红芪中多糖提取工艺的研究汇总.docx

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红芪中多糖提取工艺的研究汇总

红芪中多糖提取工艺的研究

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摘要

红芪作为传统的补益类中药，含有多糖、葡萄糖醒酸、粘液质、多种氨基酸、苦味素、胆碱、甜莱碱、叶酸、熊竹素等多种成分，并具有强心利尿、降压及增强人体免疫机能的作用。

本试验分别采用水提法、微波提取法、超声波提取法和微波-超声波提取法对红芪中的多糖进行提取，比较这四种提取法在操作工程中的差异，并对最后的提取结果进行比较，选出多糖提取率最高的方法。

通过实验发现，采用微波-超声波提取法的多糖提取率最高，得率为7.051%。

在对其进行进一步的工艺研究之后，确定超声温度、超声时间和液料比为影响试验最终结果的三个主要因素，通过对其进行正交试验及方差分析之后，得出在A2B2C2，即超声温度50℃、超声时间40min、液料比为200:

1的条件下提取工艺最佳，测得多糖的最终提取率为7.026%。

试验结果最终证明，采用微波-超声波提取红芪多糖具有较大的优势：

提取时间大大缩短，可避免红芪多糖的分解，所用仪器简单，操作方便。

关键词：

红芪；多糖；提取；优化；正交试验

Abstract

AsatraditionalChinesemedicalherb,RadixHedysaricontainspolysaccharide,glucoseacid,phlegm,kindsofaminoacid,bitterprinciple,bilineurine,betaine,folicacid,kumatakeninandmanyotherkindsofingredient.IthastheeffectofCardiotonics,Diuretic,Hypotensive,andstrengtheningtheImmunefunctionofhumanbody.Inthisexperiment,thepolysaccharideofRadixHedysariwillbeextractedbyrespectivelyusingthemethodsofaqueousextraction,microwaveassistedextraction,ultrasonicextractionandmicrowave-ultrasonicextraction.Comparethefourextractionmethodsbydifferencesinoperation,andcomparetheresultofextraction,themethodwhoseextractionratioishighestwerechosen.Throughtheexperiment,itwasdiscoveredthattheextractionratioofpolysaccharideishighestbythemicrowave-ultrasonicextractionmethod,whichis7.051%.Thenthroughthemoreintensivestudyoftechnology,itissurethattheultrasonic-temperature,ultrasonic-timeandC/Nratioarethemainfactorswhichcanimpacttheexperimentresult.AftertheOrthogonalExperimentandanalysisofvariance,itshowsthatontheconditionA2B2C2（ultrasonic-temperatureis50℃,ultrasonic-timeis40minandC/Nratiois200:

1）thattheextractiontechnologyisbest,andtheextractionrateofpolysaccharideis7.026%.Theresultoftheexperimentprovedthatthemicrowave-ultrasonicextractionmethodhasadvantages:

shortentheextractionperiod,avoidtheresolvingofRadixHedysari,theemployedinstrumentsaresimple,andoperateeasily.

Keywords:

