弓形虫IgMWord下载.docx
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12.2敏感性和特异性
12.3亲和性测试
13.有效期
14.警告
13.1警告和安全措施
13.2废料处理
15.参考文献
16.制造商名称、地址及联系方式
弓形虫IgM抗体定量检测试剂盒（酶联免疫法）
赛润ELISAclassic
酶联免疫法测定人体抗体（IgM）
-只限用于体外诊断-
通用名：
弓形虫IgM试剂盒（定量）
英文名：
ToxoplasmagondiiIgM（quant.）
商品名：
赛润ELISAclassic弓形虫IgM抗体定量检测试剂盒（酶联免疫法）
汉语拼音：
SerionELISAclassicGongxingchongIgMkangtidingliangjianceshijihe（meilianmianyifa）
产品编号:
ESR110M
检测评估标准:
DadeBehringBEP®
III/BEP®
2000,DSX,手动操作
2.用途
用于定性和/或定量检测人血清或血浆中的抗弓形虫抗体。
赛润ELISAclassic弓形虫IgM抗体定量检测试剂盒主要用于定性和/或定量检测人血清或血浆中的抗弓形虫抗体，以测定免疫状态，以及确定急性感染。
IgG-ELISA试剂盒是用于弓形虫抗体的筛查试验。
配合Serion（赛润）弓形虫亲和性试剂（货号：
B110AVID）使用可以测定IgG-抗体的亲和性。
另外，IgM-ELISA试剂盒适合用于新生儿的筛查，也就是说通过检测新生儿血液的滤纸干血片的IgM抗体来进行诊断。
弓形虫是一种真核生物病原体，属于孢子虫纲。
这种必须寄生在细胞内的寄生虫散播在世界各地，其孢囊繁殖的特点是能够在有性繁殖（只有在最终宿主猫科动物中才会进行有性繁殖）和无性繁殖之间转化。
弓形虫经口进入体内（如食用被污染的食物）后，会穿透肠道进入网状内皮系统，它能通过血液传播，感染宿主体内许多不同的器官和组织。
弓形虫在正常人群中的传播与年龄有密切的关系，50岁的人群中血清阳性率接近50%，年龄每增长10岁，弓形虫抗体的血清阳性率就会以10%的幅度增加。
环境和营养因素也有很重要的意义，可以对弓形虫的血清阳性率产生显著的影响。
弓形虫感染后，大约50%的人没有临床症状，而另外50%的感染者经过1-3周的潜伏期后，只有一些非特异性症状如低烧、疲乏、头痛、肌肉和关节痛；
少数病人会出现高烧（至39℃）和颈部淋巴结肿大。
据报道儿童和未成年人感染后有1%的病人还会出现并发症如心肌炎、脑膜炎或肺炎等。
患者康复后，弓形虫细胞会在感染组织中持续存在并形成胞囊，能阻挡机体免疫系统的攻击。
这就是通常所说的潜伏期，在免疫力正常的宿主体内不被激活。
或许由于抗原的存在对机体产生长期的刺激，使机体获得终生免疫力。
孕妇弓形虫感染的筛查是有重大意义的。
有关研究表明：
弓形虫通过胎盘传播在怀孕的各个阶段都有可能发生，但产前传播和感染率的高低与怀孕的不同阶段有密切关系。
1.第1-3个月17%（最常见的是流产,很少对胎儿造成严重伤害）
2.第4-6个月24%（会对胎儿造成中级或严重的伤害）
3.第7-9个月64%（会对胎儿造成轻度伤害或晚期对胎儿有致命性伤害）
初期感染但血清学检测呈阴性的孕妇，通过胎盘传播感染胎儿的风险较低，据报道在德国新生儿的感染率为2-7‰。
因为一次感染以后，弓形虫IgM抗体很可能持续存在数月或者数年，所以很多时候检测出病原体特异性的IgM-抗体，并不意味着存在妊娠相关的弓形虫现行感染。
针对带有阳性弓形虫IgM抗体的血清，亲和性测定可以实现新近初期感染的继续鉴定，因为高亲和性弓形虫IgG抗体的前提是更长的既往感染点。
仅有1-3%的被感染新生儿会立即出现弓形虫病的临床症状，但在约80%的无症状（被感染的）新生儿中，部分会出现严重后期伤害。
赛润ELISA刚地弓形体IgM检测可以有效地对无证状的新生儿进行筛查。
该实验通过检测新生儿的滤纸干血片来实现（见赛润新生儿弓形虫检测说明书）。
