微生物检验临床标本微生物学检验概述Word文档下载推荐.docx

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　　（五）临床意义

　　葡萄球菌菌血症常由疖、痈、脓肿及烧伤创面等原发感染灶继发，也可由呼吸道感染引起。

一些革兰阴性杆菌主要侵犯、危及机体免疫功能低下的病人。

耐药菌株不断增加。

厌氧菌的菌血症常合并需氧菌感染，临床症状较重而复杂。

L型菌的菌血症主要由于使用抑制细菌细胞壁合成的抗生素后，由缺损细胞壁的细菌感染所致。

免疫低下者常出现真菌菌血症。

院内感染菌血症不断上升。

　　三、中枢神经系统感染

（一）常见病原菌　　　　　见表5-34-2

　　用药前，无菌操作腰穿方法采集2～3ml，盛于无菌试管常温下立即送检。

天冷时保温，不可冰箱保存。

用于病毒检测时应冷藏送检。

　　（三）检验方法

　　1.涂片镜检：

离心3000rpm／min，15分钟。

　　革兰染色（一般细菌）、抗酸染色（分枝杆菌）、墨汁染色（隐球菌）、电镜检查（病毒颗粒）。

　　2.分离培养：

5g／L葡萄糖增菌肉汤、血平板、中国蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板、巧克力平板。

结核菌接种罗-琴培养基或米氏7H10培养基。

真菌培养接种沙氏培养基。

病毒培养常用动物接种、鸡胚接种、细胞培养。

　　3.血清学检测可直接检测抗原。

　　（四）临床意义

　　细菌性脑膜炎是中枢神经系统感染的常见类型。

真菌性脑膜炎最常见于隐球菌脑膜炎，其他的真菌性脑膜炎如白假丝酵母、球孢子性脑膜炎日渐增多，特别是免疫功能低下和恶性疾病患者易发。

流行性乙型脑炎可获得持久免疫力，再次发病者极少见。

肠道病毒对中枢神经系统的危害性逐渐引起人们的关注和重视。

　　四、呼吸道感染

　　呼吸道按解剖结构分为上呼吸道和下呼吸道。

上呼吸道感染主要指喉及喉以上的呼吸道感染。

下呼吸道感染主要指气管、支气管和肺的感染。

（一）上呼吸道的正常菌群　　　　　见表5-34-3

（二）常见病原菌　　　　　　见表5-34-4

　　（三）标本采集

（1）上呼吸道常采用鼻咽拭子，用可弯曲的拭子，在鼻咽腔转动数次采集标本，置运输培养基中送检。

在扁桃体部位、咽后壁及口腔内炎症、溃疡或渗出部位采样时，应先用清水漱口，再采集标本。

（2）下呼吸道常采用自然咳痰法、支气管镜采集、胃内采集、咽拭子。

清晨第一口痰为宜，最好在用抗菌药物前采集，必须先用清水漱口，避免唾液混入。

立即送检。

　　（四）检验方法

　　1.涂片：

检查细菌常用革兰染色、抗酸染色。

检查隐球菌采用墨汁染色，军团菌、支原体、病毒等可用免疫荧光抗体染色。

　　痰涂片革兰染色还可用于判定痰标本的质量。

合格的痰标本应是含白细胞、脓细胞和支气管柱状上皮细胞较多，而受污染的痰标本则是来自颊黏膜的扁平上皮细胞较多。

　　以白细胞>

25个／低倍视野，而鳞状上皮细胞<

10个／低倍视野为合格标本。

　　2.分离培养

（1）痰标本的前处理一般是用无菌生理盐水将痰洗净，再加入胰酶溶液使痰均质化。

