植物组织培养是园艺技术专业技能训练课程之一Word格式.docx
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最困难也是最重要的是检查空气滤板其密封性，它直接关系到机器的正常使用。
最简单的检查方法是营养琼脂平板法。
新购买的和久置未用的超净工作台除用紫外灯等照射外，最好能进行熏蒸处理，然后在机器处于工作状态时在操作区的四角中心位置各放一个打开的营养琼脂平板，两小时后盖上盖并置37℃培养箱中培养24小时，计算出菌落数。
平均每个平皿菌落数必须少于0.5个。
3维护
超净工作台是一台较精密的电气设备，对其进行经常性的保养和维护是非常重要的。
首先要保持室内的干燥和清洁，潮湿的空气既会使制造材料锈蚀，还会影响电气电路的正常工作，潮湿空气还利于细菌、霉菌的生长。
清洁的环境还可延长滤板的使用寿命。
另外，定期对设备的清洁是正常使用的重要环节。
清洁应包括使用前后的例行清洁和定期的处理。
熏蒸时，应将所有缝隙完全密封，如操作口设有可移动挡板封盖的类型超净工作台，可用塑料薄膜密封。
超净工作台的滤板和紫外杀菌灯都有标定的使用年限，应按期更换。
1—3光照培养箱的使用
光照培养箱是具有光照功能的高精度恒温设备，通常用于植物发芽与培养。
1.把电源开关拨至“1”处，此时电源指示灯亮，控温仪有数字显示，钟控仪上有时间显示。
2.温度设定
当所需箱内温度与设定温度相同时不需要设定，反之则需要重新设定。
先按控温仪的功能键“SET”进入温度设定状态，SV设定显示一闪一闪，再按移动键“⊿”配合加键“△”或减键“▽”，设定结束需要按功能键“SET”确定。
如需要设定温度20.0℃，原设定温度16.5℃，先按功能键“SET”。
再按移动键“⊿”，将光标移至显示器十位数字上，然后按加键“△”，使十位数字从“1”升至“2”，十位数设定后，移动光标依次设定个位和分位数字，使设定温度显示为20.0℃，按功能键“SET”确认，温度设定结束。
设定结束后，各项数据长期保存。
此时生化培养箱进入升温或降温状态，当箱内温度接近设定温度时，比例加热指示灯忽亮忽熄，反复多次，控制进入恒温状态。
3.打开内外门，把所需培养的物品放入培养箱，关好内外门，如内外门开门时间过长，箱内温度有些波动，这是正常现象。
根据需要选择培养时间，培养结束后，把电源开关拨至“0”，如不马上取出物品，请不要打开箱门。
培养箱应放置在清洁整齐，干燥通风的工作间内；
使用前，面板上的各控制开关均应处于非工作状态；
在培养架上放置试验样品，放置时各试验瓶（或器皿）之间应保持适当间隔，以利热（冷）空气的对流循环。
数显光照培养箱
光照培养箱
1—4恒温箱的使用
恒温箱用于生物材料的培养，恒温箱的最高工作温度为60℃。
1使用方法
（1）将温度计插入座内（在箱顶放气调节器中部）。
（2）把电源插头插入电源插座。
（3）将电热丝分组开关转到1或2位置上（视所需温度而定），此时可开启鼓风机促使热空气对流。
电热丝分组开关开启后，红色指示灯亮。
（4）注意观察温度计。
当温度计温度将要达到需要温度时，调节自动控温旋钮，使绿色指示灯正好发亮，十分钟后再观察温度计和指示灯，如果温度计上所指温度超过需要，而红色指示灯仍亮，则将自动控温旋钮略向反时针方向旋转，直调到温度恒定在要求的温度上，指示灯轮番显示红色和绿色为止。
自动恒温器旋钮在箱体正面左上方。
它的刻度板不能做为温度标准指示，只能做为调节用的标记。
（5）在恒温过程中，如不需要三组电热丝同时发热时，可仅开启一组电热丝。
开启组数越多，温度上升越快。
（6）工作一定时间后，开启顶部中央的放气调节器将潮气排出，也可以开启鼓风机。
（7）使用完毕后将电热丝分组开关全部关闭，并将自动恒温器的旋钮沿反时针方向旋至零位。
（8）将电源插头拔下。
2.注意事项
（1）使用前检查电源，要有良好地线。
（2）箱内应保持清洁，放物网不得有锈，否则影响玻璃器皿洁度。
（3）使用时应定时监看，以免温度升降影响使用效果或发生事故。
（4）鼓风机的电动机轴承应每半年加油一次。
（5）切勿拧动箱内感温器，放物品时也要避免碰撞感温器，否则温度不稳定。
（6）检修时应切断电源
第二部分：
单元项目训练
训练一培养基的配制技术
一、训练目标
1．知识目标：
一般掌握培养基的种类、特点；
基本培养基的配方和组成成分。
2．技能目标：
通过MS培养基母液的配制与保存，掌握配制与保存培养基母液的基本技能；
通过MS固体培养基的配制，掌握配制培养基的基本技能。
二、设备仪器与试剂
分析天平、托盘天平、冰箱。
烧杯、量筒、移液管、定容瓶、三角瓶、封口膜及线绳若干、pH试纸等。
MS培养基所需各种物质（见配方）、琼脂、蔗糖、IAA、6-BA、0.1MNaOH、0.1MHCl等。
三、训练内容
（一）培养基配制基础知识
一、培养基的种类
目前国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基及特点如下：
１．ＭＳ培养基
特点：
是无机盐离子浓度较高，硝酸盐较高，为较稳定的平衡溶液。
适用：
广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。
２．Ｂ5培养基