在新生儿体内检测到病毒特异性IgM抗体即表示婴儿已被该种病原体子宫内感染或者急性感染，，因为母体的IgM抗体基于其体积过大不可能通过胎盘传输。
针对弓形虫感染可对被感染的新生儿进行及时的治疗，以避免继续的后期伤害。
直到怀孕前两周感染弓形虫都会形成免疫。
在计划怀孕时，在怀孕前进行一次血清学检测是非常有意义的。
母亲首发感染发现后直接治疗，可使胎儿被感染的风险降低75%。
机体出现自然的或有医疗引发的免疫抑制后，潜伏期感染会被激活。
在艾滋病人群中，弓形虫脑炎已成为最关键的、也是最终的致死病因。
甚至近期有报道显示：
弓形虫感染会随免疫抑制的出现而相继发生。
本说明书除弓形虫IgM抗体定量检测的内容外，还涉及到IgG抗体的定量检测，以及对结果的分析等。
5.赛润ELISAclassic-检验原理
用抗原包被微量板孔，制成固相载体。
加患者血清到板孔中，其所含的抗体特异性地与固相载体中存在的抗原结合，形成免疫复合物。
除去多余物质后，加入碱性磷酸酶标记的IgG和IgM抗体，使之与上述免疫复合物反应。
洗板，除去多余的结合物，加入底物（对硝基苯磷酸盐）。
其与酶结合的免疫复合物反应，产生有颜色产物，颜色强度与特异性抗体含量成正比。
6.试剂盒的组成
试验成分
IgG试剂盒IgM试剂盒
数量/容积
微孔条（此微孔条可拆下单独使用，每条有8孔，共96孔，已经包被了抗原）
1个微孔条框架
包被的抗原为灭活抗原
1212
标准血清（立即可用）
人血清溶于含蛋白的磷酸盐缓冲液；
抗HIV抗体、抗乙肝病毒（HBV）表面抗原和抗丙肝病毒（HCV）抗体均为阴性；
防腐剂：
<
0.1%叠氮化钠
染色剂：
紫红色O
2×
2毫升2×
2毫升
阴性对照血清（立即可用）
里沙明绿V
1×
2毫升1×
酶标记的抗人IgG,IgM（立即可用）
羊抗人IgG,IgM（多克隆），标记碱性磷酸酶后在蛋白稳定剂中储存。
防腐剂:
0.01%g甲基异噻唑啉酮
0.01%溴化硝基二垩烷
13毫升13毫升
浓缩洗液（可稀释至1000毫升）
氯化钠溶液，含吐温20和30mMTris
33.3毫升1×
33.3毫升
稀释缓冲液
磷酸盐缓冲液，内含蛋白和吐温20
0.01克/升的溴酚蓝钠盐
50毫升2×
50毫升
终止液
1.2N氢氧化钠
15毫升15毫升
底物（立即可用）
邻硝基苯磷酸盐，不含其它溶剂的缓冲液
0.1%的叠氮化钠
（未开封瓶子中的底物可能会轻微变黄，但不会影响其质量）
带有标准曲线和评估表的质量控制文件
（抗体以IU/毫升或U/毫升计量）
11
7.其它检测所需物质
-普通实验室所需的仪器装置
-IgM检测：
另需赛润含对照抗原的类风湿因子Rf－吸附剂（Rf－吸附剂／对照抗原；
产品编号T200/20ml）
-分光光度计，波长405纳米，建议参考波长范围620纳米-690纳米（例如650纳米）
-37℃温箱
-湿盒
-蒸馏水。
8.储存及稳定性
试剂
储存
稳定性
微孔条
（包被抗原）
开封后放在2-8℃装有干燥剂的密封铝箔袋中。
4星期
阴性对照/标准血清
开封后保存于2-8℃。
有效期内；
24个月
酶标记抗体
立即可用的溶液于2-8℃储存。
避免污染（使用无菌枪尖）。
有效期内
28个月
开启后于2-8℃储存。
有絮状沉淀时丢掉
未开封
36个月
洗涤液
浓缩液开封后保存于2-8℃。
工作液在2-8℃。
工作液在室温下。
盛过工作液的瓶子应按常规方法清洗，并丢弃混浊溶液。
2星期
1星期
底物
2-8℃储存，避光。
当溶液变为黄色时应予以丢弃（水作空白，吸光度大于0.25时）。
开封后保存于室温下。
只有全部使用赛润ELISAclassic试剂才能保证检测效果，因为所有试剂都是有关联的，不能混用其他制造商的产品。
尤其是标准血清，对照血清以及酶标记物，必须使用试剂盒配备的，不要使用其它批号产品。
稀释缓冲液，洗液，终止液和底物溶液可用于所有赛润ELISAclassic试剂盒。
针对每一个免疫球蛋白种类都有三个不同的酶标记物浓度：
低、中、高。
酶标记物的分级通过以下的标志在标签上显示：
比如：
