玉米品种鉴定实验室质量管理.docx

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玉米品种鉴定实验室质量管理

学习心得

一、实验室质量管理

1、质量法规

对《产品质量法》、《标准化法》、《种子法》、《农作物种子标签和使用说明管理办法》等的学习有待进一步学习。

2、质量与检验

（1）从过程管理的角度来看，质量绝对不是检验出来的，预防产生质量，检验不能产生质量；

（2）合格产品不是检验出来的，而是干出来的；

（3）检验可以发现不合格产品。

3、种子检验室质量管理

应建立相适应的有效的管理体系，形成文件，将抽样到结果报告各环节检验活动标准化、制度化。

管理体系文件一般包括四个层次：

《质量手册》、《程序文件》、《作业指导书》、《记录格式》。

4、试验要求

（1）若发现试验结果异常，试验人员不要轻易下结论，应认真查记录、查计算、查操作、查试剂、查方法、查样品，找出原因后有针对性地进行复验。

（2）要认真及时做好原始记录，要求所有的实验内容都要有原始记录，不得漏记。

5、记录控制要求

（1）试验数据应用中性笔或钢笔在实验同时记录在原始记载表上，不应事后抄录，也不应漏记。

试验中出现的异常情况也应及时记录。

书写要求工整、清楚、真实、准确、完整。

不准用铅笔记录，不得随意涂改、乱写、乱画和折叠。

当发生笔误时，用“－”注销，并在“－”上方由本人更正，加盖改正章。

（2）试验原始记录要按年编目成册，做好标识，归档保管。

（每年做一次整理归档）。

6、检测数据修约规则

（1）称重规定：

1g以下保留四位小数，1～10g保留三位小数，10～100g保留二位小数，100～1000g保留一位小数。

（2）在净度分析中，各成分之和是99．9％或100．1％，从最大值（通常是净种子成分）增减0．1％。

（3）数字修约规则：

“四舍六入五成双”法则。

（4）检测室报出数值最右的非零数字为5时，应在数值后面加“（+）”或“（-）”或不加符号，以分别表明已进行过舍进或未舍未进。

7、发芽用沙：

0.05-0.08mm;160度烘干2小时杀菌。

水：

PH：

6.0-7.0（必须验证）

二、玉米品种鉴定技术-SSR标记法

（1）不同点:

1、提取DNA用96孔深孔板；PCR板。

2、将深孔板放入沸水中煮沸15min；PCR煮沸；

3、将煮好的深孔板拿出，加入250μl的TE，静置至室温即可，TE加入的量应与NaOH提取液加入的量等体积；120μl的纯净水。

4、DNA提取方法有CTAB提取法、快速碱煮提取法、试剂盒法；PCR碱煮提取法。

5、电泳检测有PAGE电泳检测、毛细管电泳检测两种；PAGE电泳检测。

6、在干净的凹板上涂上疏水硅烷；剥离硅烷。

7、将扩增好的产物加入5μl变性剂变性；加样缓冲液。

8、累计检测40个核心SSR引物位点；20个。

（二）重点知识点

1、SSR技术特点

•多态性丰富，分辨能力强，每个位点最多可含有十多个等位基因；

•较高重复性，针对于每个位点设计特异性引物，扩增均为特异性目的片段扩增；

•前期研发基础强，有大量已知染色体位置的共享位点；

•为共显性标记，能准确区分不同等位变异；

•为中性变异标记；

•数据形式为具体片段长度，能够实现数据标准化；

•技术非常成熟，检测方法简便易行；

•SSR技术易于推广，不受专利限制。

2、DNA提取的原则

（1）保证DNA结构的完整性；

（2）将蛋白质、多糖、多酚等杂质降低到最低程度；

（3）排除有机溶剂和金属离子的污染；

（4）纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质；

（5）排除其他核酸分子的污染。

3、快速碱煮法

（1）碱：

在碱性环境下裂解细胞，使DNA变性，从而达到提取的目的。

碱能够使DNA变性，且不会复性，并缠结成网状物质析出最终加入TE溶液溶解。

（2）煮：

煮沸的方式能够代替液氮冷冻法，抑制DNA酶的活性，防止煮沸还能够代替研磨，破坏细胞壁和细胞膜，释放出DNA。

4、核酸提取注意事项

•最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融

•材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低

5、DNA提取量少

（1）主要原因

实验材料不佳或量少；破壁或裂解不充分；沉淀不完全；洗涤时DNA丢失

（2）解决方法

尽量选用新鲜（幼嫩）的组织；样品预处理充分；适当延长高温裂解时间；用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒；低温沉淀，延长沉淀时间，加沉淀辅助物

