分子生物实验.docx
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分子生物实验
实验一少量质粒DNA的制备和琼脂糖凝胶电泳
一、实验目的
通过本实验，学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法，掌握质粒DNA制备的方法和原理,以及熟悉分子生物学实验室的一些基本仪器的使用方法。
二、实验原理
质粒DNA的制备
质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子。
质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物。
质粒DNA的提取可分为三个步骤：
培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中，将上清液用乙醇溶液沉淀洗涤后，可得到质粒DNA。
从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。
碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。
抽提过程中在加入溶液II后，碱性条件使DNA的氢键断裂，宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两条链不会完全分离，当加入溶液III中和后，宿主DNA相对分子质量大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速配对恢复原来的构型而溶解在TE溶液中。
在实验步骤中，加入SolutionI的目的主要是将细菌团块重新悬浮于缓冲溶液中（兼有破壁作用）：
SolutionⅡ含有SDS及NaOH，前者可将细菌溶解，后者可将DNA变性；SolutionⅢ是由醋酸及钾盐所形成，前者在于中和碱，后者则与DNA形成复合物而有利于DNA的沉淀。
加入SolutionⅢ后离心，大部分的蛋白质与染色体DNA会留在下面的有机层，而上层的水层所含的质体DNA可用乙醇沉淀，（亦有实验室用酚／氯仿／异戊醇[PCl]莘取以去除残留的蛋白质），再以70%乙醇洗涤以去除盐类。
凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。
该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。
当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶（EB）染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。
此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。
DNA凝胶电泳检测原理主要有:
琼脂糖或者丙烯酰胺凝胶的分子筛作用
DNA分子结合SDS后在电场的作用下向正极移动
DNA分子的大小和形状的区别会在凝胶中区分出来，大的跑的慢，线性比环形跑的慢
三、实验仪器及药品
实验仪器：
高速台式离心机、移液管、移液枪、真空干燥机、Eppendorf管、电泳槽、凝胶成像仪
实验药品：
1SolutionⅠ：
25mMTris-HCl（pH8.0），10mMEDTA（pH8.0），50mMglucose
2SolutionⅡ：
0.2MNaOH，1%SDS,4℃保存备用。
3SolutionⅢ：
3M醋酸钾溶液（KOAc,pH5.2）,高压灭菌，4℃保存备用。
4100%酒精、70%酒精
5双蒸水
6琼脂糖
7TAE缓冲液
8Loadingbuffer
9LB培养液：
10gtryptone,5gteasteextract,10gNaClin1L
其中溶液I和溶液III分别在115℃和121℃灭菌后，存放于4℃冰箱使用。
溶液II先配制母液（NaOH2M，SDS10％），然后现配现用。
SDS（十二烷基硫酸纳）10％母液的配制：
在900mL水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分装备用。
无需灭菌。
因SDS微粉易扩散，称量需戴面具。
称后要及时清洁称量区。
四、实验步骤
质粒DNA的制备
将过夜菌液1.5mL置于微量离心管中以6000rpm离心2min后，倒去上清液。
沉淀菌体加入50uLSolutionⅠ，剧烈震荡使菌体完全悬浮，置于室温5min。
加入100uLSolutionⅡ，盖上管盖后将管子反复上下摇动3次，不可震荡，置于室温5min。
加入75uLSolutionⅢ，亦温和摇匀，置于室温5min。
以12000rpm离心5min，小心吸取上清液至另一微量的离心管中。