（2）普通细菌培养采用血平板、中国蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板、巧克力平板。

其他细菌、真菌和病毒的培养选用相应的培养基，具体见前面相关章节的内容。

　　下呼吸道的痰在咳出时常会带有口腔的正常菌群，故注意采集合格的下呼吸道标本，以提高检出率和阳性的正确率。

在医院感染中，一些条件致病菌和耐药菌成为医院内肺炎的主要致病菌。

真菌性肺炎多为条件致病性真菌感染，常见的以白假丝酵母为主。

　　五、尿路感染

　　可分为上尿路感染（主要有肾盂肾炎）和下尿路感染（主要有膀胱炎和尿道炎）。

（一）常见病原菌　　　　　见表5-34-5

　　1.采集时间：

一般为晨起第1次尿送检；

原则上在应用抗菌药物之前收集。

　　2.采集方法：

清洁中段尿；

肾盂尿采集法；

膀胱穿刺法；

导尿法。

最好用导尿管收集尿液，但要防止逆行性感染。

目前常采用中段尿，采集标本前要用肥皂水或碘伏清洗外阴（女性）或阴茎头（男性）。

必要时采取膀胱穿刺法收集尿液。

如作结核杆菌检查，可收集晨尿（连续三次）。

　　3.注意事项：

严格进行无菌操作，尽量避免污染菌，立即送检，不超过1小时，尿中不得加任何防腐剂和消毒剂。

　　（三）分离培养

普通细菌选用血平板、中国蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板。

特殊细菌使用特殊、选择培养基。

如L型菌-高渗、结核菌-罗氏培养基、淋菌-巧克力平板、Thayer-Martin培养基。

　　2.尿细菌定量培养

　　（四）结果报告

　　1.阴性：

一般细菌48小时无细菌生长。

　　2.阳性：

菌落计数、鉴定及药敏结果。

革兰阴性杆菌>

105cfu／ml，革兰阳性球菌>

104cfu／ml，有诊断意义。

细菌数<

104cfu／ml，多为污染。

104cfu／ml～105cfu／ml，可疑阳性。

　　3.尿路感染的细菌数少于105cfu／ml时多见于以下几种情况：

①应用抗菌药物，尿中细菌发育受到抑制；

②使用低敏感性药物，大多数细菌停留在104cfu／ml；

③尿浓度变化大时及pH在5.0以下8.5以上，则发育受阻；

④尿频时；

⑤病原菌发育要求条件高时；

⑥采尿时外阴部消毒剂混入尿中。

　　六、消化道感染

　　消化道感染常见于细菌性痢疾，细菌性食物中毒，消化道溃疡，胃肠炎等。

（一）常见病原菌　　　　见表5-34-6

（二）标本采集与运送

急性期、尽量在用药前采集。

自然排便采集法、直肠拭子。

取含脓血或粘液的粪便置清洁容器中送检。

排便困难者，可用直肠拭子采样。

标本不能及时接种时，应在标本中加保护剂或用相应的运输培养基。

传染性腹泻病人，一般应连续作三次培养以明确诊断，治疗后亦应连续作三次培养，以明确治疗效果。

　　普通致病菌如沙门菌、志贺菌等可选用SS琼脂平板、中国蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板。