含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。
如双子叶植物特别是其中的木本植物。
３．Ｗhite培养基1963年又作了改良，称作Ｗhite改良培养基。
无机盐数量较低。
生根培养。
４．Ｎ6培养基
成分较简单，ＫＮＯ3和（ＮＨ4）2ＳＯ4含量高。
广泛应用于小麦、水稻及其它植物的花药培养等。
二、培养基的成分
可以分为水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。
１．水
作用：
原生质体的组成成分，代谢过程的介质和溶媒。
它是生命活动过程中。
２．无机元素
大量元素，指浓度大于0.5mmol/l的元素，有Ｎ、Ｐ、Ｋ、Ｃa、Ｍg、Ｓ等。
其作用是：
（1）N
功能：
是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，是生命结构和功能物质不可缺少的。
（2）P
是磷脂的主要成分，而磷脂又是细胞膜、细胞核的重要组成部分。
磷也是核酸、ＡＴＰ、辅酶等的组成成分。
组织培养中，磷不仅增加养分、提供能量，而且也促进对Ｎ的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。
（3）K
Ｋ对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系，它具有活化酶的作用。
Ｋ增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。
但浓度不易过大，一般为１～３mg/l为好。
（4）Ｍg、Ｓ和Ｃa
Ｍg是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；
Ｓ是含硫氨基酸所构成蛋白质的组成成分。
Ｃa是构成细胞壁的一种成分，Ｃa对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，
（5）微量元素
种类：
指小于0.5mmol/l的元素，Ｆe、Ｂ、Ｍn、Ｃu、Ｍo、Ｃo等。
铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。
同时，它又是叶绿素形成的必要条件。
培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。
Ｂ、Ｍn、Ｚn、Ｃu、Ｍo、Ｃo等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长，发育异常现象。
３．有机化合物
（1）碳水化合物
（2）维生素
以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，促进生长、分化作用。
VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长，VPP与植物代谢和胚的发育有一定关系。
VC有防止组织变褐的作用。
（3）肌醇 又叫环己六醇，
参与构建细胞壁。
由磷酸葡萄糖转化而来，进一步生成果胶物质。
能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。
促进组织和细胞的繁殖、分化。
（4）氨基酸
作为有机氮源，利于被细胞直接吸收利用。
（5）天然复合物 大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。
它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。
①椰乳
它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。
在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用，但茎尖组织的大小若超过１mm时，椰乳就不发生作用。
4.植物激素
（1）生长素类
1诱导愈伤组织形成，2诱导根的分化 3促进细胞分裂、伸长生长。
在促进生长方面，根对生长素最敏感。
在极低的浓度下，（１０－５～１０－８mg/L）就可促进生长,其次是茎和芽。
５．培养材料的支持物
（1）琼脂
只是固化剂。
本身并不提供任何营养。
性质：
琼脂能溶解在热水90℃以上中，成为溶胶，冷却至40℃即凝固为固体状凝胶。
（二）技能训练项目
MS培养基的配制
1母液的配制
1.1大量元素母液
在分析天平上按下表分别称取大量元素药品，置于三角瓶中，分别加蒸馏水100ml左右于三角瓶中，再放到磁力搅拌器搅拌溶解，然后一一倒入1000ml的容量瓶中（注意CaCl2要后加，,最后加蒸馏水定容至刻度，此为10倍液的大量元素母液。
1.2微量元素母液
在分析天平上按表分别称取微量元素药品,按大量元素母液配制方法，配成100倍液的微量元素母液。
1.3铁盐母液
在分析天平上按表称取FeSO4.7H2O和Na2－EDTA药品，配成100倍液的铁盐母液。
1.4有机物母液：
用分析天平按表分别称取甘氨酸VB1、Vpp、VB6、肌醇，配成50倍有机物质母液。
1.5IAA和6-BA母液