加入2倍体积的100%酒精，混合均匀，置于室温2min。
以12000rpm离心10min，倒掉上清液，加入70%酒精清洗一次，置于真空干燥机中10min，加入40uL双蒸水溶解。
凝胶电泳
1琼脂糖胶置于微波炉中加热至琼脂糖完全溶化（注意！
）防止突沸及胶液外溢）。
让琼脂糖在室温下冷却30min以上，待手持胶液不烫手时，倒入电泳槽内，插入梳子后使之凝结。
未使用的电泳胶片可以用保鲜膜封存，或浸入1×TBE内，置于4℃冰箱内，留待下次再使用。
⑵限制酶反应完，加入上样缓冲液，与质粒一起进行电泳，并放入DNAmarker进行比较，连接电源插头（黑色为负极，红色为正极）到电源，带负电荷的DNA分子会由负极移向正极，50vol跑胶约1h，或直至上样缓冲液染剂前端距胶底1.5cm。
（注意！
勿碰触高压电的电泳仪器）
五、实验结果
实验结果见下图：
在紫外灯下观察到一个DNA条带，但伴有拖尾现象。
六、实验讨论
琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。
在电场中，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率由下列多种因素决定：
DNA的分子大小：
琼脂糖浓度
DNA分子的构象
电源电压
嵌入染料的存在
离子强度影响。
用70%的乙醇洗过以后，要待其挥发才能进行下一步的操作，以免影响下一步的操作
由电泳图可以看出，质粒提取的效果不是很好，可能的原因是在取上清液时吸入了一部分蛋白杂质，影响了质粒的提取
点样孔很亮的原因是杂质未清除干净，阻碍了质粒的迁移
七、注意事项
⑴收集菌体提取质粒前，培养基要干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。
⑵在添加SolutionⅠ和SolutionⅢ混合一定要柔和，采用上下颠倒的方法，千万不要在振荡器上剧烈振荡。
其中加入SolutionⅡ后，溶液变澄清，并有黏性；加入SolutionⅢ后，出现絮状沉淀。
⑶加两倍体积的无水乙醇离心如果得不到质粒沉淀，可以放入-20℃1h以后再离心。
⑷为了得到高纯度的质粒DNA，可以在乙醇沉淀之前，再用苯酚氯仿抽提一次。
戴手套把琼脂糖放在强UV透射光源板上，即可对结果拍照存档，尽量减少身体和胶体暴露于UV下过久，有时会使DNA产生缺口或突变。
照相后，用刀片将此DNA切下，做DNA纯化及浓缩，用于连接反应。
有些质粒本身可能在某些菌种中稳定存在，但经过多次移接有可能造成质粒丢失。
因此不要频繁转接，每次接种应挑选单菌落。
实验二质粒DNA限制酶切割和凝胶电泳
一、实验目的
学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解的操作方法，理解限制性内切酶是
DNA重组技术的关键工具。
同一质粒DNA，经不同的限制酶切割，得到不同的DNA片段，再经琼脂糖
凝胶电泳分离后，与Maker进行比较，检测质粒的正确性或切割所需DNA片段进行重组质粒DNA的构建。
二、实验原理
限制性内切酶可切割双链DNA。
它可分为三类：
Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。
Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。
Ⅱ类由两种酶组成：
一种为限制性内切核酸酶（限制酶）;另一种为独立的甲基化酶。
Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列：
5'-G↓AATTC-3'），有少数酶识别更长的序列或简并序列。
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段（如SmaⅠ：
5'-CCC↓GGG-3'）;有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3'→5'…GAATTC…3'
3'…CTTAA↑G…5'→3'…CTTAAG…5'
DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。
大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。
当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。
如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。
若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。
若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。
