肿瘤细胞培养方法和培养基.docx

肿瘤细胞培养方法和培养基.docx

《肿瘤细胞培养方法和培养基.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《肿瘤细胞培养方法和培养基.docx（6页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

肿瘤细胞培养方法和培养基

肝癌細胞培養

一、培養基

1、RPMI-1640+10%胎牛血清培養基

2、DMEM+15%胎牛血清培養基

成分表

二、實驗前準備工作:

操作者的皮膚、培養瓶的蓋和外壁常用酒精消毒。

用紫外線消毒實驗室空氣、工作臺面和一些不能使用其他方法消毒的培養器皿。

進無菌室前或做完實驗后，均應開燈照射30min進行消毒。

紫外線照射60min可以消滅空氣中大部分細菌。

1、玻璃器皿的清洗滅菌（5％鹽酸溶液、重鉻酸鉀120ml、硫酸200ml、蒸餾水200ml）：

（1）浸泡:

新使用或重復使用的玻璃器皿須經5％鹽酸溶液或自來水浸泡過夜或煮沸30min，水洗。

以去除新購進玻璃器皿所帶有灰塵、鉛、砷等物質，并消除其弱堿性。

（2）刷洗:

浸泡后用軟毛刷和優質的洗潔精進行刷洗。

刷洗后經行烘干。

（3）酸浸:

刷洗后的玻璃制品酸浸前須適當晾干或烘干，以免造成酸浸液稀釋，影響效果。

將玻璃制品完全浸泡入清潔液中24h。

清潔液具有極強酸蝕作用，操作過程需戴防護用具。

（4）沖洗、烘干備用:

浸酸后的玻璃器皿先用自來水充分沖洗，吸管需沖洗10min，器皿需每瓶灌滿自來水、倒掉反復10次以上，不留任何酸浸液殘跡，然后用蒸餾水漂洗2～3次，將清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干凈透明，無油煙，不能殘留任何有害物質及化學藥品等。

（5）包裝滅菌:

器材經清洗烤干或晾干后，先應嚴格包裝，然后再行消毒滅菌處理，以防止消毒滅菌后再次遭受污染。

包裝材料常用包裝紙、牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、玻璃或金屬制吸管筒、紙繩等。

2、橡膠制品清洗消毒：

0.5mol/LNaOH煮沸15分鐘，流水沖洗，0.5mol/LHCl煮沸15分鐘，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50℃烤干備用

3、塑料制品的清洗消毒（瓶蓋、離心管）：

使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來水過夜，用紗布或棉簽和50℃清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液15分鐘，流水沖洗（15－20遍）,蒸餾水浸洗三次，雙蒸水泡24小時，晾干備用。

三、細胞復蘇：

凍存細胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必須快速冷凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害，致使細胞死亡。

在凍存細胞的保存管中含有對細胞有毒害的成分DMSO,故在解凍應馬上將其去除。

在冷凍活化前應在無菌臺上將細胞培養液配好，然后將保存管從液氮中取出，放于37℃的溫水中快速使細胞解凍。

解凍后懸液快速移入培養液中混勻，離心去掉上清液，再加入細胞培養液。

實驗人員穿上無菌實驗室操作服用酒精噴于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭實驗臺

（1）取一15ml離心管用滴管在其內滴加5--9ml培養液（取8ml）。

（2）從液氮罐中取出凍存管，并迅速放入37℃水浴，不時搖動，使其急速融化，30～60s內完成。

（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細胞懸液轉移入上述離心管中（用培養基把凍存管洗一遍，把粘在壁上的細胞都洗下來）。

（4）低速離心（1000r／min）5min，去上清后再用8ml培養液再清洗離心一次。

（5）離心后倒掉上清液，在離心管中滴加3ml培養液（RPMI-1640），混勻（可用滴管輕柔吹打）。

（6）將離心管中的混合液轉移到培養瓶中，并在培養瓶中滴加15滴10%小牛血清，蓋上瓶蓋，標好細胞種類和日期、培養人姓名等，將培養瓶平放，置于37°C培養箱中培養。

