有边缘生长的生长不旺盛菌落，因此最好将材料定期用匀浆机研磨成均一的物质（HoneggerandKutasi1990,Armaleo1991）。
由于不同的种类在其营养需求上有各自不同的特点，因此，很难得到共生菌培养的普通培养基（Bubrick1988）。
6.pH值和光的影响
尽管培养基的pH值和光对共生菌形态和生理的影响很少受到注意，但其影响却是很重要的。
由于地衣共生菌是一种异养生物，故也许会被认为对不同的辐射和光照时间没有反应。
然而，光对非地衣真菌繁殖的影响比对其生长的影响更大。
子方案II共生藻的培养
早期的学者将地衣成薄片放在有光并且潮湿的房间里，使潮湿和光照促使藻共生体的生长，并分离出共生体组织（Ahmadjian1967b）。
这是一种获得光合藻最简单的方法。
Nakano（1987）改进了该方法，并做了详细的叙述。
Nakano和他的合作者已经从日本地衣中获得了许多共生藻（Nakano1988,Takeshitaetal.1989）。
注意：
除了每一个清洗步骤，所有的操作都应在超净工作台上进行或在无菌条件下进行。
用之前所有仪器均应高压灭菌或干热灭菌。
一、实验材料：
显微镜、解剖镜、高压灭菌锅、培养箱、超声波发生器、离心机、超净工作台或无菌室、毛细管、微量吸管。
特殊微量吸管的制作：
（1）将一个内径为4~5mm，长为20cm玻璃管的中央加热，从两端向外拉伸使其从中间断开（图3）。
（2）在吸管较宽的一端塞一个棉塞，并联接一个长的橡皮管。
（3）将微量吸管用铝箔包住灭菌。
在用之前，在超净工作台上加热较窄的一端，用镊子将其拉成一个毛细管。
拉成的毛细管直径应为典型藻细胞直径（约50-75μm）的几倍。
二、共生藻的培养基：
大多数藻类在培养基上易于生长。
只有少数藻类对有机碳源或有机氮源有绝对的需求，一些绿藻在加有葡萄糖或蛋白胨的培养基上生长尤其快。
培养共生藻的培养基如下；
BBM培养基——Bold’sBasalMedium（Deason＆bold1960；Bischoff＆Bold1963）
NaNO3250mgKH2PO4175mg
K2HPO475mgMgSO4·7H2O75mg
CaCl2·2H2O25mgNaCl25m
EDTA50mgKOH31mg
FeSO4·7H2O4.98mgH3BO311.42mg
ZnSO4·7H2O8.82mgMnCl21.44mg
MoO30.71mgCuSO4·5H2O1.57mg
Co（NO3）2·6H2O0.49mg加蒸馏水补足1000ml
可以在以上组份中加入15~20g琼脂，并蒸馏水补足1L制成固体培养基。
3×NBBM培养基（Brown＆Bold1964）
是由BBM改进的培养基，只是比BBM多了3倍的氮素。
同上一样，只是NaNO3为750mg。
如制成固体培养基，需在以上配方中加入15~20g琼脂，并蒸馏水补充1L。
Trebouxia有机营养培养基（Ahmadjian1967a）
1×NBBM970ml葡萄糖20g蛋白胨10g
以上组分中加入15~20g琼脂，加蒸馏水补足1000ml，可制成固体培养基。
MDM培养基：
用以培养蓝细菌，从而代替BBM培养基（Watanabe1960）
KNO31gMgSO4·7H2O250mg
K2HPO4250mgNaCl100mg
CaCl2·2H2O10mg铁溶液1ml
A5溶液1ml加15~20g琼脂，蒸馏水补足1000ml
铁溶液制备：
FeSO41g、蒸馏水500ml、浓硫酸2滴
A5溶液制备：
H3BO3286mg、MnSO4·7H2O250mg、ZnSO422.2mg、CuSO4·5H2O7.9mg、Na2MoO42.1mg、蒸馏水100ml
其他类培养基的报道，主要有：
KratzandMyers（1955），Stanieretal.（1971），Starr（1980），Nichol（1973），Allen（1968；1973），Archibald（1975；1977），Carretal.（1973）也提出了其他的培养基。
