如何以及为何要鉴别唾液酸化作用资料下载.pdf

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关于知识产权，引起药品创新者和生物仿制药物研发者特别关注的是，有一些关键药品专利是以生物药剂学唾液酸化作用的特别模式为基础的。

此外，根据国际协调会议（ICH）Q6BIIQ5E指导原则，持续唾液酸化作用模式的说明是证明药物研发和生产过程中产品一致性的一个必需部分。

64Phan11aTechnology医药技术B享sialylationreferstothetypeandanti-inflammatorypropertiespossibilityofimmunogenicityRegardingintellectualproperty,维普资讯http:

/制造业糖蛋白在体内起着重要作用。

在免疫应答中涉及到的几乎所有的关键分子，包括抗体，都是糖蛋白。

很多重要的激素也是糖蛋白。

可以合成这些结构供生物药剂学应用。

在结构上，糖蛋白一种含有寡糖（来自希腊文“少（oligo）”，意思是“少的”，以及”糖类（saccharide）”，意思是“糖”）链的蛋白质。

这些寡糖链被称为聚糖，在蛋白质生物合成的早期共价结合到蛋白质的多肽链上。

糖蛋白中所含糖的类型包括己糖和唾液酸。

唾液酸残基位于聚糖的非还原端，是亲水性的，且带负电荷（见图1）。

唾液酸化作用的降低可导致体内半衰期缩短以及生物活性显著降低。

如果唾液酸末端残基被去除，则得到的蛋白质就是“不含唾液酸的”糖蛋白。

维持正常的人类唾液酸化作用类型唾液酸是一个9碳单糖家族，含有带负电荷的羧酸酯基和其它修饰基团，包括N一乙酰基和N一羟乙酰基。

在哺乳动物表达系统产生的生物制剂中发现的唾液酸残基两种主要类型是N一乙酰基一神经氨酸（NeuAc）和N一羟乙酰基一神经氨酸（NeuGc）。

这些基团通常是附着到半乳糖（Ga1）残留物氦一连接和氧一连接聚糖非还原端的末端结构。

控制NeuAc：

NeuGc比率对于生物产品生产商来说至关重要，这是因为NeuAc是符合需求的正常人类型唾液酸化作用，而NeuGc是在非人类糖蛋白中发现的，被认为是不合需求的，是治疗性糖蛋白的变体唾液酸化作用形式。

我们对于NeuAc对NeuGc安全性的理解，仍然有待于在AjitVarki教授极其同事的实验室中进行的先驱性工作。

目前，我们建议生物制品生产商遵循基于风险的方法对其药品进行唾液酸化作用，并且以NeuAc：

NeuGc比率最大化为目标。

该比率的一个重要影响是对细胞培养基成分的影响。

varki教授已经证明细胞可以从营养素的糖蛋白中获取唾液酸，然后将这些唾液酸基团结合到自身的糖结合物中。

药品生产过程中培养基所用的非人类血清可能含有NeuGc，该物质可能存在于最终产品中并导致最终产品不符合质量标准。

在整个细胞培养过程中以及在将培养基添加到细胞中之前，采用适当的过程分析技术（PAT）测定培养基中NeuAc：

NeuGc比率，可容许你控制培养基状态，保持NeuGc在可接受的水平内。

测定NeuAc：

NeuGc比率一种广泛使用的NeuAc：

NeuGc比率测定方法是采用荧光剂1，2-氨基一45-亚甲基一二羟苯酮（DMB）标示的唾液酸进行高效液相色谱法（HPLC）分析。

处理用于批签发的最终品质控制，DMB分析足够快，可用于监测收获产品之前整个细胞培养基中非人类唾液酸化作用水平的PAT方法。

这一早期警报系统可以节省大量时间和金钱，并显著降低产品批次失败的风险。

DMB分析的步骤是采用弱酸性水解作用（比如采用2摩尔乙酸在80C下放置2Jx时）将唾液酸从治疗性糖蛋白上脱离下来，采用DMB进行标示，然后通过连二亚硫酸钠还原进行稳定化。

采用具有荧光检测的HPLC在c18碳链长度对OMB标示的唾液酸进行分析。

ofparticularconcerntobothdruginnovatorsanddevelopersofbiogenericsisthattherearekeydrugpatentsbasedonspecificpatternsofbiODharmaceuticalsialylationFurthermoreunderthelnternationalConferenceonHarmonisation（ICH）Q6BandQ5EguidelinesthedemonstrationofaconsistentsialylationpatternisanecessarypartofshowingproductconsistencyduringdrugdevelopmentandproductionGlycoproteinsplayvitalrolesinthebodyAlmostallofthekeymoleculesinvolvedinthejmmuneresponseincludingantibodies，areglycoproteinsAnumberofimportanthormonesareglycoproteinsThesestructurescanbesynthesisedforbiopharmaceuticaluseStructurally，glycoproteinsareproteinsthatcontainacarbohydrateelementofoligosaccharidechains（fromtheGreek“oligo”。