2-3天換一次培養基。

四、細胞傳代：

當觀察到培養瓶中細胞鋪滿度為90%時（細胞生長處于對數期時），解凍復活成功后的細胞要進行分離培養，否則細胞會因生存空間不足或密度過大，營養障礙，影響細胞生長。

細胞由原培養瓶內分離稀釋后傳到新的培養瓶中培養的過程稱之為傳代培養。

傳代細胞細胞株的最大利處在于提供了大量持久的實驗材料，便于實驗。

（1）試驗臺的消毒工作準備好，棄去舊培養液，用PBS液（不含鈣，鎂離子）洗1-2次，以免剩余培養液影響胰蛋白酶活性。

（細胞貼壁生長）。

（2）向瓶內加入1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mEDTA），置于37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進行消化，1--3min后把培養瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察，當發現胞質回縮、細胞間隙增大后，應立即中止消化（將培養瓶翻轉過來，以保證細胞沒有脫壁）。

備注：

若細胞沒有脫壁，生長良好，則直接倒掉消化液，加培養液8ml，離心收集細胞；若發現很多細胞已解離已脫壁（即解離過度），則直接加培養液進行離心收集細胞。

（4）倒出消化液，向瓶內用滴管加入培養液少量（約2ml），輕輕轉動培養瓶，把殘留胰蛋白液消化液沖掉，然后再加3ml培養液+15滴小牛血清。

（5）使用吸管，吸取瓶內培養液，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。

吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細胞。

（6）將準備好的細胞懸液轉入離心管中，離心（1000r／min）5min。

（7）將離心后離心管中液體倒掉，在離心管中加入3ml培養液，并反復吹打細胞，制成細胞懸液。

（8）取3個無菌培養瓶，酒精棉球擦拭消毒，并在酒精燈下過火消毒。

（9）在培養瓶中各加入1ml細胞懸液、2ml培養液（用移液槍）、15滴小牛血清，加好后酒精燈下過火加塞。

（10）細胞培養換液時間應根據細胞生長的狀態和實驗要求來確定。

一般2～3d后應換一次生長液。

待細胞鋪滿器皿底面，即可使用；也可繼續傳代擴大培養或換成維持液。

五、細胞凍存：

細胞的凍存最常用的方法是液氮冷凍保存法，主要是加入適量的保護劑緩慢的冷凍細胞。

由于細胞在不加任何保護劑的情況下，細胞內外水分會很快結成冰晶，從而引起一系列不良反應。

如細胞脫水使局部電解質濃度升高，PH值改變，部分蛋白質因此變性使細胞內部結構紊亂，溶酶體膜被破壞而放出大量酶將細胞內部結構破壞。

因此在細胞凍存時的關鍵是盡可能減少細胞內水分，減少細胞內冰晶的形成，故凍存時采用甘油或DMSO做保護劑，這兩種物質分子量較小，溶解度大，易穿透細胞，可使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，對細胞毒害作用小，梯度慢速冷凍可使細胞內水分滲出細胞外，減少形成冰晶對細胞產生的傷害。

細胞低溫凍存是培養室常規工作和通用技術。

細胞凍存在-196℃液氮中，儲存時間幾乎是無限的。

細胞凍存及復蘇的原則是慢凍快融。

（1）選對數增生期細胞（細胞鋪滿度為90%左右時），在凍存前1d換液。

（2）試驗臺的消毒工作準備好，倒掉培養瓶內舊培養液。

（3）向瓶內加入1ml0.25%胰蛋白酶液，以能覆蓋培養瓶底為宜。

（4）置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進行消化，1--3min后把培養瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察，當發現胞質回縮、細胞間隙增大后，應立即中止消化。

（5）吸出消化液，在吸除胰蛋白液后，直接加入3ml培養液+15滴小牛血清，終止消化。

（6）使用彎頭吸管，吸取瓶內培養液，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。

吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細胞，按常規方法把培養細胞制備成懸液。

（7）將培養瓶中的細胞懸液轉移到15ml離心管中，（1200r／min）6min，去掉上清液。

再加3ml培養液按常規方法形成細胞懸液。

（8）配制凍存培養液（培養液7ml，10%小牛血清2ml，10%DMSO1ml），于離心管中加入1ml細胞懸液，加入適量配制好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻。

（9）將細胞懸液分裝入無菌凍存管中，每管1.5ml（凍存液要先預冷到4℃）；在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者。

（10）凍存：

標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。

也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h，然后放入液氮氣中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。

[R|281316DE3淣251746256扖ilQ305327744睄326807FA8羨b20540503C值k