特殊细菌如弯曲菌、弧菌、厌氧菌等选择相应的选择性培养基。

病毒可用细胞培养。

　　感染性腹泻由多种病原体感染所致。

消化性溃疡由幽门螺杆菌感染引起。

轮状病毒常引起幼儿腹泻，腺病毒是引起儿童腹泻的主要病原，还可引起成人腹泻，埃可病毒常引起婴幼儿腹泻；

Norwolk病毒常感染成人和大龄儿童。

　　七、性传播疾病

　　性传播疾病是指以性行为为主要传播途径的一组传染病。

（一）常见性传播疾病及其病原体

性传播疾病

病原体

梅毒

梅毒螺旋体

淋病

淋病奈瑟菌

软下疳

杜克嗜血杆菌

性病淋巴肉芽肿

沙眼衣原体性病淋巴肉芽肿生物亚种

细菌性阴道病

阴道加德纳菌和类杆菌等厌氧菌

非淋菌性尿道炎

沙眼衣原体沙眼生物亚种、支原体

尖锐湿疣

人乳头瘤病毒

生殖器疱疹

人类单纯疱疹病毒2型

　　一般用拭子取尿道脓性分泌物（男性）或宫颈分泌物（女性），供培养及镜检；

梅毒病人取皮肤渗出液和淋巴穿刺液涂片；

疱疹抽取疱内液体，或刺破小疱后，用无菌拭子采样。

　　参见前面相应章节。

　　八、创伤和外科感染

（一）常见病原菌　　　　见表5-34-7

　　组织创伤用拭子采取标本，创伤范围大时，应多部位采集标本送检；

施行清创术时，可选择合适部位采集标本送检；

骨髓炎病人应取骨髓活检标本，如损害部位已形成窦道，可采取窦道引流液；

脓肿时取内部脓汁及脓肿壁标本。

　　（三）临床意义

　　由创伤、手术、侵人性器械操作等外科治疗引起的感染最为常见。

感染以化脓性炎症改变为主。

外伤性创伤感染以葡萄球菌和链球菌多见，放线菌、结核分枝杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌也常见，且易发生混合感染。

深部创伤易引起破伤风和气性坏疽。

　　烧伤创面以革兰阴性杆菌最常见，次为革兰阳性球菌感染。

急性化脓性骨关节炎常由金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、淋病奈瑟菌感染所致。

慢性化脓性骨关节炎、慢性骨髓炎常由结核分枝杆菌引起，葡萄球菌、链球菌也常见。

放线菌多引起内源性感染。

　　本章练习题：

　　引起肺部感染的病原菌中，能从痰标本检出的有

　　A.金黄色葡萄球菌

　　B.肺炎链球菌

　　C.肺炎克雷伯菌

　　D.结核分枝杆菌

　　E.肺炎支原体

[答疑编号500735340101]

　　『正确答案』ABCDE

　　标本采集和处理的基本要求包括

　　A.抗菌药物治疗前采集标本

　　B.根据病原微生物感染特点，采集不同部位标本送检

　　C.无菌操作，采集标本时需先消毒

　　D.应用无菌容器收集标本，立即送检

　　E.检材容器贴上患者姓名、标本名称等项目的标签

[答疑编号500735340102]

　　『正确答案』ABCDE

　　性传播疾病应采集的标本是

　　A.脑脊液

　　B.胸水、腹水

　　C.心包液、滑囊液

　　D.尿道脓性分泌物（男性）

　　E.宫颈分泌物（女性）

[答疑编号500735340103]

　　『正确答案』DE

　　根据目的不同临床采集的标本包括

　　A.尿液

　　B.粪便

　　C.血液

　　D.鼻咽拭子

　　E.脑脊液及其他体液

[答疑编号500735340104]

