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单质碳不能作为碳源。
氮源：
能为微生物的代谢提供氮元素的物质。
如N2、NH3、NO3-、NH4+、蛋白质、氨基酸等。
只有固氮微生物才能利用N2。
（二）无菌技术
（1）获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面：
①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。
②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。
③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
（2）消毒与灭菌的区别
消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。
消毒方法常用煮沸消毒法，还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、红外线消毒。
灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。
（三）制作牛肉膏蛋白胨固体培养基
（1）方法步骤：
计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。
（2）倒平板操作的步骤：
①将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。
②右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。
③用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。
④等待平板冷却凝固，大约需5～10min。
然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。
（四）纯化大肠杆菌
（1）微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。
（2）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。
（3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。
（4）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：
使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。
（5）平板划线法操作步骤：
①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。
②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。
③将试管口通过火焰。
④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。
⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞。
⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。
注意不要划破培养皿。
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。
重复以上操作，在三、四、五区域内划线。
注意不要将最后一区的划线与第一区相连。
⑧将平板倒置放入培养箱中培养。
（6）涂布平板操作的步骤：
①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
②取少量菌液，滴加到培养基表面。
③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s。
④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。
（五）菌种的保存
（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。
①临时保藏方法
将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。
当菌落长成后，将试管放入4℃的冰箱中保藏。
以后每3～6个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。
②缺点：
这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。
（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。
在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。
将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20℃的冷冻箱中保存。
（六）实验安排及注意事项
（一）从菌种保藏中心购买菌种后，教师首先需要用平板划线法纯化培养所得菌种，并根据学生小组的数目，准备好数个平板。
（二）第1课时完成基础知识的教学，学习各种操作方法，并制备培养基。
高压蒸汽灭菌所需要的时间较长，因此需要利用课下时间完成。
课下完成后，再于第2课时完成大肠杆菌的纯化培养。
此后安排学生连续观察记录3～4d。
（三）配制培养基时，教师需要提示学生按照每个培养基消耗15～20mL的量来估算总用量。
全班同学的培养基可以集中起来，分批灭菌。
（四）灭菌后，培养基冷却到55℃后应及时进行倒平板操作。
如果不能及时操作，需要将培养基放到55℃左右的电热箱中保温，以防止琼脂凝固。
（五）如果打算做本专题的第2或第3课题，建议此课题不仅要练习平板划线操作，还要练习稀释涂布平板法操作。
为此，教师需要提前1天用液体培养基培养大肠杆菌，培养一夜后，于第2天将培养液分发到各小组。
（六）实验后，所有用过的培养基、培养液等都需要统一进行高压蒸汽灭菌后再丢弃，否则将会造成环境污染。
二．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（一）筛选菌株
（1）实验室中微生物的筛选应用的原理
人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
（2）选择性培养基
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
（3）配制选择培养基的依据
根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。
例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；
培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；
加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。
（二）统计菌落数目
（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。
（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。
为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。
统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。
（三）设置对照
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
（四）实验设计
实验设计包括实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。
（1）土壤取样
从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样。
铲去表层土，在距地表约3～8cm的土壤层取样。
（2）制备培养基
准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。
牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。
（3）微生物的培养与观察
将土样以1、101、102……依次等比稀释至107稀释度，按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。
注明培养基种类、培养日期以及平板培养样品的稀释度。
将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养。
随着培养时间的延长，会有不同的菌产生。
比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。
（4）细菌的计数
当菌落数目稳定时，进行计数，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
求出平均值，根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。
（五）实验案例
土壤中某样品细菌的分离与计数。
实验的具体操作步骤如下。
1.土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。
先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
2.制备培养基
准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。
由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：
稀释倍数为103～107。
每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。
此外，还需要准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。
3.微生物的培养与观察
参考课本中图2-7的实验流程示意图，将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中（锥形瓶体积为250mL），充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9mL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。
按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。
随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。
比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。
挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图2-10的颜色反应。
4.细菌的计数
当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。
在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。
三．分解纤维素的微生物的分离
高考资源网
（一）纤维素与纤维素酶
（1）棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。
（2）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。
（二）纤维素分解菌的筛选
（1）筛选方法
刚果红染色法。
能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。
（2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理
刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。
当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
（三）分离分解纤维素的微生物的实验流程
土壤取样→选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落
（1）土壤采集
选择富含纤维素的环境。
（2）刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤
倒平板操作、制备菌悬液、涂布平板
（3）刚果红染色法种类
一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。
（四）分离分解纤维素的微生物的实验案例
土壤中纤维素分解菌的分离实验的具体操作步骤如下。
1.土样采集
土样采集的方法与本专题课题2类似。
土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。
如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。