RadixHedysar;Polysaccharide;Extraction;Optimization;Orthogonaltest

目录

一、引言-4-

（一）红芪的生物学特性及生态特征-4-

1．形态特征-4-

2．生长习性-4-

3．生态特征-5-

4．药材鉴别-5-

5．化学成分-7-

（二）红芪的研究现状-7-

（三）多糖的提取与分离纯化-8-

1．多糖的提取工艺-8-

2．多糖的分离和纯化-8-

（四）微波提取的原理及特点-9-

1．微波提取的原理-9-

2．微波提取的特点-9-

3．微波提取在中草药成份提取中的应用-10-

（五）超声波提取的原理及特点-10-

1．超声波提取的原理-10-

2．超声波提取的特点-11-

3．超声波提取在中草药成份提取中的应用-11-

二、材料与方法-11-

（一）试验材料-11-

1．药材-11-

2．试剂-11-

3．仪器-12-

（二）试验方法-12-

1．工艺流程-12-

2．标准曲线的绘制-12-

3．红芪的预处理-13-

4．多糖的提取-13-

5．多糖的分离纯化-14-

6．换算因子的测定-14-

三、结果与分析-15-

（一）单因素试验-15-

1．超声温度对提取率的影响-15-

2．超声时间对提取率的影响-16-

3．液料比对提取率的影响-17-

（二）正交试验-18-

（三）验证试验-18-

四、讨论-19-

五、结论-19-

参考文献-20-

致谢-21-

外文翻译-22-

一、引言

红芪（RadixHedysari），别名岩黄芪、黑芪、独根，为豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪的干燥根[1]，因其皮色红润，故称红芪。

自古与黄芪通用，但其原植物与黄芪同科，不同属。

梁代陶弘景在论述黄芪时曾说:

“…又有赤色者可作膏贴，俗方多用，道家不须…”[2]，这里所指黄芪赤色者即指红芪而言。

古代本草学家对二者并不是不知分辨，只是未从品种名称上加以区别，将红芪统称为黄芪而已。

《中华人民共和国药典》1985年版始将两者分列。

作为传统的补益类中药，红芪性温、味甘。

具有补气升阳、止汗、敛疮生肌、利尿消肿之功效[3]，生用治自汗、盗汗、血痹、浮肿，痛症不溃或溃久不敛。

炙用补中益气，治内伤、劳倦、脾虚泄泻肚、气虚、血脱、崩带及一切气虚血衰之症。

红芪含有多糖、葡萄糖醒酸、粘液质、多种氨基酸、苦味素、胆碱、甜莱碱、叶酸、熊竹素等多种成分。

药理试验表明，红芪具有强心利尿、降压及增强人体免疫机能作用[4~6]；对病疾杆菌、链球茵、葡萄球菌等多种草兰氏阳性菌有抗菌作用。

多糖是由单糖连接而成的多聚物，人们对多糖的研究已经有很长时间的历史，对多糖的初始研究可追溯到1936年Shear对多糖抗肿瘤活性的发现，至20世纪50年代，陆续发现一些真菌多糖和高等植物多糖具有明显的抑瘤活性。

最近又发现许多中药多糖还具有降血糖作用。

70年代以来，科学家们发现多糖及糖复合物在生物体内不仅是作为能量资源和构成材料，重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动。

多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，广泛存在于动物、植物、和微生物细胞壁中，是生物体内除核酸和蛋白质以外的又一类重要的生物分子。

科学研究已经确认糖类物质具有许多生物活性，包括抗肿瘤、免疫、降血糖和抗病毒等，而且对机体几乎无毒副作用。

中药多糖因具有增强机体免疫功能及抗肿瘤降血糖等药理作用，而且几乎没有毒性与副作用，因此引起国内外药理学家、生物学家和化学家们的关注。

多糖广泛地存在于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中，植物中更是广泛的含有多糖，而中药大部分都是植物药，有不少中药中的多糖成分的药理作用都是其重要的主要功效之一。

很早以前，人们就采用一些含多糖丰富的植物治疗各种疾病。

近二十多年来，随着分子生物学的发展，人们逐渐认识到糖及其复合物分子具有极其重要的生物功能。

因此，多糖的提取和分离技术的研究和发展就显得尤为重要。

（一）红芪的生物学特性及生态特征

1．形态特征

红芪基原植物多序岩黄芪（HedySarumpolybotrysHand-Mazz）系多年生直立草本，高达1.5米。

根呈长圆柱形，少分枝，长10~50厘米，直径0.5~2厘米，表面红棕色，皮孔横长，黄色或暗黄色，略凸出。

茎有细瘦分枝。

单数羽状复叶互生，长达15厘米；小叶7~25厘米，长圆状卵形，长1~3.5厘米，宽5~9毫米，先端近平截或微凹，有小刺尖，基部宽模形，全缘，下宙中脉被长柔毛，小叶柄甚短。