注意：
在将培养基使用或倒入试管（5ml）或皮氏培养皿（5ml厚）之前应进行消毒。
三、培养步骤：
（一）前处理操作：
1．地衣体的清洗
对于大型地衣（叶状和枝状）：
从地衣体顶端切下约1㎝2，然后放在自来水中浸泡5~10分钟，用画笔刷在流动的自来水中清理地衣体表面，然后用无菌水冲洗。
对于小型地衣：
如果地衣体较小（多壳状地衣），可将其放入装有1~2ml的无菌水和一滴吐温－20（Tween－20）的小试管中。
超声波粉碎约3分钟。
离心（2000rpm）去除地衣体表面的附属物。
2．地衣体匀浆液的制备
除了每一个清洗步骤，所有的操作都应在超净工作台上进行，或无菌条件下操作。
所有仪器均应高压灭菌（15～20min，121℃，1atm）或干热灭菌（30min，180℃）。
用酸或清洁剂清洗脏的玻片，然后用蒸馏水冲洗。
大型地衣（枝状或叶状）：
（1）清洗之后，将地衣体放在一个无菌的载玻片上。
（2）在解剖镜下，利用针锉平的小刀仔细刮去地衣皮层。
（3）在显微镜下，取下藻层并转移到一个新的无菌的玻片上。
（4）在无菌玻片上滴一滴无菌水，用另一个玻片把切取的的共生藻层盖上，轻轻压玻片，将地衣体磨成较小碎片。
这样，尽管仍有一些菌丝存在，但实际上共生藻就机械地同共生菌分离了。
两种共生体均悬浮在液体中。
较小地衣体：
清洗之后，将小部分地衣体放在无菌的载玻片之间，轻轻磨动玻片。
不像大型地衣的处理，由于小型地衣没有去除表皮，故应需较大的压力。
这样会得到含有菌藻的悬浊液。
也可以采用搅拌器或研钵弄碎较大片地衣。
但是，搅拌器会使脆弱的细胞受到破坏，因此，应采用较温和的方法处理，如在两玻片间轻轻磨动。
几位学者发明了许多地衣冲洗的方法和一些最好设备的建议，如Ahmadjian（1967a）发明的木板和Yoshimuraetal.（1993）的小冲洗器、杯子和过滤器。
对于蓝细菌可采用冷冻切片机产生的切片（小于40μm的厚度）进行培养。
（二）共生藻的分离：
1．在皮氏培养皿的固体琼脂培养基上滴几滴含有共生菌藻的悬浊液。
绿藻要用1×N的NBBM培养基而蓝细菌则用MDM培养基。
另外，也可以将含有共生菌藻的悬浊液喷到皮氏培养皿的琼脂培养基上。
2．在15℃的培养箱中培养15天。
通常培养应保持在15~20℃，光强为10~27μmolm-2s-1（PPED，photosynthesisphotonfluxdensity）的条件下。
培养基最初应放于低光强下。
3．大约一月后（取决于共生藻种类），琼脂培养基上就会出现较少的共生藻群。
如果之前地衣冲洗较彻底，培养基上应生长出真正的共生藻。
4．确定分离的藻类是真正的共生藻有重要意义。
一些丝质藻的污染可能源于渗入碎片中菌体组织的单细胞。
单细胞藻类污染可能源于细胞壁上留下的菌丝体片段。
（三）无菌培养群体的获得：
生长在培养基上的藻类，有许多可能受到污染。
为了获得无菌共生藻的培养群体可采用以下方法。
1．直接法：
可以在体视显微镜下将未受污染的群体选出来，并移植到适宜的固体培养基上。
在试管或皮氏培养皿中的Trebouxia有机营养培养基（Ahmadjian1967a）用于绿藻，含有1%葡萄糖的MDM培养基用于蓝细菌（Watanabe1960）。
如果未受污染就可获得无菌培养群体。
然而，共生藻群却常常受到细菌、共生菌以及其它生物的污染。
此时有必要用喷雾法和微量吸管吸法获得真正无菌群体。
2．喷雾法：
该技术由Wiedemenetal.（1964）提出，很适用于绿藻单细胞的分离。
对于单细胞绿藻或无菌群体获得很有用。
（无细菌、酵母菌污染，也无附着在共生藻上的共生菌污染（见图4）。
具体步骤为：
（1）从单细胞中获得群体，然后从生长在琼脂上的群体中选择污染低（或未污染）的群体，并转移到试管中1×NBBM的斜面培养基上，培养几周。