也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/LNaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。
在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约为0.5-1μg。
限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同，各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度（大多数为37℃）。
对质粒DNA酶切反应而言，限制性内切酶用量可按标准体系1μgDNA加1单位酶，消化1-2小时。
但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。
三、实验仪器
微量离心管，Eppendorf管，瞬时离心机，电泳槽，电泳仪，微波炉，微量移液枪，微量枪头，琼脂糖
四、实验步骤
⑴取2支1.5ml微量离心管，依次加入下列各项，注意防止错加、漏加，单位：
ul；
⑵用手指轻弹管壁使溶液混匀，最好用瞬时离心机甩一下，使溶液集中在管底。
酶切体系：
试剂及加入量
pET-28a
pEGFP-N3
DNA（μl）
20
20
10×bufferK（μl）
1.5
1.5
BamHI（μl）
2
2
NotI（μl）
2
2
BSA（μl）
3
3
DdH2O（μl）
1.5
1.5
Totalvolume（μl）
30
30
⑶混匀反应体系后，将Eppendorf管置于适当的支持物上，（如插在塑料泡沫板上），在37℃的条件下反应2-4h以上，或酶切过夜，使酶切反应完全；
⑷取5μl反应液与2μl上样缓冲液混合，然后进行凝胶电泳，预检；
五、实验结果
下图是酶切后电泳示意图：
六、实验讨论
实际实验中发现DNA分子量标准小片段模糊不清，可能是因为琼脂糖凝胶浓度一般不会超过20%，较小的核酸片段在它的分辨范围之内，并且EB带正电荷，电泳时会向负极做移动，如果将凝胶置于含EB的水溶液中30min，较小的片段则可重新染色；另外，溴化乙锭（EB）是一种中等强度诱变剂，操作过程中要带手套，并将加有EB的染色液作好标记、妥善保存。
此外，酶切过程中的酶应注意保持其稳定性，应放置在低温条件下；取酶时应放置在冰面上，保持低温；一定要在最后加酶，且体系一定要混匀，可用离心机将其甩下来，混匀体系；先混匀再酶切；如遇部分DNA溶液黏在管壁上，可在反应前离心数秒。
酶切后DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱出现的酶切不开或切不完全的问题，可能是由以下几个方面引起的：
⑴酶的问题：
确认内切酶有效，通常内切酶虽然有过期时间，但过期后只要能够有效酶切，即可使用。
确认酶切效果不佳时，做好标记，及时更换。
⑵Buffer问题：
有些酶切的buffer中，添加了一些较为容易析出或溶解的成分，有时酶切的buffer没有完全融化时，buffer的浓度是不均一的。
新buffer先融化的部分，盐离子浓度要高，使用一段时间后，融化部分的离子浓度会降低。
⑶甲基化主要分为Dam、Dcm和CpG甲基化等。
如果是提取的质粒，质粒就会因大肠杆菌的Dam、Dcm被甲基化；如果是直接从哺乳动物细胞中提取的DNA，则部分DNA就会因CGmethylase的影响而被甲基化。
一些酶切位点被甲基化后，酶切会受影响。
因此，出现酶切不开或不全时需要考虑甲基化的问题。
七、注意事项：
⑴限制酶加入后速放入-20℃冰柜中，每次吸取限制酶时，务必换一支新微量枪头，以避免造成限制酶被污染。
限制酶中含50%glycerol以防冻结，故用量不可超过反映总体积的1/10，否则将造成反应受抑制。
切割1μl质粒DNA约需2单位的限制酶。
酶在使用时应置于冰盒中取酶。
拿酶的时候，手不是应该抓着管子上端，而不是握在管子的底部。
⑶在电泳中应看到BamHI/NotI双酶切质粒pEGFP-N3得到700bp的EGFP基因片段和BamHI/NotI双酶切质粒pET-28a得到5637bp的克隆载体。
⑷酶使用完后应尽快旋紧盖子。
实验三目的DNA片段的回收
一、实验目的
了解常用的目的DNA的回收方法，掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA的技术以及掌握胶回收试剂盒回收DNA的操作过程。
二、实验原理
在生物技术实验中，酶切后所得特定的DNA序列，经过琼脂糖凝胶电泳后，需要将目的片段与其它DNA分开。
对于混合的DNA样品（例如限制性酶切产物等）进行检测和纯化的一种常用方法是进行琼脂糖电泳分析，从电泳后的凝胶中回收出某一DNA带，经过有机溶剂的抽提等一系列纯化过程，便可得到纯化的DNA片段。