总状花序胶生，长达15厘米，有花20余朵，花梗纤细，长2~3毫米，有长柔毛，花等斜钟形，被短毛，下尊齿较长大；花冠淡黄色，长约1厘米，旗瓣长圆状倒卵形，龙骨瓣较旗瓣长。

芙果有子房柄，具3~5英节，有窄翅，表面有稀疏网纹及短柔毛，每节有圆形种子1粒。

2．生长习性

红芪为深根植物，性喜凉爽，有较强的抗旱、耐寒能力，怕热怕涝，气温过高就会抑制地上部植株生长。

土壤湿度大，会引起根部腐烂。

适宜生长在土层深厚、肥沃、疏松、排水良好的砂质土壤。

土质粘重则主根短，侧根多，生长缓慢，产量低。

花期6月下旬至7月上旬，果期7~9月。

红芪种皮较坚硬，吸水力差，发芽率为60~70%。

种子萌发不喜高温。

地温7~8℃，湿度适宜时，10~15天即可出苗。

土壤干旱则不易萌发出苗。

播种两年后开花结实。

3．生态特征

红芪在自然状态下，生长在海拔1800~2500米的高原山脊，台地及沟谷边缘。

土壤为棕壤、褐土及淋溶褐土，土层深厚。

生长区年平均气温6~12℃。

≥10℃的积温为1700~3500℃。

年平均降水430~470毫米，4~9月相对干旱，植被以灌丛草原为主。

4．药材鉴别

（1）性状鉴别

本品（见图1）呈圆柱形，条直，少有分枝，上端稍粗。

长10~50厘米，粗端直径0.8~2厘米。

表面灰红棕色至红褐色，具有明显的纵皱纹及少数支根痕，外皮易剥落而露出淡黄色的皮部及纤维；皮孔横长，稍浅，略凸出，质硬而韧，不易折断，断面纤维性，并富粉性，切断面（见图2）外皮红棕色，皮部黄白色，约占半径的1/3~1/2，内侧可见一棕色环，木质部淡黄色，中央色较浅，可见放射纹理。

气微，味微甜，嚼之有豆腥味。

图1红芪

图2红芪切断面

（2）显微鉴别

本品（见图3）横切面：

木栓层为数列切向延长的木栓细胞。

木栓层为2~4列木栓细胞。

皮层狭窄，外侧2~4列厚角细胞。

韧皮部较宽，外侧有裂隙，纤维成束散在，纤维壁厚，微木化；韧皮射线外侧常弯曲。

形成层成环。

木质部导管单个散在或2~3个相聚，其周围有木纤维。

纤维束周围的薄壁细胞含草酸钙方晶。

粉末黄棕色。

纤维成束，直径5~22μm，壁厚，微木化，周围细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维，含晶细胞壁不均匀增厚。

草酸钙方晶直径7~14μm，长约至22μm。

具缘纹孔导管直径至145μm。

淀粉粒单粒类圆形或卵圆形，直径2~19μm；复粒由2~8分粒组成。

图3红芪横切面

（3）理化鉴别

取本品粉末3g，加水30ml，浸渍过夜，滤过，取滤液1ml，加0.2%茚三酮溶液2滴，在沸水中加热5min，冷后呈紫红色。

（检查氨基酸、多肽）

取上述水溶液1ml，于60℃水浴中加热10min，加5%α-萘酚乙醇溶液5滴，摇匀，沿管壁缓缓加入浓硫酸0.5ml，在试液与硫酸交界处出现紫红色环。

（检查糖、多糖）

取本品粉末2g，加甲醇10ml，放置过夜，滤过。

取滤液1ml，在水浴上蒸干，用少量冰醋酸溶解残渣。

加醋酸酐-浓硫酸试剂（19:

1）0.5ml，颜色由黄转变为红色→青色→污绿色。

（检查甾醇）

取本品粉末2g，加酸性乙醇10ml，温浸2小时，滤过。

滤液调至中性，蒸干，加3%盐酸1ml溶解残渣。

各取滤液0.5ml，分别滴碘化铋钾及碘化汞钾试剂各1滴，前者产生橙红色沉淀。

后者产生灰白色沉淀。

（检查生物碱）

薄层层析

氨基酸的检查样品制备：

取本品粉末（40目）3g，加水15ml冷浸过夜，滤过，滤液适当浓缩，供点样用。

吸附剂：

硅胶G湿法铺板，105℃活化40min。

展开剂：

乙醇-氨水-水（7:

1:

2）。

展距20厘米。

显色剂：

吲哚醌试剂喷雾，105℃烤10min，斑点显不同颜色。

在以上展开系统中脯氨酸与γ-氨基丁酸Rf值接近，可以采用纸层析，以乙醇-氨水（9:

1）为展开剂，将二者分开，茚三酮显色，结果如图4（图左、中）。

胡萝卜甙、谷甾醇的检查样品制备：

取本品粉末（40目）2g，加甲醇10ml冷浸，放置过夜，滤过。

滤液中加石油醚（60~90℃）5ml提取，分取石油醚液，浓缩至1ml，供点样用。

吸附剂：

同上。

展开剂：

氯仿-无水乙醇（8:

2）。

展距20厘米。

显色剂：

10%磷钼酸试剂喷雾，105℃烤10min，显蓝色斑点（图右）。

图4红芪纸层析图谱

5．化学成分

含有抗微生物活性的成分

（一）-3-羟基-9甲氧基紫檀烷，以及降压的有效成分γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid），含量为0.094%。

薄层层析结果，有与D-β-天冬素、脯氨酸（Proline）、精氨酸（Arginine）、γ-氨基丁酸、苏氨酸相对应的斑点[7，8]。

（二）红芪的研究现状

我国学者在上世纪60年代开始对红芪进行研究，并首次确定商品中红芪的主要原植物为多序岩黄芪[9]，并对黄芪与红芪的形态和组织做了区别研究，80年代报道了红芪的生药学研究，阐述了红芪的药用品种和分布，随之也报道了红芪的化学成分研究，1995版中国药典将红芪与黄芪分列，成为单列的一种中药。

近20年来有关红芪的化学成分研究表明红芪中含有多种生物活性物质如氨基酸、β-谷甾醇、黄酮类、多糖、刺芒柄花素、毛蕊异黄苷、甘草甜素、3-羟基-9-甲基紫檀烷等[10，11]。

红芪的药理研究有一定的发展，取得了许多研究成果[12]，表明红芪对心脑等重要器官缺氧缺血有明显的保护作用，对心率，血压有调节作用，对肺功能有保护作用，有多种免疫功能，减毒增效的抗肿瘤作用，有多种形式的抗炎，抗病毒，保肝及调节血糖，血酯的作用[13，14]。

但是其研究对象多为红芪的水煎剂或粗提物，对红芪中含量最多的重要有效成分红芪多糖的分离纯化和深入研究则很少，对红芪的抗肿瘤作用研究主要集中在对免疫功能的影响，而从诱导肿瘤细胞凋亡的角度研究其抗肿瘤作用则未见报道。

（三）多糖的提取与分离纯化

1．多糖的提取工艺

（1）水提法

用水作溶剂来提取多糖是最常用的方法之一，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提。

水提取的多糖多数是中性多糖。

一般植物多糖提取多数采用热水浸提法，该法所得多糖提取液可直接或离心除去不溶物；或者利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，用高浓度乙醇沉淀提纯多糖；但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离；还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖进行分离；其中，以乙醇沉淀最为普遍。

（2）酸提法

有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。

将热水浸提过的阿魏侧耳子实体残渣加8倍量的3%的三氯乙酸浸提，15℃过夜，过滤，离心，将提取液用20%的NaOH中和至pH为7，浓缩、醇析沉淀、丙酮洗涤、真空冷冻干燥得酸提水溶性粗多糖PFA。

从对海蒿子多糖的提取方法研究发现，从硫酸根含量及粗多糖产率看，酸提方法优于水提方法。

（3）碱提法

与酸提类似，有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。

采用稀碱提取，多为0.1mol/L氢氧化钠、氢氧化钾，为防止多糖降解，常通以氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾。

