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植保生物技术复习资料

原生质体的分离与融合

原生质体是指出去细胞壁的植物细胞的部分

原生质体分离的基本原则是保证原生质体不受伤害并不损害其再生能力。

1.机械法

只有储藏组织中较大的、高度液泡化的细胞才能用于分离原生质体，如洋葱球茎鳞片、萝卜根、甜菜根等；

缺点：

产量低；方法枯燥无力；因破碎细胞释放物的存在，原生质体活力低。

2.酶法

Cocking在1960年证实了可用酶分离原生质体。

Takabe等1968年首次用商业酶试剂分离原生质体，并在1971年获得再生植株。

缺点是：

不纯酶制剂所含的杂质可能会对原生质体产生不同程度的毒害作用。

影响原生质体分离的因素

原生质体分离时主要考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透压、酶解时间、温度等。

1组织和细胞材料的生理状态

植物幼苗或新生枝的完全伸展叶片的叶肉组织是分离原生质体的最方便、最合适的植物材料。

叶肉细胞排列松散，酶试剂很容易达到细胞壁。

用于分离原生质体的愈伤组织或悬浮细胞应当处于生长早期或指数生长期。

采用愈伤组织或悬浮细胞，采用其材料可以避免植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操作方便，无需消毒。

2酶

纤维素和半纤维素是细胞壁的初生结构和次生结构的成分，果胶类物质是连接细胞胞间层的成分。

纤维素酶（降解构成细胞壁的纤维素）、半纤维素酶、果胶酶（使细胞从组织中分开，以及细胞与细胞分开）酶活性与pH有关，4.7~6.0，温度一般在25~30℃

3渗透剂

原生质体直接释放到培养基中会破裂，因此，在分离原生质体期间，须对原来细胞壁机械维持压力用原生质体分离混合液以及后来培养基的适当渗透压代替。

在合适的渗透压溶液中，刚分离的原生质体看起来是球状的。

4原生质体的纯化

酶消化后得到的混合物含有亚细胞碎片、未消化的细胞、破碎的和完整的原生质体。

可通过对此混合物通过过滤、离心、漂洗联合的方法进行纯化。

1）收集：

原生质体混合液用滤网（40~100μm）去掉没有降解的细胞及组织，收集滤液。

2）洗涤：

将网下物低速离心，去掉上清液，再加无酶液的CPW液悬起起原生质体，再离心，弃上清，重复几次即可。

纯化（上浮法和下沉法）

上浮法是将酶解的原生质体与蔗糖溶液（23%左右）混合。

下沉法是讲原生质体与13%的甘露醇混合，然后加到23%的蔗糖溶液顶部，形成一个界面。

两种方法中，均在离心5~10分钟后，在蔗糖溶液顶部形成一条原生质体带。

用吸管将带轻轻吸出来，悬浮离心，稀释后用于培养。

5原生质体的活力测定和密度

原生质体的真正活力使原生质体有能力通过持续有丝分裂，再生成愈伤组织，并最终再生成植株。

测定原生质体活力的方法主要有：

FDA（荧光素二乙酸）染色法；酚藏红花（CFW）染色法；测定呼吸强度法等。

6培养基成分

培养基中应当去除铵，因为它对原生质体的生存是有害的，而铁、锌的含量也应当减少。

另外，钙的浓度应当比通常培养细胞所需的浓度增加2~4倍，提高钙的浓度能改善膜的稳定性。

葡萄糖是最好最可靠的碳源，其次为蔗糖。

7环境因子

一般来说，刚开始培养时高光强会抑制原生质体的生长，因此应先在黑暗或弱光下培养几天，再将其转移到一般光强下培养。

温度范围20~28度适宜，pH范围5.5~5.9适宜。

三、原生质体培养

1.液体浅层培养（Liquidthinlayerculture）

原生质体纯化后，将原生质体悬浮于液体培养基中，取少许于培养皿底部形成很薄的一层，封口培养。

2.固体培养（Solidculture）

也叫琼脂糖平板法或包埋培养法。

将原生质体悬浮于液体培养基后，与凝固剂（琼脂或琼脂糖）按一定比例混合，在培养皿底部形成一薄层，凝固后封口培养。

3.固液双层培养法（Solidoverliquidculture）

即先在培养皿底部铺一层固体培养基，待凝固后再在其上进行液体浅层培养。