第三十五章　细菌对药物的敏感试验

1.临床常用抗菌药物简介

（1）临床常用抗菌药物分类及作用原理

（2）抗菌药物选择原则

2.需氧菌和兼性厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验

（1）KB法、稀释法试验原理

（2）KB法、稀释法试验方法

（3）KB法、稀释法试验结果解释

（4）KB法、稀释法试验影响因素

（5）杀菌试验

（6）体外联合药敏试验

3.其他菌的体外抗菌药物敏感试验

（1）厌氧菌体外药敏试验方法

（2）结核分枝杆菌体外药敏试验方法

（3）真菌体外药敏试验方法

4.体内抗菌药物的活性和浓度测定

（1）原理

（2）方法

5.耐药菌株的监测（ESBLs、MRS、HLAR、VRE、PRP、AmpC酶）

（1）耐药机制

（2）耐药表型检测方法

（3）耐药菌抗生素应用原则

第一节　临床常用抗菌药物简介

　　一、临床常用抗菌药物简介

表5-35-1临床常用抗菌药物

抗生素分类

代表药物

作用机制

青霉素类　

不耐受β-内酰胺酶：

氨苄西林、哌拉西林、替卡西林、青霉素G耐β-内酰

阻断细菌细胞壁肽聚糖的合成

头孢菌素

一代：

头孢噻吩、头孢咗啉

二代：

头孢呋辛

三代：

头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢哌酮

四代：

头孢吡肟

阻断细菌壁肽聚糖的合成

其他β-内酰胺类

单环β-内酰胺类：

氨曲南

碳青霉烯类：

亚胺培南、美洛培南

β-内酰胺酶抑制剂

头霉素类：

头孢西丁、头孢替坦棒酸、他唑巴坦、舒巴坦　　　　　　

与β-内酰胺酶有较高的亲全性以竞争性和不可逆的抑制方式发挥作用

氨基糖甙类

庆大霉素、链霉素、阿米卡星、妥布霉素、奈替米星

与细菌核糖体30S小亚基不可逆结合，抑制mRNA的转录和蛋白合成

喹诺酮类

诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、左旋氧氟沙星

作用于DNA旋转酶，干扰DNA的复制、修复和重组

大环内酯类

红霉素、克拉霉素、阿齐霉素、罗红霉素

可逆结合细菌核糖体50S大亚基抑制蛋白合成，阻止肽链延长

林可酰胺类

克林霉素

结合细菌核糖体50S大亚基，抑制蛋白合成，阻止肽链延长

四环素类

　四环素、强力霉素、米诺环素

结合细菌核糖体30小亚基，抑制蛋白合成，阻止肽链延长

氯霉素类

氯霉素

磺胺类及增效剂

复方磺胺甲

唑

增效剂：

甲氧苄胺嘧啶

磺胺类竞争结合二氢叶酸合成酶增效剂结合二氢叶酸还原酶，抑制细菌生长

硝基呋喃类

呋喃妥因、呋喃唑酮

干扰细菌的氧化还原系统，阻断细菌的代谢

糖肽类

万古霉素、替考拉宁

　　二、药敏试验中抗菌药物的选用

　　按临床需要选用抗菌药物的种类。

同类抗菌药物仅选一个作为代表。

根据测定细菌的种属和感染部位进行选药，参考NCCLS公布的《抗菌药物敏感性试验执行标准》。

　　抗菌药物在标准中分为四组：

　　A组为常规首选药敏试验药物。

　　B组包含一些临床上重要的，特别是针对医院内感染的药物，也可以用于一级试验。

但是，它们只是被选择性地报告，例如当细菌对A组同类药物耐药时，可以选用。

其他报告指征可包括以下几点：

特定的标本来源（如三代头孢菌素对脑脊液中的肠道杆菌或者TMP／SMZ对泌尿道的分离菌株）；

多种细菌感染；

多部位感染；

对A组药过敏、耐受或无效的病例；

为流行病学调查目的向感染控制组报告。

　　C组包括替代性或补充性抗微生物药，可在以下情况进行试验：

某些单位潜伏存在有对数种基本药物（特别是对同类的，如β-内酰胺类或氨基糖苷类）耐药的，局部流行或广泛流行的菌株；

治疗对基本药物过敏的患者；

治疗少见菌的感染（如氯霉素对沙门菌属或某些假单胞菌属）；

为流行病学目的向感染控制组报告。

　　U组仅用于治疗泌尿道感染的抗微生物药（如呋喃妥因和某些喹诺酮类药物）。

除泌尿道，其他感染部位分离的病原菌不用此组药物进行试验。

第二节　细菌对药物的敏感试验

　　细菌对抗菌药物的敏感试验（药敏试验）是指在体外测定药物抑制或杀死细菌能力的试验。