IgG+低浓度IgG酶标记物
IgG++中浓度IgG酶标记物
IgG+++高浓度IgG酶标记物
为了保证我们试剂盒的惯常质量，在极少数情况下需要使用特殊酶标记物。
这些试剂盒中的酶标记物会有一个特殊批号并且不用“+”标志。
因此，这些特殊酶标记物是不可以和其它酶标记物交换使用的。
请您每次都注意标签上的标注！
ELISAclassic试剂盒内所有试剂均必须正确地存放。
应在未开封的情况下，保存于2-8℃，并在有效期（见标签说明）内使用。
详细的稳定性和储存资料在“6.储存及稳定性”内将加以详述。
每一种试剂都是经过校准以保证最佳的检测结果。
这些试剂如果经过稀释或改动都会导致检测的敏感性的降低。
在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。
所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。
如果铝袋破损或者已开启装有干燥剂的铝袋而未以夹子封紧的，则不要继续使用微孔条。
请从标记处剪开密封袋。
开始试验前，将所有试剂置于室温。
从试剂管中吸取试剂的时候，应注意使用无菌技术以防污染。
为避免假阳性结果，吸加酶结合物时，，吸头应确保不接触孔壁或喷洒于小孔的外面，注意不要盖错瓶盖或管盖。
试验中试剂的充分混合，对于检测结果的重复性至关重要。
在取用对照品和酶标记物之前应摇动容器使其充分混匀，加样前，使用单向振动器充分混匀稀释过的标本。
小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。
请注意在吸取标本/对照血清，酶结合物或底物时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。
只有严格遵守赛润ELISAclassic试剂的试验说明才会得到最佳的检测结果。
如果实验中未严格遵守控制质量控制认证文件上的有效性特异准则，则试验结果无效。
洗涤不充分将影响试验结果：
应该小心进行洗涤。
洗涤步骤应遵守相关洗涤器（平底孔，孔直径7毫米，深10.9毫米）指导手册进行，所有的孔内均应加入相同体积的洗涤缓冲液。
洗涤结束时，应将微孔板倒扣于纸巾上并轻轻敲打，以确保所有孔内均无洗涤缓冲液。
避免产生泡沫！
如果使用自动洗板机，注意正确操作。
9.2检验前的准备工作和储存
避免使用高血脂、溶血或黄疸的标本，尽管在我们的检测中没有发现有副影响。
明显被污染的标本（血清或血浆）不能用于检测。
依照标准实验室方法采集血清或血浆标本（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝）
标本不应加热灭活。
9.2.1样品准备
赛润ELISAclassic弓形虫IgG
开始试验前，患者的待测样品必须以稀释缓冲液稀释如下（V1+V2）：
V1+V2=1+100加10微升患者待测样品
于1000微升稀释缓冲液
稀释后及加入微孔板前，样品必须充分混匀。
赛润ELISAclassic弓形虫IgM
类风湿因子的干扰的排除
类风湿因子抗体是IgM型的自身抗体，可与IgG免疫复合物结合。
非特异性类风湿因子抗体的存在将导致IgM检测的假阳性结果。
另外，也存在弱结合的病原体特异性IgM抗体被强结合的IgG抗体取代的可能性。
在这种情况下，IgM的检测将得到假阴性的结果。
因此，在进行IgM检测前应用类风湿因子吸附剂对血清作预处理。
特别类风湿因子Rf—吸附剂（产品编号T200,20ml）不仅包含抗人IgG抗体，还含有一定量的对照抗原。
对照抗原同时能与类风湿因子及可识别宿主细胞膜成份的抗体结合。
因此，无须再进行微量孔包被对照抗原的平行试验。
在进行以下SERIONELISAclassicIgM检测时，此类RF—吸附剂需作为附加试剂另行购买:
巨细胞，单纯疱疹病毒，麻疹，腮腺炎，风疹病毒，弓形虫，带状疱疹病毒
首先应该使用稀释缓冲液（V2）对类风湿因子吸附剂（Rf-吸附剂/对照抗原）（V1）进行如下稀释：
V1+V2=1+4加200微升Rf-吸附剂/对照抗原