IAA及BA分别取100mg，前者用少量酒精溶解后加水定容100ml，后者用少量IN盐酸溶解加水定容100ml,即配成1mg/ml激素母液。
表1
ＭＳ培养基母液的配制
母液名称
药品
名称
原配方量
（mg）
扩大
倍数
称取量
母液体积
（ml）
移取量
大量元素
母液
NH4NO3
1650
10
16500
1000
100
KNO3
1900
19000
CaCl·
2H2O
440
4400
MgSO4·
7H2O
370
3700
KH2PO4
170
1700
微量元素
MnSO4·
H2O
22.3
2230
ZnSO4·
8.6
860
CoCl·
6H2O
0.025
2.5
CuSO4·
5H2O
0.02
25
H3BO3
6.2
620
Na2MO4·
0.25
KI
0.83
83
铁盐母液
FeSO4·
28.7
2870
Na2-EDTA
37.3
3730
有机物
烟酸（Vpp）
0.5
50
500
盐酸吡哆醇
盐酸硫胺素
0.1
5
肌醇
5000
甘氨酸
2
2.MS培养基的合成
2.1加入药品用量筒取大量元素母液100ml倒入1000ml定容瓶中；
用专用的移液管分别移取微量元素母液10ml，铁盐母液10ml，有机物母液10ml，均加入该定容瓶中。
再用蒸馏水定容至刻度，摇匀。
取3/1至1/2液体培养基移入白瓷缸中，称取琼脂丝7－9g和蔗糖30g放入白瓷缸中，
2.2加热通电加热，烧开后改用文火，至琼脂全部融化，透澈见底为止。
2.3调整PH值从电炉上取下冷却后，用0.1N的NaOH或0.1NHCl调整pH值为5.8。
2.4培养基的分装搅拌均匀后，分装到三角瓶中，每瓶约25-30ml，即1升培养基分装40-35瓶，最后用封口塑料膜包上瓶口，用线绳扎口，写上标号。
思考题：
1简述培养基母液的配制方法和步骤
20.5mg/ml的NAA配制要求配100ml。
3某培养基为MS+BA2mg/l+NAA0.2mg/l,问：
如果做2升，应加激素各为多少毫升？
（BA母液为0.5mg/ml，NAA为0.5mg/ml）。
训练二灭菌技术
1知识目标：
理解有菌和无菌的范畴；
熟练掌握组织培养相关的灭菌方法
2技能目标：
学会处理各种外植体的方法和操作流程；
了解高压蒸汽灭菌的基本原理，学习高压蒸汽灭菌的操作方法。
二、设备仪器与试剂
高压灭菌锅、配制好的培养基
三、训练内容
（一）基础知识
1灭菌与消毒的概念
灭菌：
用物理或化学方法，杀死物体表面和孔隙内一切微生物或生物体，即所有生命的物质全部杀死。
消毒：
杀死、消除或抑制部分微生物，使之不发生作用。
加入灭菌液的0．5％，即在100ml加入15滴。
2常用的灭菌方法：
可分为物理的和化学的两类。
2.1培养基用湿热灭菌
培养基在制备后的24h内完成灭菌工序，压力表上升达到0．1MPa时，开始计时，维持压力0.1～0.15MPa，20min。
对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。
洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20-30min。
注意高压灭菌后培养基pH值的变化及回复动态。
如高压灭菌后的pH值常由5．80升高至6．48。
而96h后又回降至5．8左右。
这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握。
2．2灼烧灭菌
浸入95％的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。
冷却后，立即使用。
2.3干热灭菌
干热灭菌是利用烘箱加热到160-180℃杀死微生物。
由于在干热条件下，细菌营养细胞的抗热性大为提高，接近芽孢的抗热水平，通常采用170℃持续90min来灭菌。
物品工具等要妥为包扎。
包扎可用耐高温的塑料。
物品的数量不宜过多，以免妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。
2.4不耐热的物质采用过滤灭菌
一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，采用过滤灭菌方法。
防细菌滤膜的网孔的直径为0．45um以下，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；
液量小时，可用注射器。
2.5紫外线和熏蒸灭菌
（1）紫外线灭菌
利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。
紫外线的波长为200-300nm，其中以260nm．的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌；
而且要求距照射物以不超过1．2m为宜。
（2）熏蒸灭菌用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。
这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。
2.6化学试剂消毒