首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。
试剂盒的胶回收柱采用特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA、RNA的原理，配备设计独特的离心吸附柱式结构，使用常规台式高速离心机，在几分钟之内即可以高效回收核酸片段。
三、实验仪器及药品
⑴实验药品：
无水乙醇、试剂盒、异丙醇
⑵实验仪器：
电子天平、离心机、PCR仪、水浴锅、离心管、紫外观察分析仪、单面刀片
四、实验步骤
电泳后以长波长UV灯观察DNA片段所在位置，并以干净刀片将之切下，尽可能切越小越好。
取一微量离心管，称重后将切下的胶体置于管内再称重，-20℃冻融捣碎2次。
取200uLBindingBuffer到0.15g的凝胶中，取400uLBindingBuffer到0.15g的凝胶中，56℃水浴加热至凝胶完全溶解，往每个吸附柱内装100uL，12000rpm离心1min后弃上清液，再次加入150uLBindingBuffer，再次离心，并弃上清液。
加入350uLWashBuffer，12000rpm离心1min后弃上清液，再次加入350uLWashBuffer，12000rpm离心1min后弃上清液。
以12000rpm离心2min，甩干酒精，静置2h，酒精挥发。
加入30uLElutionBuffer静置，离心，所得液体为较纯净的目的DNA。
16℃条件下，在PCR仪中，目的DNA在连接酶的作用下与质粒进行连接，构成重组的DNA。
五、实验结果及讨论
DNA片段回收较为成功，未出现胶不溶等现象。
影响回收率的因素很多，如DNA片段大小、点样量、凝胶种类、电泳缓冲液的缓冲能力、切胶操作、紫外灯照射强度和时间、溶胶是否彻底等等，所以不能单凭1-2次的实验来判断其质量好坏，最好是多做几次实验或用几种不同品牌的产品做平行对照实验，结果相对真实。
六、注意事项
⑴切胶时尽可能切掉不含DNA片段的凝胶；
2要尽量减少DNA在紫外下的照射时间以减少对DNA的损伤；
3熔胶要完全，在电泳过程中，DNA会与大分子的多糖紧密的结合在一起，凝胶的种类和质量不同，DNA与之结合力也不同，只有凝胶充分溶解，DNA才能充分释放，否则，凝胶将与DNA一起沉淀下来，洗脱后将影响回收结果的纯度；
4要尽量减少DNA在紫外下的照射时间以减少对DNA的损伤；
5紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。
实验四大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
一、实验目的
⑴学习分子生物学的实验操作技术。
⑵掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法。
二、实验原理
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的Mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
将重组DNA转化受体菌，技术关键是通过化学方法诱导细菌进人感受态，以利于外源DNA被导入。
这项技术始于Mandel和Hiag1970年的观察。
他们发现细菌经过冰冷氯化钙溶液处理及短暂热休克（heashock）后，容易被λDNA感染；随后Cohen于1972年进一步证明质粒DNA用同样方法也能进入细菌。
其原理是：
细菌处于0℃氯化钙低渗溶液中，细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基鸟磷酸复合物粘附于细胞表面；经42℃短时间热休克处理，促进细胞吸收DNA复合物。
在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。
被转化的细菌中，重组的基因得到表达，在选择性培养基平板上可筛选出所需的转化因子。
三、实验仪器及试剂
试管，离心管，冷冻离心机、恒温摇床、恒温箱、-70℃冰箱、恒温水浴
1.0.1mol/lCaCl2溶液
2.LB液体培养基
3.氨苄青霉素
4.LB固体培养基
四、实验步骤
大肠杆菌感受态细胞的制备
1从平板挑取DH5α单菌落于5ml含LB液体培养基试管，37℃摇瓶培养过夜；
2吸取过夜培养的1mlDH5α菌液于含有100mlLB液体培养基的三角瓶，37℃剧烈摇菌3-4h，至OD600达到0.3-0.4；
3将40ml细菌培养物无菌条件下转移至50ml预冷的离心管，冰浴30min；
44℃，3500rpm离心10min（冷冻离心机），弃上清，收集菌体沉淀；
5加入700冰冷的0.1mol/LCaCl2重悬细胞，冰浴30min；
64℃，3500rpm离心10min，弃上清，收集菌体沉淀；