HayashiKatsuhiko发明了从绿色藻类中提取酸性多糖的方法，而这种多糖用常规的热水法是无法得到的。

（4）微波提取法

对微波技术的应用，近年来得到很大发展。

微波是频率介于300MHz和300GHz之间的电磁波，微波提取的原理是微射线辐射于溶剂并透过细胞壁到达细胞内部，由于溶剂及细胞液吸收微波能，细胞内部温度升高，压力增大，当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破裂，位于细胞内部的有效成份从细胞中释放出来，传递转移到溶剂周围被溶剂溶解。

微波具有穿透力强、选择性高、加热效率高等特点。

微波辐射（MWI）可以大大加快反应速度，缩短反应时间。

微波技术应用于植物细胞破壁，有效地提高了收率。

微波提取法具有提取时间短，提取率高，是强化固液提取过程颇具发展潜力的新型辅助提取技术。

（5）超声波提取法

超声波作为一种先进的提取方法，具有提取时间短、能耗低、效率高等特点，在生产中得到了广泛的应用。

其主要原理就是超声波产生“空化作用”，这种空化作用能够产生局部的高温高压，并形成强大的冲击波或高速射流，这种强大的高速射流能够有效地减小、消除与水相之间的阻滞层，加大了传质效率。

同时，高速射流对植物细胞组织产生一种物理剪切力，使之变形、破裂并释放出内含物，这就大大加速了提取过程。

另外，超声波的许多次级效应如热效应、溶化、扩散、击碎、化学效应、生物效应、凝聚效应等也能加速植物有效成分在溶剂中的扩散释放，促进植物有效成分与溶剂混合，有利于提取。

（6）超滤法

膜分离技术被公认为现代分离技术领域中最先进的技术之一，已广泛应用于化工、电子、环保、医药等领域。

超滤（Ultrafiltration，UF）是膜分离科学的重要分支，其原理是以选择性透过膜为分离介质，在外界压力作用下，原料组分选择性地透过膜，以达到分离、提纯的目的。

将超滤膜用于多糖这种生物活性物质的分离，不损害活性、分离效率高、能耗低、设备简单、可连续生产、无污染等。

2．多糖的分离和纯化

（1）分级沉淀法

分步沉淀法是根据不同多糖在不同浓度低级醇、酮中具有不同溶解度的性质，从小到大按比例加入甲醇或乙醇或丙酮进行分步沉淀。

盐析法是根据不同多糖在不同盐浓度中溶解度不同而将其分离的一种方法。

常用的盐析剂有氯化钠、氯化钾、硫酸铵等，以硫酸铵最佳。

金属络合物法是利用多糖能与铜、钡、钙、铅离子形成络合物而沉淀。

常用的络合剂有斐林试剂、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等。

季胺氢氧化物是一类乳化剂，与酸性多糖形成不溶性化合物，常用于分离酸性多糖。

一般地说，酸性强或相对分子质量大的多糖首先沉淀出来，所以控制季胺盐的浓度能分离各种不同的酸性多糖。

安络小皮伞粗多糖的纯化方法，在多糖溶液中加入不同浓度乙醇溶液，得到多个多糖；天门冬冷水浸提物采用丙酮分级沉淀法得到3种多糖。

（2）柱层析法

凝胶柱层析法常用的凝胶有葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose），以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂，从而使不同大小的多糖分子得到分离纯化，但不适宜粘多糖的分离。

一般生药提取物得以分离多用Sepharose、DEAE-Toyopearl、Sephacryl、Sepha2dex精致得到各种多糖。

如灵芝多糖、附子多糖、白术多糖、山药多糖等。

纤维素阴离子交换剂柱层析法常用的交换剂为DEAE-纤维素和ECTEOLA-纤维素，分类硼砂型和碱型两种，洗脱剂可用不同浓度碱溶液、硼砂溶液、盐溶液，其优点可吸附杂质、纯化多糖，并适用于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。