于800微升稀释缓冲液中
然后将患者的待测样品（V1）在此Rf-稀释缓冲液（V3）中进行稀释：
V1+V3=1+100加10微升患者待测样品
于1000微升Rf-稀释缓冲液中
9.2.2样品储存
密封的患者样品可在冰箱中2-8℃保存7天。
≤-20℃可保存更久。
避免样品反复冻融。
已稀释的样品可在2-8℃下保存一星期。
9.3试剂盒反应试剂的准备
9.3.1微孔条
微孔条排列于板中，并与干燥剂一同封于铝袋内。
未使用的微孔条重新放入铝袋，密封好，确保铝袋的密封性。
9.3.2对照血清/标准血清
对照和标准血清可直接使用，不必进一步稀释
每次试验或是试验体系，无论检测用的微孔板数目多少，均应包括空白对照孔，阴性对照孔和标准血清孔，且标准血清应加两孔。
不要用RF吸附剂处理对照血清！
9.3.3抗人IgG或IgM抗体，用AP标记（备用）
禁止将不同试剂盒的酶标抗体混合使用。
同一试剂盒才能达到最佳检测效果。
为了避免酶标记物的污染（请使用时先一次性取出实验所需量置于一容器中，避免反复从试剂瓶中吸取试剂。
）
9.3.4洗液
以1：
30稀释浓缩洗涤缓冲液（V1）至终体积V2。
例如：
浓缩缓冲液（V1）
终体积（V2）
1000毫升
1.0毫升
30毫升
9.3.5样品的稀释缓冲液（即用）
9.3.6底物（即用）
必须以无菌枪尖吸取底物溶液！
9.3.7终止液（即用）
9.4检测程序概要
样品稀释液（患者样本）
1+100
将稀释的样本，和立即可用的对照血清/标准血清，加
到微量孔内（100微升）
孵育60分钟/37℃
湿盒中
洗涤
加入已立即可用的酶标记抗体溶液（100微升）
再孵育30分钟/37℃
加入底物溶液（100微升）
加入终止液（100微升）
在405纳米处读数
9.5检测过程
9.5.1将检测所需数目的微孔条放到微孔板框上并准备好一张草签。
9.5.2在微量孔内分别加入100微升的已稀释样本或立即可用的对照血清。
留一个孔为底物空白使用，例如：
定量的IgG/IgM
微量孔
孔A1
孔B1
孔C1
孔D1
孔E1
底物空白
阴性对照
标准血清
标本1......
9.5.3将样品放于湿盒内37℃（±
1℃）孵育60分钟（±
5分钟）。
9.5.4孵育后以洗液缓冲液洗涤板孔（使用自动洗板机或手工洗板）：
-吸去或甩去洗液
-每孔内加入300微升洗液
-重付息涤过程3次（共4次！
-将微孔板翻转过来在纸巾上拍打，使微孔中不再含有液体
9.5.5加入酶标记抗体。
于适当孔内（底物空白除外）加入100微升IgG/IgM酶标记抗体
9.5.6湿盒内37℃（±
1℃）孵育30分钟（±
1分钟）＊。
9.5.7孵育后，以洗液清洗板孔（洗涤见上）
9.5.8加入底物
于每孔内加入100微升底物溶液（包括底物空白孔）
9.5.9湿盒内37℃（±
注意：
根据各实验室条件的特殊性，有必要对孵育时间进行调整。
9.5.10终止反应
每孔内加入100微升终止液，轻微振荡微孔板以混合溶液。
9.5.11读取消光度
以底物空白为空白对照液，60分钟内读取405纳米的OD值，建议参考波长范围为620纳米-690纳米（例如650纳米）。
10.检测结果评估
赛润ELISAclassic弓形虫IgG/IgM抗体（定量）检测
10.14PL单点定量法
通过利用非线性方程，可以保证根据消光信号的定量数值精确计算出抗体活性，该方程可在不对OD值进行转换的情况下调整S型曲线。
用赛润ELISAclassic试剂检测，抗体浓度可通过逻辑对数模型（4PL,4个参数）来计算，该模型对浓度曲线有很精确的适用性。
计算公式如下：
OD=A+
D-A
1+eB（C-lnconc.）
参数A、B、C和D能够反映曲线的精确形状。
1.下端渐进线参数A
2.曲线斜率参数B
3.转折点参数C
4.上端渐进线参数D
标准曲线是由德国维润赛润研发有限公司（维尔茨堡市）在严格条件下经过多次试验制定的。
使用者无需花费大量的时间和使用昂贵的仪器来制作标准曲线。
每一个试剂盒内均附有专用的标准曲线和评估表用来计算抗体浓度。