7最后用400μl0.1mol/LCaCl2重悬菌体沉淀，混匀后取出300μl弃掉，留100μl，分装速冻，-70℃贮存备用。
质粒DNA的转化
取出保存有感受态细胞的1.5ml离心管冰浴退冰，加入1μl质粒DNA，轻轻旋转混合物，继续冰浴30min；
42℃水浴热激90s；
快速将离心管转入冰浴中，冰浴3~5min；
加入37℃预热的的LB液体培养基400μl，培养1h；
从离心管中取10μl菌液于LB固体培养基上，涂布平板，平板放于37℃恒温培养箱中倒置培养过夜，第二天观察结果。
五、实验结果及讨论
从图中可以看出，单菌落的数量很多，且在紫外灯下可见绿色荧光，说明质粒DNA成功导入到感受态细胞中。
六、注意事项
1感受态细胞的操作应严格无菌操作，谨防杂菌污染。
实验中凡涉及溶液的移取、分装等需要敞开实验器具的操作，均应在无菌超净台中进行；
2控制好菌体的OD600；
3细胞培养完后一定要骤冷，使培养物在短时间内迅速冷却。
摇动瓶子中冰水混合物，大约10min；
4离心操作一定要低温，所用的水、CaCl2溶液、离心管一定要在冰上预冷；
5所用的器皿一定要非常干净，没有化学物质的残留，器皿和试剂最好用双蒸水涮洗和配制，注意pH检验；
6整个操作均要在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率会降低；（转化好的感受态细胞-70℃条件下可长期保存使用，不可置于-20℃存放）。
实验五重组质粒构建、转化与表达
一、实验目的
通过本实验，学习重组质粒的构建原则和方法，转化操作及连接体系等相关实验内容，以及通过对比重组质粒蛋白表达实验，验证GFP是否转化成功。
二、实验原理
将重组DNA转化受体菌，技术关键是通过化学方法诱导细菌进人感受态，以利于外源DNA被导入。
细菌经过冰冷氯化钙溶液处理及短暂热休克后，容易被λDNA感染。
其原理是：
细菌处于0℃氯化钙低渗溶液中，细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基鸟磷酸复合物粘附于细胞表面；经42℃短时间热休克处理，促进细胞吸收DNA复合物。
在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。
被转化的细菌中，重组的基因得到表达，在选择性培养基平板上可筛选出所需的转化因子。
三、实验仪器及药品
（一）实验仪器
恒温培养箱、水浴锅、平板、三角瓶、接种环、离心机、PCR扩增仪
（二）实验材料
菌株：
E.coliDH5α
连接反应：
酶切后的pET-28a、pEGFP-N3，T4DNA连接酶，T4DNA连接酶buffer,双蒸水
大肠杆菌感受态细胞
LB培养基
四、实验步骤
连接反应
成份
体积（uL）
成份
体积（uL）
EGFP片段
纯化的全部EGFP片段
ddH2O
2
载体PET-28a
6
T4-Ligase
1
T4-Ligasebuffer
1
4℃连接反应12h以上
连接反应在EGFP片段纯化管内完成。
转化步骤
-70℃保存的感受态细胞冰浴退冰。
分别取100uL摇匀后的感受态细胞加入到重组质粒PET-28aGFP（全部10uL）离心管，自提质粒PET-28a及空白作对照，小心混匀，冰浴20min。
外加一个PCR扩增产物重组。
42℃水浴1.5min，此为热休克处理。
迅速冰浴3到5min。
加入400uLLB培养液，37℃恒温振荡培养1h，使细胞恢复正常的生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。
转化反应加入量
PET-28aGFP
10uL
PET-28a
3uL
ck（ddH2O）
3uL
PCR重组产物
6uL
PCR重组产物做蓝白斑筛选，所以质粒为pCM103，系抗AMP。
转化步骤
1于实验前一天，将DH5α与转化细胞株pET-28GFP接种于2mlLB+Kan，并在37℃下震荡培养过夜
2上午8点取2支10mlLB+Kan，分别加入100μl转化细胞，37℃震荡培养2h；
⑶OD600约为0.6-0.8时，加入IPTG至最终浓度为1mM，另一部分不加IPTG作为对照组；
330℃培养3h，8000rpm离心5min，观察结果。
五、实验结果
重组质粒的表达1重组质粒的表达2
重组质粒的表达3重组质粒的表达4
未经酶切的质粒转化表达图1未经酶切的质粒转化表达图2
六、实验讨论
实验结果如图所示，将重组DNA导入大肠杆菌感受态细胞中，重组大肠杆菌经培养后，在LB培养基上长出分离的单菌落，I在紫外灯的照射下，菌落发出黄绿色荧光，证明eGFP-N3质粒中的绿色荧光蛋白基因顺利导入受体细胞中并得以正确表达。
未经酶切的质粒转化表达图1表明菌体生长过量，未出现单菌落，几乎所有菌落连成一片。
所有人的培养平板均出现上诉情况，原因可能如下
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