6、PCR扩增

（1）PCR，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。

（2）一是被扩增的DNA所需量极小，理论上讲一个分子就可以用于扩增了；二是扩增效率高，几个小时就扩增1000万倍以上。

7、PCR反应体系及循环条件

PCR反应是Taq酶以dNTP为原料，以一对寡核苷酸引物为起点，以被扩增的DNA序列为模板在PCR热循环仪中进行的扩增反应。

标准的PCR过程分为三步：

1.DNA变性（90℃-96℃）：

双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

2.退火（25℃-65℃）：

系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3.延伸（70℃-75℃）：

在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。

8、模板DNA对PCR反应的影响

（1）模板纯度：

蛋白、酚类、多糖等杂质会抑制PCR反应；

（2）模板完整性：

模板DNA降解会导致PCR无扩增产物；

（3）模板浓度：

实验表明：

在一定范围内PCR的产量随模板的浓度的升高而显著升高。

模板的量与循环数要匹配,如果循环数一定,模板的量太少,会出现阴性结果或条带很弱;模板的量太多,则会出现条带弥散,模糊不清。

（4）PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度

（5）PCR反应体系中引物的浓度一般为0.1~0.5umol/L，在此范围内，PCR的产物量基本相同。

（6）若引物量过低会导致PCR产物量降低，而如果引物量过高，则会引起碱基的错配和非特异性扩增、生成引物二聚体，从而使目的DNA片断的扩增量下降。

（7）通常引物量应当10倍于靶序列。

此外，引物的Tm值与退火温度相关，故引物的Tm值最好在55～80℃的范围。

（8）高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。

（9）PCR中常用终浓度为50-400μM的dNTP。

四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。

（10）此外，dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。

（11）耐热DNA聚合酶的活性依赖于反应体系中的二价阳离子。

（12）反应体系中Mg2＋浓度过低，会显著降低酶的活性；而Mg2＋浓度过高时，又使酶催化非特异性扩增增强。

（13）Mg2＋浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物解链的温度，从而影响扩增片度的产率。

（14）由于在PCR反应体系中的模板DNA、dNTP、引物中的磷酸基团均可与Mg2＋结合从而降低反应体系中的Mg2＋的浓度，而耐热DNA聚合酶需要的是游离的Mg2＋，因此，一般Mg2＋的加入量应比dNTP的总浓度高0.2～2.5mmol/L。

（15）在不同的反应体系中模板DNA、引物以及dNTP的量各不相同，因此应根据具体的情况来确定特定PCR反应体系中Mg2＋的最适浓度。

9、PCR循环条件

①模板DNA的变性：

模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟。

使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

10、无扩增产物

（1）原因

模板含有抑制物，模板含量低；该Buffer对样品不合适；引物设计不当或者引物发生降解；反应条件不适，退火温度太高，延伸时间太短。

（2）对策

纯化模板；更换Buffer或者调整浓度；重新设.引物；降低退火温度，延长延伸时间。

11、PAGE电泳检测

聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamidegelelectrophoresis），是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂AP（过硫酸铵）和加速剂TEMED（四甲基乙二胺）形成的三维空间的高聚物。

聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。

网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。

聚丙烯酰胺凝胶具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。

因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。

12、注意事项

（1）在配制胶时，过硫酸铵最好现配现用，不要先配AP（过硫酸铵）溶液，因为AP很容易变质。

而且过硫酸铵固体时间过久也会失效的。

（2）电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。

建议经常更换电泳缓冲液。

（3）丙烯酰胺为神经剧毒和可疑致癌物，实验过程中应穿工作衣，戴手套并加倍小心。

13、SSR技术在品种真实性鉴定中的应用

（1）成对比较

a）与来自农业部品种权保护的标准样品比较；

b）与已审定品种标准样品比较；

c）与模仿对象进行比较。

（2）数据库比较

a）在品种权保护中，辅助筛查申请品种的最近似品种，代替原来由申请者自行提供。

b）在国家和各省区试中，鉴定区试品种是否与已知品种雷同，并作为品种能否推荐审定的必要条件。

c）在种子市场打假中，鉴定市场抽检的品种仿冒了什么已知品种。

14、纯度鉴定流程

（1）引物筛选

利用至少10个核心引物进行筛选和评估（杂交种取20粒），一方面确定该纯度问题是以自交苗、回交苗、其它类型杂株还是遗传不稳定造成的，一方面挑选出合适的双亲互补型引物进行下一步鉴定。

（2）样品鉴定

从待测样品中随机取样至少100粒种子，利用确定下的若干引物进行进一步鉴定，并利用这些引物综合判定待测杂交种的纯度。

如果是自交苗造成的，采用其中1个互补型引物即可；

如果是回交苗造成的，则应采用2-4个能够综合判定出回交苗的互补型引物；

如果是其它杂株，则根据实际情况选择1-2个能够将杂株鉴定出来的互补型引物；

如果是遗传不稳定，则尽量剔除一致性极差的位点，对一致性表现较相近的引物中选择1-2个进行鉴定。

（3）结果表示

根据所选引物对各单株的检测结果，综合判定待测杂交种的纯度，如果提供了父母本的话，原始记录中需要区分自交苗（NM）和其它类型杂株（NQ，含回交苗、异品种等造成的杂株）；如果没有提供父母本的话，原始记录中只需提供杂株（即自交苗也是杂株的一种）。

品种纯度检测结果按以下公式计算：

P（%）=（NT-ND）/NT