（2）在10ml的离心管中加入1ml蒸馏水和一滴Tween-20，将共生藻移入。
（3）超声波粉碎。
这样会使共生藻群同附着在其细胞壁表面上的细菌和共生菌污染物分开。
（4）将混合物离心可以将共生藻同其他物质分离。
（5）移去上清液，在离心剩下的共生藻细胞中加入1ml无菌水和Tween，重复以上操作约十次。
（6）在离心管底部插入一个毛细管，并保持直立。
（7）通过毛细管的小开口引出压缩空气，压缩空气穿过伸出离心管的毛细管。
（8）藻培养液就会被冲出毛细管形成喷雾。
（9）快速将含有培养基（通常为Trebouxia有机培养基）的皮氏皿通过喷雾，培养皿上就会附着一层藻细胞的悬浊液。
（10）一周或二周后，将未污染的藻群体移到合适的培养基上。
3．微量吸管吸法：
尽管该法不能用来分离长的丝质藻，但却是分离绿藻可靠的方法。
（1）在每一个有五孔的载玻片滴加一滴无菌水或无菌培养基。
从营养培养基上取下生长的藻类，将其放入玻片的第一个孔中。
如果藻群体成团状，可以通过超声波将其分开。
（2）在体视显微镜下，用微量吸管吸取5~10个藻细胞。
（3）挤压微量吸管胶头，将所吸细胞放入第二个孔中。
（4）重复以上操作五次以上。
微管的尖端应进行蒸汽灭菌，以防止污染。
有时将藻细胞放入新的无菌水时会漂浮在表面，这样就会很难吸取藻细胞。
一般来说，大部分细胞会几分钟后沉入水中。
（5）如果污染十分严重，那就需要采用更多的蒸馏水或无菌培养基重复以上步骤。
（6）在最后清洗之后，挑取单藻细胞转移到新的培养基上（一般转移10~50个细胞）。
（7）用于绿藻培养的Trebouxia有机营养和用于蓝细菌培养的含有葡萄糖的MDM培养基，可以检验培养是否成功。
如果受到细菌或酵母菌的污染，它们会在营养丰富的培养基上快速的生长。
从蓝细菌的胶状外鞘上去除细菌十分难，然而它们可以与藻类协同生长，并不影响共生藻的生长。
尽管在实验室中还没成功地获得较纯的蓝细菌群体，也许可以通过显微操作做到这一点。
平均从一种地衣中应分离出15个单细胞。
4．切片法：
仅用以上介绍的方法很难获得无菌的丝状绿藻，如Trentepohlia。
切片技术会有利于获得这些丝状绿藻。
（１）采用消毒的解剖刀从藻的顶端切下新长成的藻丝，然后转移到新的培养基上。
（２）采用Yamamoto的方法（见第二章），在第二次过滤后，放在解剖镜下挑取淡绿色部分，然后将其转移到有固体培养基或完全琼脂的试管中。
（３）将装有斜面培养基的试管（约50个）保存几周，然后去除任何污染的试管。
培养试管的污染取决于地衣体部位和状况及地衣的种类。
（４）在未污染的试管中，共生体（光合藻和共生菌）大约在培养的四周后长出来。
采用一些附加的处理方法（喷雾法或微量吸管吸法）可以将共生藻进一步分离，以获得源于单细胞的纯基因上藻群。
5．离心方法：
Richardson（1971）发表的离心技术的方案如下所述。
（１）将地衣匀浆获得的悬浊液（子方案一）离心（100~400g，10min）。
通常，在低速离心（100~200g，10min）后大部分小的共生藻会存在于上清液中。
对较大的共生藻必须采用不同搭配的速度和时间。
可以采用低的离心速度（100g）去除较大片的地衣体或组织块，采用较高的速度（400g）从细胞碎片和残物中分离出完整的细胞。
（２）将样品在离心前通过网孔为10~30μm的筛子过滤或通过其他较大孔的过滤器，以除去较大的残片（Bubrick1988）。
（四）光合共生藻培养物的保存
在低光照的条件下，共生藻可以培养很长一段时间（约１年）。
然而，我们认为最好每2~3个月传代一次。
大多数的地衣共生藻的最佳生长温度为15~20℃。
然而，在选择培养条件时应考虑地衣自然生长的温度。
其生长的最佳pH范围是4~7。
其生长的最佳光照范围为16~27μmolm-2s-1（PPFD）（Ahmadjian1967a,b）。
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