它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。
常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按5-8m1／m3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g／m3高锰酸钾氧化挥发。
熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。
冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。
2.7植物材料表面用消毒
（二）训练项目
培养基和实验材料的高压蒸汽灭菌
1基本原理
待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：
一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；
二是湿热的穿透力比干热大；
三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kl（千焦）的热量。
这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。
灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见表1。
表1灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系
压力数
全部空气排出时的温度（℃）
2/3空气排出时的温度（℃）
1/2空气排出时的温度（℃）
1/3空气排出时的温度（℃）
空气全不排出时的温度（℃）
千克（公斤/厘米2）
（kg/㎝2）
磅/英寸2
（lb/in2）
0.35
0.70
1.05
1.40
1.75
2.10
15
20
30
108.8
115.6
121.3
126.2
130.0
134.6
109
115
121
126
130
94
105
112
118
124
128
90
72
一般培养基用1.05㎏/㎝2，121.3℃15—30分钟可达到彻底灭菌的目的。
灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。
例如含糖培养基用0.56㎏/㎝2（8磅/英寸2），112.6℃灭菌15分钟，但为了保证效果，可将其他成分先行121.3℃，20分钟灭菌，然后以无菌操作加入灭菌的糖溶液。
又如盛于试管内的培养基以1.05㎏/㎝2，121.3℃灭菌20分钟即可，而盛于大瓶内的培养基最好灭菌30分钟。
2操作步骤
1．首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。
2．放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。
注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。
三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入。
3．加盖，将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。
再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
4．通电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。
待冷空气完全排尽后，关上排气阀，使锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。
当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。
本实验用1.05㎏/㎝2，121.3℃，30分钟灭菌。
5．灭菌所需时间到后，切断电源使灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。
如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。
6．将取出的灭菌培养基放入于平整台面上冷却，即可待用。
思考题
1．高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？
灭菌完毕后，为什么要待压力降到0时才能打开排气阀，开盖取物？
2．在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素？
训练三无菌操作技术
一训练目标
学会处理各种外植体的方法和操作流程。
通过材料的表面消毒，初步掌握外植体的常规表面消毒技术；
通过在超净工作台上进行无菌操作训练，掌握组织培养的无菌操作技术。
二材料与用具：
各种种子、超净工作台、70%酒
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