固体培养基中的营养成分可以被液体层中的原生质体吸收利用，而原生质体产生的有毒物质可以被固体培养基吸收

细胞再生

1）细胞壁形成

（2）细胞分裂

（3）植株再生

体细胞杂交

离体条件下，通过分离体细胞原生质体融合产生杂合体，再通过其异核体的发育形成杂种植株的技术被称为体细胞杂交。

这个程序消除了杂交中性别因素。

克服不亲和性障

碍，成为植物基因的遗传操作方法。

在体细胞杂交中，亲本的细胞核和细胞质在杂种细胞中融合了。

有时，融合的杂合体中只有一个亲本的核基因，而有两个亲本的细胞质基因，这样的杂种叫胞质杂种。

物种间生殖隔离阻碍了物种之间的基因交流，从而给作物育种带来很大的局限性。

原生质体融合技术是实现基因重组的一条新途径，目前利用细胞融合已从很多物种、属间，甚至科间获得体细胞杂种，创造了一些自然界不存在的植物类型。

原生质体融合技术体系大致包括三大环节：

诱导原生质体融合

选择融合体或杂种细胞

种植株的再生与鉴定

原生质体融合

原生质体融合是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程。

1自然融合

来源于分裂旺盛细胞的原生质体，自发融合的频率较高。

小孢子来源的原生质体融合率可高达50~70%。

实际上自然条件下受精就是一种自发融合。

2诱发融合

1）NaNO3处理法

缺点是Na+造成膜电位的改变。

融合频率低

2）高pH-高钙法

3）水溶性多聚体——聚乙二醇（PEG）法

4）电融合法

主要是双向电泳法，其基本原理：

与PEG融合比较起来，电融合有三大优点：

一是不存在对细胞的毒害问题；二是融合效率高；三是融合技术操作简便

电融合的基本过程：

细胞膜的接触：

当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；

膜的击穿：

原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。

体细胞杂种的特点

形态上的趋中性

变异幅度大

非整倍性

双亲性状的共显性

偏亲现象

杂种细胞的选择系统与杂种植株的鉴定

1．杂种细胞的选择系统

外观选择互补选择荧光标记选择

2．体细胞杂种的鉴定

任何两个种的原生质体都可以融合在一起。

然而，高等植物体细胞杂交的广泛利用收到一些限制，包括非整倍体、杂交的种障碍和不可能从原生质体再生成植株等。

杂种性的鉴定要求有证明两个融合亲本遗传贡献的清楚证据，而杂种性只能来源于整倍体，而不能来源于非整倍体。

细胞学鉴定：

细胞器鉴定、染色体鉴定。

染色体计数：

染色体数目是双亲之和，或少1至几条染色体。

所以，细胞融合可以创造非整倍体。

代换系、染色体片段置换系等珍贵的遗传学研究材料。

这些遗传材料对于基因定位、确定染色体与分子标记连锁群的关系、育种等有重要应用价值。

生化鉴定：

同功酶鉴定

分子鉴定：

RFLP鉴定、RAPD标记鉴定

是最有效的检测手段，尤其是细胞学无法确定是杂种的时候，分子标记更有用，它能检测出遗传物质的细小重组。

体细胞杂种的遗传特性

1．细胞分裂与染色体丢失

2．基因转移与性状表达

3．体细胞杂种遗传上的不稳定性

体细胞杂种的应用

一、体细胞杂种的应用潜力

1、植物育种中的核质替换2、细胞质杂种的获得3、远缘杂交创造新物种

4、细胞器的互作研究

二、体细胞杂交面临的困难

1、融合特性的高效性2、杂种细胞的培养和选择3、杂种的遗传稳定性控制

三、体细胞杂交研究的发展趋势

1、诱导融合及杂种细胞的各种生理、生化、遗传机理的研究

2、电融合的程序化控制研究

3、各种类型原生质体（胞质体、核质体、细胞器）的制备技术研究

4、杂种细胞培养技术的程序化研究

分子生物学技术

PCR

原理：

反应体系：

含有目的基因或序列的DNA模板热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）

一对脱氧寡核苷酸引物（primer）4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）Buffer及Mg2+等

