生物大分子相互作用分析资料下载.pdf

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D蛋白质与糖类相互作用糖蛋白需短寡糖链的装配，例如：

激素、抗体、酶等。

寡糖链往往是受体、酶类的识别位点。

一、生物分子相互作用的研究一、生物分子相互作用的研究一、生物分子相互作用的研究一、生物分子相互作用的研究一、生物分子相互作用的研究一、生物分子相互作用的研究一、生物分子相互作用的研究一、生物分子相互作用的研究3.大分子互作研究方法A酵母双杂交系统（THS）B化学发光共振能量转移（BRET）C双分子荧光互补（BIFC）D生物分子相互作用分析（BIA）E蛋白芯片（PC）二、二、二、二、BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理1.BIA定义BIA：

BiomolecularInteractionAnalysis生物分子相互作用分析2.BIAcore的历史1990年，首台SPR仪BIAcoreX1995年，BIAcoreC系列1999年，BIAcore30002003年，高通量的BIAcoreT、A、XBIAcoreXBIAcore3000BIAcoreCBIAcoreABBIAcoreFlexchipBIAcoreX100BIAcoreT100BIAcoreA1003.BIAcore系列分子互作分析仪二、二、二、二、BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理4.其他品牌的分子互作分析仪二、二、二、二、BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理光路和检测系统IFC系统自动进样器芯片及卡盘进样泵二、二、二、二、BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理5.BIAcore3000组件6.BIAcore3000液体流通系统二、二、二、二、BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理Pump：

1.缓冲液不断流通；

2.控制进样针容积500微升。

Connectorblock:

液体流路系统进样口。

Autosampler:

自动进样器二、二、二、二、BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理7.BIAcore的三个核心技术A表面等离子共振（SurfacePlasmaResonance,SPR）B微射流卡盘（IntegratedFluidicCartridge,IFC）C芯片（Chips）反射镜透镜光栅透镜偏振片棱镜透镜检测器injection近红外光光路和检测系统示意图8.表面等离子共振（SPR）二、二、二、二、BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理入射光8.表面等离子共振（SPR）棱镜检测器反射光二、二、二、二、BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理A基于物理光学现象金属表面存在自由电子按一定的方向水平移动，当受到光照射后，光能使金属表面电子发生共振，入射光强度减弱，导致反射角度出现偏差。

B反射角变化与金属的质量成正比将配体固定在芯片上，分析物流过芯片表面上，结合量的变化导致SPR信号的产生。

CRU值（ResponseUnit）的概念共振单位。

1RU：

1pgFlowcell9.微射流卡盘（IFC）二、二、二、二、BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理BIFC上密布液体通路和气阀IFC：

液体传送系统。

由计算机控制气阀的开闭从而控制液体的流路。

9.微射流卡盘（IFC）二、二、二、二、BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理B大部分为管状封闭结构部分为凹槽结构。

管道内径10uM。

9.微射流卡盘（IFC）二、二、二、二、BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理F1F1F2F2F3F3F4F4F1&

2F1&

2F3&

4F3&

4F1F1-33F1F1-44CIFC用途与芯片形成4个流通池、样品进样时包装、分析物回收。

玻璃层金膜联接层二、二、二、二、BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理10.芯片（Chip）A玻璃层厚度1mm，介质，折射率与Prism相同B金膜厚度50nm，SPR反应，常用AuC联接层厚度100nm，决定芯片类型ChipCM5右旋糖苷10.芯片（Chip）二、二、二、二、BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理ForcaptureoflipidmonolayersFlathydrophobicsurfaceHPADesignofsurfacechemistryPlaingoldsurfaceAuHistidinetaggedligandsCM-dextran（6-His）NTAAvoiddextraninterferesFlatcarboxylatedsurfaceC1LargeligandmoleculesCM-dextran（shorter）CM3Lowimmobilizationlevelandreducednon-specificbindingCM-dextran（low）CM4GeneralpurposeCM-dextranCM5UsesSurfacetypeSensorchip10.芯片（Chip）二、二、二、二、BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理FC1FC2FC3FC4prismprismIFC11.微射流卡盘与芯片组装二、二、二、二、BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理侧面FC1FC2FC3FC4芯片横截面IFC大部分是管状结构，将芯片放入机器后，芯片表面将和四个通道完全贴合形成一个完全密闭的系统1.免疫学检测、生化分析3.核酸/核酸、核酸/蛋白互作分析4.蛋白质分析和蛋白质组学2.药物发现和筛选三、三、三、三、BIAcoreBIAcore的应用领域的应用领域的应用领域的应用领域三、三、三、三、BIAcoreBIAcore的应用领域的应用领域的应用领域的应用领域1.免疫学检测、生化分析A抗原识别、抗原决定簇代替放射性免疫检测和ELISAB抗原抗体结合常数测定T细胞识别抗原是免疫学研究的重点，分析抗原抗体结合常数可阐明胸腺细胞发育的取向。

C临床诊断检测血清或体液中化合物、激素、抗体水平。

D食品安全磺胺类物质检测、三聚氰胺三、三、三、三、BIAcoreBIAcore的应用领域的应用领域的应用领域的应用领域2.药物发现和筛选A药物靶标识别靶标识别、筛选是药物发现的早期步骤B药物与靶标结合性质药物先导化合物的优化，药物与靶标的动力学数据三、三、三、三、BIAcoreBIAcore的应用领域的应用领域的应用领域的应用领域3.核酸/核酸、核酸/蛋白互作分析A启动子结合蛋白转录因子与启动子结合控制基因活动B病毒衣壳蛋白包装病毒衣壳蛋白由大量的相同蛋白亚单位构建成三维结构。