如有需要也可取得相关的评估软件。
为了校正正常试验偏差和建立试验对照，每轮试验均需使用标准血清作为对照。
该对照血清的有效范围参考值是由厂商的质量控制部门确定的，在此范围内可保证抗体浓度测定的正确性。
标准血清不一定是阳性对照，且在某些ELISA试验中标准血清数值可能是临界值或阴性结果。
10.2有效性标准
- 底物空白的OD<
0.25
- 阴性对照必须为阴性
- 赛润ELISAclassic定量试验：
标准血清的平均OD值必须在有效范围内，此范围在试剂盒的特异性质量控制认证书上给定（减去底物空白之后！
阳性对照的平均OD值必须在有效范围内，此范围在试剂盒的特异性质量控制认证书上给定（减去底物空白之后！
-OD值的变化不能超过20%
如果未达到以上标准，试验无效且必须重做。
10.3赛润ELISAclassic弓形虫IgG/IgM的定量计算
抗体活性的计量单位是IU/ml，其中IgG抗体单位IU/ml采用的是1980年的第2版弓形虫国际标准：
2000国际单位/安瓶，而IgM抗体单位IU/ml采用的是1994年的第3版弓形虫国际标准：
3000国际单位/安瓶。
这个IgM国际单位至今还没有被接受，所以赛润ELISA弓形体IgM抗体结果单位为：
U/ml。
10.3.1非自动评估
每个试剂盒内均备有一个标准曲线和一个评估表，因而每一个OD值都可得到一个抗体活性值。
标准血清的参考值和有效范围已在评估表格（质量控制证书）中给定。
所有的OD值在求值前必须先减去空白（A1）.
方法1：
定性评估
为确定临界值范围，请将已测得的标准OD平均值与质量控制证书上给出的数据相乘（见专用公式），例如：
OD=0.502xMW（STD）临界值上限
OD=0.352xMW（STD）临界值下限
如果得到的标准血清的平均消光度值是0.64,那么临界值的范围即为0.225-0.321。
方法2：
利用标准曲线进行抗体活性的连续求值。
测定间差异（指不同时间的检测差异和不同实验室的检测差异）可用校正系数F与当前测定数值相乘进行校正。
校正系数的计算公式为：
F=
（标准血清）OD参考值
（标准血清）当前测量OD值
用户利用专用的标准曲线对检测试验的偏差进行校正是非常必要的。
首先，不同日期检测之间的差异可通过计算校正系数F进行校正。
1.计算标准血清的两次OD值的平均值，并确认是否在有效范围内。
2.校正系数“F”的计算：
用给定的参考数值除以标准血清两次消光数的平均值。
F=标准血清的参考消光数值/标准血清消光数的平均值
3.将测得的所有病人血清的消光数值与校正系数“F”相乘。
4.用经过校正的消光数值在标准曲线“U/ml或IU/ml”坐标轴上确定对应的抗体活性。
赛润ELISAclassic弓形虫IgG抗体活性的计算：
阳性结果:
>
20IU/ml
临界值结果:
10-20IU/ml
阴性结果:
<
10IU/ml
赛润ELISAclassic弓形虫IgM抗体活性的计算：
350IU/ml
300-350IU/ml
300IU/ml
针对临界值结果的样品，应在1-2周后对相应的病人再进行取样，重新检测。
10.3.2利用SERIONeasybase4PL软件/SERION评估软件进行自动评估
输入四个参数和标准血清参考值之后，联机软件就会计算出抗体活性。
如果标准血清的消光值超出有效范围，SERIONeasybase4PL软件就会出现如下信息：
“标准已超出允许范围”和/或“标准差异大于20%”。
SERION评估软件只用英语显示：
„Standardvaluesoutofrangesinfollowinggroups:
Group1-24.Standardvaluediffermorethan20%infollowinggroups:
Group1-24.”（“以下组样品标准值超出范围：
组1-24。
以下组样品标准值差异大于20%：
”）
在这种情况下，此轮试验无效，
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