反应过程：

变性：

升高温度使模板DNA变性、双链分开；

退火：

再降低温度使引物与模板DNA配对互补结合；

延伸：

然后升温到聚合酶反应适宜的温度，此时在聚合酶催化下，从引物3’羟基端开始与模板DNA上的碱基配对逐个加上核苷酸，合成新的DNA链。

循环：

其后再按高温变性、低温退火、适温合成三步反复循环，新合成的DNA在下一循环中又作为模板使用，每循环一次，合成的目的序列扩增一倍

PCR反应条件的优化：

引物设计:

长度18-24bp避免3'端的互补,否则容易造成DIMER避免内部形成二级结构

退火温度：

熔解温度（Tm）是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度；合理的退火温度从55℃到70℃。

退火温度一般设定比引物的Tm低5℃；

不同退火温度对PCR扩增的影响。

较低的退火温度有利于引物同目的序列有效退火，但同时也会增加非特异性扩增

镁离子浓度：

Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带

循环次数：

当其它参数确定之后,循环次数主要取决于DNA浓度。

一般而言25-30轮循环已经足够。

循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加

HotstartPCR（热启动PCR）TouchdownPCR（降落PCR）NestedPCR巢式PCR

RT-PCR:

提取组织或细胞中的总RNA

以其中的mRNA作为模板，

以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达

不对称PCR：

不对称PCR采用不等量的一对引物，若干循环后，量少的一种先消耗完，剩下另一引物参与以后的循环反应，产生大量的单链DNA

方法：

采用两种不同浓度的引物。

分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。

用途：

制备核酸序列测定的模板

制备杂交探针等

反向PCR

是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。

用限制酶消化基因组DNA，用连接酶将各片段连接成环状。

用限制酶切割已知序列，根据已知序列设计3′端引物和5′端引物，扩增未知序列

锚式PCR：

原位PCR

原位杂交PCR首先将样品组织切片或细胞涂片，然后固定在载玻片上；

适当预处理后，将细胞核内的DNA加热变性形成两条单链DNA。

针对待检测的选定序列设计一对引物，直接将引物dNTP缓冲液及TaqDNA聚合酶加到载玻片上在原位聚合酶仪内进行PCR扩增反应完毕后将PCR产物固定在载玻片上用相应的检测信号系统进行检测。

可以检测组织细胞中微量DNA或RNA，且可精确定位

PCR和原位PCR在概念上有什么区别

PCR是提取细胞或组织中的DNA进行基因扩增反应，而原位PCR是保持细胞或组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置上进行基因扩增，不但可以检测到靶DNA，而且还可以了解靶DNA存在于何种细胞中，更有利于探讨靶DNA与细胞之间的关系。

定量PCR：

荧光实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

常用的荧光标记方法可简单分为两大类：

非特异检测——双链DNA内插式荧光染料；代表是SYBRGreenI荧光染料

扩增序列专一检测——主要指荧光探针。

TaqMan探针、和分子信标MolecularBeacon

荧光染料技术成本低廉，实验设计简便；而探针杂交技术在原理上严格，所得数据特异性高、更为精确

PCR扩增过程中：

Taq酶在链延伸时遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性（此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响）就会将切割探针

释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。

每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数

第三节基因克隆技术

基因组DNA文库：

指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。

代表性和随机性载体的选择:

基因组DNA文库的构建流程

高纯度大分子量基因组DNA（HighmolecularweightDNA,HMWDNA）的提取；

HMWDNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGEsizeselection）；

载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；

重组克隆的挑取和保存

cDNA文库中的外源DNA片段是互补DNA（complementaryDNA,cDNA）。

cDNA是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的双链cDNA。

cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和，代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因

cDNA文库的构建

cDNA文库的构建共分四步：

  第一，细胞总RNA的提取和mRNA分离； 第二，第一链cDNA合成；

第三，第二链cDNA合成。

第四，双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。

DNA测序技术-测序目的

测定未知序列确定重组DNA的方向与结构对突变进行定位和鉴定比较研究

DNA测序的基本方法

链终止法测序化学降解法测序自动化测序非常规DNA测序

1、链终止法测序

基本原理:

1977年Sanger提出了“终止法”。

其反应体系包含单链模板、引物、4种dNTP和DNA聚合酶，分四组进行，每组按一定比例加入一种2’，3’双脱氧核苷三磷酸ddNTP，它能随机掺入合成的DNA链，一旦掺入合成即终止，于是各种不同大小片段的末端核苷酸必定为该核苷酸，经变性胶电泳，可从自显影图谱上直接读出DNA序列。

2化学降解法测序（Maxam和Gibert于1977年发明）

基本原理:

在选定的核苷酸碱基中引入化学基团,再用化合物处理,使DNA分子在被修饰的位置降解.

Maxam-Gilbert法所用的化学技术

目前所用测序技术的特点

1、测序原理是DNA链终止法，注定了一个反应所测序列不可能太长，一般为1000个核苷酸左右

2、测序反应费时费力

人类基因组测序整整花了13年时间，耗费30亿美元的费用

3、测序准确度不高

DNA聚合酶造成碱基错配，DNA序列判读错误

4、测序基于PCR反应，需要引物，有些结构复杂的难于进行

大规模DNA测序的趋势——自动化

DNA测序不断由半自动化向自动化过渡以实现DNA测序的完整性。

目前，在亚克隆筛选、模板制备、测序反应、碱基阅读等方面均在一定程度上实现了自动化。

1、克隆筛选并筛选单一克隆已逐步实现了自动化。

2、模板制备现有的机器

从亚克隆文库中寻找人可以被用来自动分离DNA并制备适于传统操作程度的测序模板。

特定用途的DNA分离仪也已采用。

3、测序反应

由于手工测序不能保证所需的再生产能力、高通量和准确的重复性，所以，DNA测序反应的自动化对大规模测序是至关重要的。

4、自动放射性自显影阅读机

近几年来，自动化放射性自显影阅读机纷纷上市，并不断向商业化及科研应用方向发展。

5、自动测序仪

DNA自动测序仪的应用实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基阅读等步骤自动化。

同源有如下几种情况：

ADNA序列某些片段完全相同；

B开放读码框（ORF）排列类似，如有长外显子；

C开放读码框翻译成氨基酸序列的相似性；

D模拟多肽高级结构相似

试验分析

（1）Northern杂交确定DNA片段是表达序列：

注意事项：

a当某一基因的转录产物进行可变剪接时，由于连接的外显子不同，会产生好几条长度不一的杂交带，如果该基因是某一基因家族的成员也会出现多个信息；

b必须考虑组织专一性和发育阶段等问题；

确定DNA顺序中基因的位置

A通过对全长cDNA序列的测序、对比，以及与基因组DNA的比较，确定基因所在的区域；

B通过物种已建立遗传图和物理图来确定基因的位置；

重组DNA技术

1重组DNA技术是基因工程的核心技术2获得需要的目的基因（外源基因）

3构建重组质粒和基因克隆4转化受体细胞和转化子的筛选

5转化子的分析——Southern杂交

重组DNA技术，又称为基因克隆或分子克隆技术，是将感兴趣的DNA片段连接在载体DNA上，导入受体细胞，通过受体细胞的繁殖而扩增感兴趣的DNA片段的技术。

克隆（clone）---无性繁殖

分子克隆–DNA的无性繁殖技术

重组DNA技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。

重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。

基因工程（geneticengineering）就是把外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制，转录，翻译表达的操作叫基因工程。