2.选择培养
选择培养需要的仪器有：
250mL锥形瓶、无菌称量瓶、药匙、1mL和10mL的移液管、天平、摇床、温度计等。
培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。
在250mL锥形瓶中装入30mL培养基，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸（或报纸），用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
选择培养的操作：
称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL培养基的摇瓶中。
将摇瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养1～2d，至培养基变混浊。
此时可以吸取0.1mL培养液进行梯度稀释和涂布平板，也可以按课本中所述，重复选择培养的步骤一次，然后再进行梯度稀释和涂布平板。
3.刚果红染色法分离
纤维素分解菌这一步所需要的仪器有：
无菌培养皿、涂布器、1mL移液管，装有9mL无菌水的20mL大试管，温箱等。
在500mL三角瓶中装入200mL培养基，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
倒平板操作：
将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌操作的要求，在无菌的培养皿中
倒入15～20mL培养基，凝固后待用。
制备菌悬液：
按照本专题课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数至106。
涂布平板：
将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1mL，滴加在平板培养基上，用涂布器将菌液涂布均匀，在30℃倒置培养，至菌落长出。
每个稀释度下需涂布3个平板，并注意设置对照。
刚果红染色的具体操作步骤参照课本［资料三］。
总结提高
1．微生物的实验室培养的有关总结
（1）生物的营养
营养是指生物摄取、利用营养物质的过程。
营养物质是指维持机体生命活动，保证发育、生殖所需的外源物质。
人及动物的营养物质：
水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。
植物的营养物质：
矿质元素、水、二氧化碳等三类。
微生物的营养物质：
水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。
（2）确定培养基制作是否合格的方法
将未接种的培养基在恒温箱中保温1～2天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
（3）无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
2.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的有关总结
（1）选择培养基
选择培养基的含义是：
在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长。
目的是从众多微生物中分离所需要的微生物。
在培养基中加入某种化学物质可以做到这一点，如加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。
加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。
这里的加入是在培养的培养成分的基础上加入的。
培养基中的营养成分的改变也可达到分离微生物的目的。
如培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。
当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。
如石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的。
改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。
（2）如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？
统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。
（3）中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？
这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：
株/Kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：
好氧及兼性厌氧型细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。
因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。
疑点解答
1．如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？
2．为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？
测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？
株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：
好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。
3．为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？
由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。
4．将滤纸埋在土壤中有什么作用？
你认为滤纸应该埋进土壤多深？
将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。
一般应将纸埋于深约10cm左右腐殖土壤中。
5．两种刚果红染色法的比较
刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经有超过20年的历史，在本课题中我们给出了两种方法。
方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；
其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。
方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。
但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。
方法二的另一缺点是：
有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。
6．为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？
在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。
7．分离分解纤维素的微生物的实验流程与稀释液的取样培养流程图有何异同？
它们的区别是：
稀释液的取样流程图是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。
分离分解纤维素的微生物的实验流程通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。
其他步骤基本相同。
8．将滤纸埋在土壤中有什么作用？
将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌的生存的适宜环境。
9．两种刚果红染色法的比较
其优点是这样显示出的颜色反应基本上纤维素分解菌的作用。
方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂的问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。
10．为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？
名师点睛
1．对细菌群体生长规律测定的正确的表述是
A．在液体培养基上进行B．至少接种一种细菌
C．接种一个细菌D．及时补充消耗的营养物质
答案：
A
解析：
细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。
这些条件是：
一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。
在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。
测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；
恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；
液体培养基才能通过样品推测细菌总数。
若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。
在接种时，要保证一定的接种量。
2．在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是
A．调整期B．对数期C．稳定期D．衰亡期
C
种内斗争是一种生态因素。
种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。
在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。
随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。
由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。
在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。
3．温度对发酵过程的影响，不正确的是
A．温度过高，发酵周期缩短，产量降低B．温度不影响生物合成的途径
C．温度能影响菌种对营养物质的吸收
D．菌体生长和产物合成所需的最适温度不一定相同
B
解答此题需要从以下几方面入手分析：
第一，发酵过程需要适宜的温度，如果温度过高，酶很快失活，菌体衰老，发酵周期就会缩短，产量也会降低；
第二，温度能影响生物合成的途径，这是因为生物合成过程需要酶，酶的活性与温度高低有关；
第三，菌种吸收营养物质一部分是通过主动运输来完成的，需呼吸作用提供能量，这与温度有关；
第四，菌体生长和产物合成需体内旺盛的代谢作基础，而用于生长繁殖和代谢产物生成的酶不同，因此所需的最适宜的温度也不一定相同。
4．（2008全国Ⅰ卷，理综，3）下列关于细菌的叙述，错误的是（）
A．硝化细菌能以NH3作为氮源和能源物质
B．某些细菌可以利用光能因定CO2合成有机物
C．生长因子是某些细菌生长过程中需要额外补充的营养物质
D．含伊红和美蓝试剂的培养基不能用来签别牛奶中的大肠杆菌
D
某些细菌如蓝细菌（蓝藻）、光合细菌以及红螺菌都能进行光合作用。
生长因子是指微生物生长不可缺少的微量有机物，主要包括维生素、氨基酸和碱基等。
而微生物的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源和生长因子，它们都是要从外界获得补充的。
常用的伊红美蓝乳糖培养基，可用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌，如果有大肠杆菌，则菌落呈黑色。
5．抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。
其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。
⑴青霉素发酵产生青霉素。
青霉菌的新陈代谢类型是，青霉素是青霉菌的代谢产物。
⑵在生产和科研中，常选用处于期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，和比较稳定。
⑶对青霉菌菌体生长情况的测定：
取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，，再计算发酵罐中菌体的总重量。
⑴异养需氧型次级⑵对数个体的形态生理特性⑶称菌体的湿重（称烘干后的重量）
青霉菌属于真菌，其代谢类型应为异养需氧型，而青霉素作为它的代谢产物，并不是它生长、繁殖所必需的，所以青霉素应属于次级代谢产物。
在测定培养基上青霉菌菌体的生长情况时，常用的方法有两种：
一种是测量青霉菌的细胞数目，另一种是测重量，取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，称菌体的湿重，或烘干后称干重，再由此计算出其中的细胞总重量。
在细菌生长的四个主要时期中，因为处于对数期的细菌代谢旺盛，个体的形态和生理特性比较
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