如百合多糖、北沙参多糖、太子参多糖等。

（四）微波提取的原理及特点

微波提取技术是利用微波的热效应对样品及其有机溶剂进行加热，从而将目标组分从样品基体中分离出来的一种新型高效分离技术。

与传统提取技术相比，微波提取技术具有许多独特的优点，被誉为“绿色提取技术”，并已成为实现中药现代化的主要关键技术之一。

1．微波提取的原理

微波提取主要是利用微波强烈的热效应，但微波加热方式不同于传统的加热方式。

在传统的加热方式中，容器壁大多由热的不良导体制成，热由器壁传导至溶液内部需要一定的时间。

此外，液体表面气化而引起的对流传热将形成自内而外的温度梯度，因而仅一小部分液体与外界温度相当。

而微波加热是一个内部加热过程，它不同于普通的外加热方式将热量由外向内传递，而是同时直接作用于内部和外部的介质分子，使整个物料被同时加热，即为“体加热”过程，从而可克服传统的传导式加热方式所存在的温度上升较慢的缺陷。

微波提取离不开合适的溶剂，因此微波提取可作为溶剂提取的辅助措施。

溶剂提取法是根据中草药中各种成分在溶剂中的溶解性能差异，选用对有效成分溶解度大，而对无效成分溶解度小的溶剂，将有效成分从药材组织内提取出来。

采用微波协助提取，可以使溶剂提取过程更为有效。

当被提取物和溶剂共处于快速振动的微波电磁场中时，目标组分的分子在高频电磁波的作用下，以每秒数十亿次的高速振动产生热能，使分子本身获得巨大的能量而得以摆脱四周环境的束缚。

当环境存在一定的浓度差时，即可在非常短的时间内实现分子自内向外的迁移，这就是微波可在短时间内达到提取目的的原因。

微波能是一种能量形式，它在传输过程中可对许多由极性分子组成的物质产生作用，并使其中的极性分子产生瞬时极化，并迅速生成大量的热能，导致细胞破裂，其中的细胞液溢出并扩散至溶剂中。

从原理上说，传统的溶剂提取法如浸渍法、渗漉法、回流提取法、连续回流提取法等均可加入微波进行辅助提取，从而成为高效的提取方法。

2．微波提取的特点

（1）试剂用量少、节能、污染小。

（2）加热均匀，且热效率较高。

传统热提取是以热传导、热辐射等方式自外向内传递热量，而微波提取是一种“体加热”过程，即内外同时加热，因而加热均匀，热效率较高。

微波提取时没有高温热源，因而可消除温度梯度，且加热速度快，物料的受热时间短，因而有利于热敏性物质的提取。

（3）微波提取不存在热惯性，因而过程易于控制。

（4）微波提取无需干燥等预处理，简化了工艺，减少了投资。

（5）微波提取的处理批量较大，提取效率高、省时。

与传统的溶剂提取法相比，可节省50％~90％的时间。

（6）微波提取的选择性较好。

由于微波可对提取物质中的不同组分进行选择性加热，因而可使目标组分与基体直接分离开来，从而可提高提取效率和产品纯度。

（7）微波提取的结果不受物质含水量的影响，回收率较高。

3．微波提取在中草药成份提取中的应用

（1）黄酮类物质的提取

黄酮类成分具有降压、降血脂和抑制血小板聚集等功能，在大部分中药中均存在。

黄酮类化合物的传统提取方法主要有水煎煮法、浸提法或索氏提取法，但费时费力且收率较低。

微波提取在黄酮类物质的提取上具有良好的效果，在提取过程中具有反应高效性和强选择性等特点。

（2）生物碱的提取

生物碱是生物体内一类含氮有机物的总称，多数生物碱具有较复杂的含氮杂环结构和非凡而显著的生理作用，是中草药中的重要成分之一。

（3）苷类物质的提取

微波对某些化合物具有一定的降解作用，且在短时间内可使药材中的酶灭活，因而用于提取苷