药敏试验主要用于：

①帮助临床医师选择效果最佳的药物进行感染性疾病的治疗，以避免由于抗菌药物使用不当造成的许多不良后果；

②进行流行病学调查，了解本院、本地区致病菌的耐药性变迁情况，以便在宏观上控制耐药性的发生发展，对于院内感染的控制也具有积极意义；

③药敏试验结果还可以用来做某些细菌的鉴定。

④指导有关部门制定流行耐药菌的防治措施。

　　一、扩散法（K-B法）

　　目前常用的方法是纸片琼脂扩散法，是一种半定量的方法。

美国NCCLS纸片扩散法敏感试验分委会所推荐的标准方法是以Bauer-Kirby建立的K-B法，是目前公认的标准实验方法。

（一）原理

　　将含有定量抗菌药物的纸片（药敏纸片）贴在已接种待检菌的琼脂平板表面特定部位，该点称为抗菌药源。

药物借其分子的扩散力向周围琼脂中扩散，形成了随着药源距离加大，琼脂中药物浓度逐渐减少的梯度浓度。

　　其药源周围一定区域的琼脂内药物浓度恰高于抑制待检菌所需浓度时，则该区域内细菌不能生长，形成透明抑菌圈。

抑菌圈的大小可以反映待检菌对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。

（二）材料

　　1.培养基：

采用水解酪蛋白（M-H）琼脂，pH7.2，琼脂厚度为4mm。

对生长条件要求高的细菌，如链球菌属等细菌须在M-H琼脂中加入5%的脱纤维羊血。

嗜血杆菌属细菌需补充1%血红蛋白（含V因子）和1%X因子复合物。

　　2.抗菌药物纸片：

选择直径6.35mm，吸水量20μl的专用药敏纸片。

　　3.菌液

（1）菌液标准比浊管的制备：

0.048mol／L（1.175%）氯化钡0.5ml加0.18mol／L（1%）硫酸溶液99.5ml，充分混匀，其浊度为0.5麦氏比浊标准，相当于1.5×

108／ml的含菌量。

（2）接种菌液的准备：

用接种环挑取琼脂平板上形态相同的菌落4～5个，接种于3～5ml水解酪蛋白（M-H）肉汤中，35℃培养2～8h。

链球菌属和嗜血杆菌属细菌需用加血肉汤培养过夜。

用生理盐水或肉汤校正菌液浓度至0.5麦氏比浊标准，校正后的菌液应在15min内接种。

　　（三）实验步骤

　　以无菌棉拭蘸取已制备好的菌液，并在管壁上拧压一次，均匀涂布接种于M-H琼脂表面，涂布三次，每次平板旋转60°

角，最后沿平板内缘涂抹一周，盖上皿盖，置室温干燥3～5min后用无菌镊子或贴纸片机将含药纸片贴于含菌琼脂表面。

　　纸片应贴得均匀，各纸片中心距离不小于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。

直径为90mm的平皿可贴6张纸片。

纸片贴牢后避免移动，因为有些药物立即就可扩散于琼脂内。

平板经室温放置15min再倒放于35℃培养箱中培养16～18小时后阅读结果。

　　（四）结果判读

　　平板置黑色无反光背景上，从平板背面用卡尺、毫米尺或特制的模板测量包括纸片直径在内的抑菌圈直径，单位为mm。

抑圈菌的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。

参照标准解释结果。

每批试验都应做标准菌株对照，只有对照菌株的敏感度符合标准，实验结果才是可靠的。

试验结果解释分为三级，即

　　敏感（S）：

表示常规剂量的测定药物在体内所达到的浓度能抑制或杀灭待测菌。

　　中介度（I）：

不是敏感性的度量，这一范围作为“缓冲域”，以防止由微小的技术因素失控导致的结果偏差，因而其临床意义是不确定的，故不应作临床报告，通过提高测定药物的剂量或在该药物浓度较高的部位（如尿液、胆汁等），细菌生长可被抑制。

　　耐药（R）：

表示常规剂量的测定药物在体内达到有效浓度时不能抑制检测菌生长。

　　（五）质量控制

　　1.质控菌株：

采用标准菌株是进行质控的主要措施，应从可靠的菌保种保藏中心索购，金黄色葡萄球菌ATCC25923，大肠埃希菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853及粪肠球菌ATCC29212或33186用于对试验结果进行监测。