目的：

1、分离获得某一感兴趣的基因或DNA序列2、获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）

重组DNA操作一般步骤：

（1）制备载体和外源DNA分子；

（2）外源DNA分子与载体连接，形成新的重组DNA分子；

（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；

（4）对转化子筛选和鉴定；

（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。

获得需要的目的基因（外源基因）

获得需要的目的基因常用的方法：

（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库（genomicDNAlibrary），从中调用目的基因；

（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立cDNA文库；

（3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。

（4）化学合成：

已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。

2、cDNA文库：

以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库（cDNAlibrary）。

聚合酶链式反应PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。

加入4种物质：

（1）作为模板的DNA序列；（3）TaqDNA聚合酶；（4）dNTP（dATP,dTTP,dGTP和dCTP）。

（2）与被分离的目的基因两条链各自5’端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）；

变性、退火、延伸三步曲

变性：

双链DNA解链成为单链DNA

退火：

部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合

延伸：

以目的基因为模板，合成互补的新DNA链

DNA重组技术的基本工具

.手术刀（基因的剪刀）------准确切割DNA（限制性内切酶）

缝合针（基因的针线）-----将DNA片段再连接起来（DNA连接酶）

.运输工具（基因的运载体）------将体外重组好的DNA导入受体细胞（载体：

质粒、病毒、噬菌体）

.宿主菌

1、限制性内切酶的定义

是指已被证明是限制修饰系统中的一个组成部分，具有识别双链DNA分子中的某种特定核酸序列并由此切割DNA双链结构的酶统称为限制性内切酶。

作用:

识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开.

限制性内切酶可分为三大类型：

类型I和类型III：

由于识别位点并非严格专一，很少被应用。

类型I：

Ecok,EcoB,对识别位点有专一性而对切割位点没有专一性，不利于基因克隆

类型III:

HgaI,酶切后生成的单链末端各不相同，切割产物不均一

类型II：

是DNA重组技术最为常用的工具酶。

识别位点严格专一识别序列的碱基数一般为4、6、8个bp

识别位点经常是一种回文序列的DNA

EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段

限制性内切酶的切割方式

就切割位点相对于对称轴的位置而言,切割方式有三种:

•在对称轴5'侧切割产生5'粘端

•在对称轴3'侧切割产生3'粘端

•在对称轴处切割产生平段

1、粘性末端连接：

同一限制酶切割位点连接配伍末端连接

不同限制性内切酶位点连接由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段，具有相同类型的粘性末端，即配伍末端。

2、平端连接

适用于：

限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端

3、同聚物加尾连接

由末端转移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。

DNA连接酶-------“分子缝合针”

差别:

E.coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来,不能将双链DNA片段平末端之间进行连接;T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端,但连接平末端之间的效率比较低.

DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?

为什么?

不是一回事。

DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？

（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。

（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。

因此DNA连接酶不需要模板。

此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。

基因进入受体细胞的载体------“分子运输车”

质粒λ噬菌体的衍生物动植物病毒

1.一种裸露的,结构简单独立于细菌染色体之外,并具有自我复制能力的双链环状DNA

分子.2.有一至多个限制酶切割位点3.有特殊的遗传标记基因4.必须是安全的,大小要合适

载体

载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具

为实现外源DNA片段无性繁殖的载体为克隆载体

为表达出蛋白质而设计的载体称为表达载体

常用的克隆载体：

1）质粒（10kb）

2）λ噬菌体（9-23kb）：

以多克隆位点与筛选标记代替费必需区。

3）粘性质粒（40-50kb）：

带有cos区的载体

载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，载体选择标准：

能自主复制；

具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；

有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；

分子量小，以容纳较大的外源DNA。

目前最常用的载体包括细菌质粒、l噬菌体、cosmid质粒等。

质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的一段环状DNA分子。

进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。

（大小为1～200kb）

质粒的生物学基本特性

自主复制性：

携带有自己的复制起始区（ori）它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。

不相容性：

不同质粒如果被导入同一细胞中，会彼此竞争，拷贝数多的复制更快，结果在细菌繁殖几代之后，子