了解组装动力学有利于病毒遗传复制机理的发现。

C核酸氨基酸相互作用转运RNAD调控蛋白凋亡调控蛋白三、三、三、三、BIAcoreBIAcore的应用领域的应用领域的应用领域的应用领域4.蛋白质分析和蛋白质组学A抗原抗体相互作用B膜蛋白研究胞内蛋白如何进入胞外，细胞器之间蛋白质转运。

C细胞通讯机制细胞间相互识别、相互反应和相互作用的机制D蛋白质组学蛋白质相互作用关系、调控关系蛋白质与糖类形成糖蛋白SPR-MS技术膜蛋白细胞通讯机制三、三、三、三、BIAcoreBIAcore的应用领域的应用领域的应用领域的应用领域一、大量已发现的蛋白质功能未得到解释二、蛋白质组学技术发现更多的差异蛋白质三、几种技术结合使用双向电泳、SPR-MS、质谱法、圆二色谱法、核磁共振法SurfacepreparationSampleInjectionRegenerationBIAevaluation四、四、四、四、BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程pHScoutingImmobilizationRegenerationpHScoutingSurfaceTestSingleInjectionMultiplexInjectionSpecificKineticsAffinityConcentration四、四、四、四、BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程1.准备工作A选择配体样品性质、亲疏水性、等电点、含盐量、缓冲液成分B选择芯片和耦联方式根据样品特性选择C选择合适的耦联浓度30-50ug/mlD选择合适的耦联量最大耦联量、固定流速和时间四、四、四、四、BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程2.pH值选择（pHScouting）A目的使配体与芯片表面接近B如何选择合适的pH值？

选择在pKa和蛋白质pI之间的某一pH值，用此pH值的NaAC稀释配体。

C判断pH值合适的依据2.pH值选择（pHScouting）C判断pH值合适的依据吸附能力最强的一种pH值大部分蛋白质在pH4.5时均可达到较好吸附效果四、四、四、四、BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程NHSN-羟基丁二酰亚胺EDC碳二亚胺盐酸盐四、四、四、四、BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程3.耦联（Immobilization）A耦联的定义配体与芯片表面发生共价结合B氨基耦联原理NHS/EDC活化羧基后与蛋白质胺基形成化学键的过程C耦联结果分析1234四、四、四、四、BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程3.耦联（Immobilization）C耦联结果分析1.基线2.表面活化后基线3.注入配体后RU值4.乙醇胺封闭后RU值5.最大耦联量4.进样分析（SampleInjection）A设置对照通道空白对照、阴性对照、阳性对照B进样方式单样品进样、多样品进样C结果分析如何判断是否结合？

四、四、四、四、BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程四、四、四、四、BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程4.进样分析（SampleInjection）A设置对照通道空白对照、阴性对照、阳性对照B进样方式单样品进样、多样品进样C结果分析如何判断是否结合？

单个蛋白质蛋白质混合物四、四、四、四、BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程4.进样分析（SampleInjection）A设置对照通道空白对照、阴性对照、阳性对照B进样方式单样品进样、多样品进样C结果分析如何判断是否结合？

捕获模式进样若干种蛋白质分别进样四、四、四、四、BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程4.进样分析（SampleInjection）A设置对照通道空白对照、阴性对照、阳性对照B进样方式单样品进样、多样品进样C结果分析如何判断是否结合？

四、四、四、四、BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程5.芯片再生（Regeneration）A芯片再生的定义固定在芯片上的配体与分析物结合后，将分析物从配体上洗脱的过程。

B再生条件摸索低pH/高盐、高pH、SDS从温和条件到严苛条件最大再生100次左右C再生结果判断根据表面测试后基线稳定性判断四、四、四、四、BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程5.芯片再生（Regeneration）B再生条件摸索通用：

低pH特殊情况：

高盐（5MNaCl;

4MMgCl2）高pH（50mMNaOH）0.5%SDS从温和条件到严苛条件最大再生100次左右Onesensorchipcanbeusedforrepeatedmeasurement50100run四、四、四、四、BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程5.芯片再生（Regeneration）C再生结果判断根据表面测试后基线稳定性判断理想的再生：

结合RU值稳定，基线持平；

不完全再生：

结合RU值降低，基线增加；

过度的再生：

结合RU值降低，基线降低；

6.BIAevaluation软件分析A特异性（Specificity）结合有无B动力学常数计算（Kinetics）结合速度C亲和性常数计算（Affinity）结合强度D浓度分析（Concentration）结合的量四、四、四、四、BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程concentrationKinetics?

HowFast?

affinity?

HowStrong?

HowMuch?

Specificity?

YesorNo?

四、四、四、四、BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程6.BIAevaluation软件分析A特异性（Specificity）结合有无kakdKineticsWhataretheratesofassociationanddissociation?

四、四、四、四、BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程6.BIAevaluation软件分析B动力学常数计算（Kinetics）结合速度C亲和性常数计算（Affinity）结合强度四、四、四、四、BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程6.BIAevaluation软件分析D浓度分析（Concentration）结合的量类似于Bradford法定量蛋白质LowLowHighHighConcentrationConcentrationAffinityAffinityKineticsKineticsSpecificitySpecificity四、四、四、四、BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程6.BIAevaluation软件分析E用于不同分析目的的耦联量要求分析特异性分析：

耦联量适中浓度分析：

耦联量较大亲和性分析：

耦联量较低动力学分析：

耦联量极低四、四、四、四、BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程7.BIAcore样品回收A从“IFC”回收可实时监测回收量，回收量较小B从“表面回收装置”回收无实时监测功能，回收量较大C所有试剂均与MS兼容四、四、四、四、BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程8.BIAcore分析的优缺点A优点实时监测生物大分子结合情况，并可计算动力学数据样品无需标记对样品成份无特殊要求B缺点存在假阳性的情况无法鉴别互作物质对温度敏感