　　2.抑菌圈质控范围：

每种抗菌药物对四个质控菌株的抑菌圈允许范围，为95%的可信限，即实验室日间质控得到的抑菌圈直径在连续20个数值中，仅允许有一个超出这个范围。

如果经常有质控结果超出这个范围，说明实验方法不稳定。

每日质控抑菌圈直径的均值应接近允许范围的中间值，否则说明操作中有不规范之处，应予以调整。

一旦发现失控，应从培养基、纸片、接种菌液等方面去查找原因，并及时纠正。

　　（六）影响结果的因素

培养基的成分对结果的准确性有直接影响，有些抗菌药物的抑菌或杀菌力可被多种物质所拮抗，如某些蛋白质及氨基酸等对磺胺类药物即有不同程度的拮抗作用；

培养基的酸碱度以pH7.2～7.4为最适宜，碱性可扩大氨基糖苷类药物的抑菌圈，酸性可扩大四环素族药物的抑菌圈；

琼脂含量的多少可影响抑菌圈的大小。

对每批M-H琼脂平板均需进行检测，合格后方可使用。

纸片含药量是影响抑菌圈大小的主要因素，而纸片含药量又与纸片的重量、吸水性、直径等有关。

批量制备的抗菌药物纸片，务使每张纸片所含的药物浓度相同；

抗菌药物纸片应妥善保存，如保存不当可使药物效力降低，致使抑菌圈缩小。

保存条件以低温干燥为佳。

　　3.菌量：

加大菌量可使抑菌圈减小，相反可使抑菌圈扩大，因此菌量应相对固定。

　　4.操作质量

（1）培养基的厚度对抑菌圈的大小有影响，故平皿中加入培养基要固定，以4mm深度为宜。

制备的平板使用时应放于35℃温箱中30min去除过多的水分，以免影响抗菌药物的扩散。

（2）接种细菌后应在室温放置片刻，待菌液被培养基吸收后，再贴纸片；

但不宜放置太久，否则在贴纸片前细菌已开始生长可使抑菌圈缩小。

　　（3）培养温度为35℃为宜。

堆放试验平板不超过两个，使其受热均匀。

　　（4）测量抑菌量应仔细、精确，从生长刺激带测量。

　　二、稀释法

　　稀释法是体外定量测定抗菌药物抑制待测菌生长活性的方法，抗菌药物可在液体或固体培养基中稀释。

根据稀释培养基的不同，分为肉汤稀释法和琼脂稀释法。

琼脂稀释法是细菌药敏试验的金标准。

　　稀释法所测得的某抗菌药物抑制待测菌生长的最低浓度为最低（或最小）抑菌浓度（MIC），稀释法也可测定最小杀菌浓度（MBC）。

（一）肉汤稀释法

　　1.原理：

以水解酪蛋白（M-H）液体培养基将抗菌药物作不同浓度的稀释，然后接种待测菌，定量测定抗菌药物抑制该菌的最低浓度（MIC）或杀死该菌的最低（或最小）杀菌浓度（MBC）。

　　2.材料

（1）抗菌药物原液的配制：

配制各种抗菌药物原液的溶剂一般为蒸馏水、磷酸盐缓冲液或乙醇等，稀释剂多为蒸馏水。

配制时需用标准粉剂并了解其效力（效价），用下列公式计算配制抗菌药物原液一定浓度所需要标准粉剂的毫克数。

　　A：

称取标准粉剂的毫克数

　　B：

稀释剂的毫升数

　　C：

储存液的浓度（即原液浓度，U／ml或μg／ml）

　　D：

标准粉剂的有效力（即效价，U／mg或μg／mg）

　　最后，原液以过滤法除菌，小量分装使用。

大部分抗菌药物原液在-20℃以下可保存三个月，而在4℃以下只能保存一周。

（2）培养基：

一般细菌采用M-H液体培养基；

链球菌和嗜血杆菌属除培养基为液体外，其他需补充的成分均同K-B法。

　　（3）接种菌液的制备：

在已分纯的待测菌平板上挑取4～5个形态相同的菌落接种于3～5mlM-H液体培养基内，35℃培养4～6h；

链球菌属和嗜血杆菌属的细菌需接种于含血液的M-H液体培养基，35℃培养过夜，校正菌液浓度，使其相当于0.5麦氏比浊标准，再用M-H液体培养基按1：

200稀释后备用。

稀释后的菌液应在15min内接种。

　　3.试验步骤

（1）各管抗菌药物的最终含量依次为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.13、0.06、0.03μg／ml。

另设培养液对照，检测菌生长对照和质控菌生长对照管各一支。

（2）将已校正浓度的待测菌悬液依次加入含药管内，混匀。

各试管置35℃培养16～18h后观察结果。

每次以同法作对照菌的药敏试验。

　　4.结