meaning。

few”，and“saccharide”，meaning“sugars”）TheseoIigosaccharidechains，calledglycans，becomecovalentlyaachedtotheproteinspolypeptidedunngtheearlystagesoftheproteinsbiosynthesisThetypesofsugarscontainedinglycoproteinsincludehexosesandsialicacidsThesialicacidresiduesarelocatedatthenonreducingterminioftheglycansandarehydrephilicandnegativelycharged（seeFigure1）Reductioninsialylationcanresultinshorterinvivohalfl舱andsignificantlylowerbiologicalactivity1ftheterminalresiduesofsialicacidareremovedtheresultingproteinsareknownas“asialo”glycoproteinsRetainthenorma1humansialylationtypesSialicacidsareafamilyof9一carbonmOnOsaccharidesbearingnegativelychargedcarboylategroupsandothermodificationsincludingN-acetylandN-glycolylgroupsThetwomaintypesofsialylresiduesfoundinbiopharmaceuticalsproducedlnmammalianexpressionsystemsareNaceblneuraminicacid（NeuAc）andNglycolylneuraminicacid（NeuGc）Theseusuallyoccurasterminalstructuresattachedtogalactose（Ga1）residuesatthenonreducingterminiofbothnitrogenlinkedandoxygenlinkedqlycansControllingtheratioofNeuActoNeuGciscriticalforbiomanufacturersbecauseNeuAcisthedesirednormalhumantypeofsialylationwh_leNeuGcisfoundinnonhumanglycoproteinsandisconsideredanundesiredaberrantformofsialylationfortherapeuticglycoproteinsOurunderstandingofthesafetyofNeuAcversusNeuGcisstillunfoldingwithpioneeringworkbeingdoneinthelabsofProfAjitVarkiandcolleaguesCurrently,weadvisebiomanufacturerstofollowarisk-basedapproachtosialylationoftheirdrugsandaimtomaximisetheratioofNeuActoNeuGcAmajorinfluenceonthisratioisthecompositionoftheeellculturemediumVarkihasshownthatcellscanscavengesialicacidsfromglycoproteinsinnutrientsandincorporate医药技术Phar|T1aTechnology65维普资讯http:

/66目前，我们建议生物制品生产商遵循基于风险的方法对其药品进行唾液酸化作用并且以NeuAc：

NeuGc比率最大化为目标为了获得准确、可靠的NeuAc：

NeuGc定结果，我们建议采用三个标准品进行校准：

a含有人类和动物组织中所发现唾液酸的混合物的唾液酸参考品。

该物质被用作系统适合性标准品，并且有助于鉴别药品中的任何不正常唾液酸。

b定量NeuAc标准品。

可采用该标准品的系列稀释溶液在HPLC上获得一个标准浓度一荧光反应曲线。

c定性NeuGc标准品。

该标准品可以单独使用，也可以添加到用于HPLC上滞留校准的等量NeuAc标准品中。

图2显示DMB标示的唾液酸参考品的典型HPLC示踪。

图2：

DMB标示的唾液酸参考品的典型构型，该参考晶含有人类和非人类型唾液酸残留物Figure2：

TypicalprofileforaDMBlabelledsialicreferencepanelcontainingbothhumanandnonhumantypesialicacidresidues米800600400200100thesesialylgroupsintotheirownglycoconjugatesNonhumanserausedinmediaduringdrugproductioncaneontainNeuGethatcanenduPinthefinaIproduetwhiehthengoesoutofspecificationMeasuringtheNeuAetoNeuGeratiowithappropriateprocessanalyticaltechnology【PAT）throughoutthecefIcuftureandonreedfabeforetheyareaddedtothecellsaIlOWSyoutocontrolcultureconditionstokeepNeuGcwithinacceptablelevelsDeterminetheNeuAe：

NeuGeratioAwidelyusedmethodfordetermininqtheNeuAc：

NeuGcratioishighperformanceliquidchromatography【HPLC）analysisofsialicacidsfabelledwiththefluorescentaqent12-diamino一45一methylenedioxybenzene【DMB）AswellasuseinfinalquatycontrolforlotreleaseDMBanalysisjsfastenoughtobeusedasaPATmethodformonitorinqlevelsofnonhumansialylationthroughoutcellculturebeforeproductharvestingThisearlywarningsystemcansaveagreatdealOftimeandmoneyandsignificantlyredUCCtheriskofproductbatchfallureThestepsforDMBanalysisarereleaseofthesialicacidsfrOmthetherapeuticglycoproteinusingmildacidhydrolysis（suchas2molaraceticacidfortwohoursat80oC）fluorescentlabenqusinqDMBthenstabilisationbyreductionwithsodiumdithioniteTheDMBlabelledsialicacidsareanalysedbyHPLC，atcarbonchainlengthC18，withfluorescencedetectionTogeta