紫杉醇对骨髓细胞体外诱导分化的巨噬细胞影响.docx
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紫杉醇对骨髓细胞体外诱导分化的巨噬细胞影响
紫杉醇对骨髓细胞体外诱导分化的巨噬
细胞影响
（作者：
单位：
邮编：
）
作者：
李龙，沈红，陈静，赵勇
【摘要】目的：
研究紫杉醇对小鼠骨髓分化巨噬细胞的直接影
响。
方法：
常规方法无菌制备BALB/c小鼠骨髓细胞，用含M[CSF的RPMI1640培养液培养7d,同时加入不同浓度紫杉醇，通过流式细胞术对骨髓单核细胞分化的巨噬细胞的表型分子、吞噬功能进行测
定，采用迟发型过敏反应（DTH）方法检测巨噬细胞免疫原性。
结果:
紫杉醇明显降低骨髓单核细胞分化成巨噬细胞的数量；F4/80+巨噬
细胞表面分子CD80、CD14表达升高，而LAd表达降低；紫杉醇提高分化的巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力；但使其免疫原性降低。
结论:
紫杉醇能使骨髓单核细胞分化的巨噬细胞细胞吞噬能力提高，但其
免疫原性下降，提示紫杉醇可能具有调节巨噬细胞免疫功能的作用。
【关键词】紫杉醇；巨噬细胞；吞噬
紫杉醇最早是从北美短叶红豆杉树皮中分离得到的双萜酰胺类化合物，由于其具有独特的抗癌活性而成为当今抗癌药物研究的热
点。
紫杉醇抗癌作用一是诱导和促进肿瘤细胞微管蛋白聚合而不发生解聚，使微管过于稳定从而抑制纺锤体的形成，致使染色体不能向两极移动最终阻止有丝分裂的完成，从而抑制肿瘤细胞生长；二是紫杉醇调节多种凋亡相关的基因或蛋白，诱导细胞凋亡[1,2];三是紫杉醇激活巨噬细胞产生NO、IL、TNF]a等杀灭肿瘤细胞]3]。
其他研究还表明，紫杉醇具有LPS样作用，即紫杉醇能够作用免疫细胞，尤其是巨噬细胞，下调巨噬细胞表面TNF_a受体的表达，诱导TNF[a的释放也能促进IL]1、IFN[a和IFN]B的释放。
还有研究表明，在大鼠的器官移植模型中，紫杉醇能够降低受者产生抗供者的细胞毒性抗体，而且能降低细胞毒性T细胞的活性和IL]2的产生，结果提示在器官移植中紫杉醇可能有潜在的免疫抑制作用[4]。
巨噬细胞是
紫杉醇作用的主要效应细胞，研究紫杉醇对巨噬细胞分化能力的直接影响，为紫杉醇作为免疫调节剂应用提供实验依据。
1材料和方法
1.1材料CO2培养箱为日本SANYO产品，FASCalibur型流式细胞仪购自美国BectonDickinson公司，千分尺购自BrownSharpe公司，RPMI1640培养基、胎牛血清购自美国HyClone公司,MjCSF、紫杉醇抗FcRmAb（2.4G2,移植生物学实验室制备）和8.3g/L红细胞裂解液（Tris]NH4Cl）购自Sigma公司，DMSO
（Amresco,ACS,Grade）,羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE;MolecularProbes,Inc.Eugene,OR）。
PE标记的抗小鼠F4/80单克隆抗体（mAb）（BM8）,PE标记的大鼠抗小鼠的l[AdmAb
（39]10]8）,FITC标记的仓鼠抗小鼠的CD80（B71）mAb（16]1OA1;lgG2b）,FITC标记的大鼠抗小鼠的CD14mAb（M©P9;lgG2b）,FITC标记的大鼠抗小鼠的CD11bmAb（M1/70;IgG2b）,以上抗体均购自于BDBiosciencesPharmingen（SanDiego,CA）。
SPF级6~8周龄雌性BALB/c小鼠和SPF级6〜8周龄雌性C57BL/6小鼠均购于军事医学科学院实验动物中心。
1.2方法
1.2.1小鼠骨髓单核细胞的制备取BALB/c小鼠颈椎脱臼致死。
无菌剥取胫骨、股骨和髂骨，剪去骨两端，用RPMI1640冲洗骨髓腔得到骨髓细胞，1600r/min,离心6min,弃上清，加入红细胞裂解液消化红细胞，然后用RPMI1640培养液洗3次，将分离得到的骨髓细胞加入培养皿中，37C、50mL/LCO2培养箱中培养2h。
吸取未贴壁细胞，1600r/min,离心6min,细胞计数，调整细胞密度为1X109/L,加入6孔细胞培养板，然后向其加入含100血/LM[CSF的RPMI1640完全培养液，37C、50mL/LCO2培养箱内培养7d
:
5]。
1.2.2实验分组分3组：
M[CSF组（100血/L）、M[CSF+紫杉醇（20⑷/L）组和M]CSF+DMSO（1g/L）组，每组设4个重复孔，所有实验重复3次。
1.2.3流式细胞术检测收集诱导分化培养7d的各组细胞于离心管内，分别加入FACS缓冲液，将细胞稀释成调成4X109/L,取100山悬浮的细胞，加2.4G210也封闭细胞表面Fc受体。
同时加入不同荧光标记的抗体各10也混匀，4C孵育30min。
加入FACS缓冲液,1600r/min,离心5min,洗去游离的荧光抗体，重复2次。
轻轻混匀悬浮细胞，上流式细胞仪测定］6］。
1.2.4巨噬细胞吞噬鸡红细胞的测定①巨噬细胞的收集：
收集诱导分化培养7d的各组细胞，用RPMI1640调细胞密度为2X108/L,加入24孔细胞培养板，培养2h。
②CFSE标记鸡红细胞：
鸡翅采血，制备新鲜鸡红细胞，PBS洗2次，调整细胞密度为4X1010/L,加入CFSE5.0gmol/L,37C、15min,PBS洗2次，调整CFSE标记的细胞密度约为2X109/L,然后将其加入到含有巨噬细胞的24孔培养板中，37C、50mL/LCO2培养箱共孵育2.5h,收集细胞，上流式细胞仪检测。
1.2.5迟发型过敏反应（DTH）制备BALB/c小鼠脾细胞，免疫C57BL/6小鼠,10d后取C57BL/6脾细胞,调整细胞密度4X108/L,作为刺激细胞。
收集诱导分化7d的巨噬细胞，调整细胞密度为4X108/L,作为反应细胞。
反应细胞和刺激细胞1：
混合，给正常
C57BL/6小鼠耳朵皮层内注射。
用千分尺分别测量注射前和注射后24h和48h小鼠耳朵厚度［7］。
1.2.6统计学分析实验数据都以x±s表示，平均数间比较用
t检验,方差不齐时用t‘检验P0.05差异具有统计学意义。
2结果
2.1紫杉醇对诱导分化的巨噬细胞形态和分化的影响用
MjCSF和加入不同浓度紫杉醇（5、10、15、20gg/L）的
RPMI1640培养液培养骨髓细胞7d,收集诱导分化的巨噬细胞，对不同处理组的细胞形态和数量进行分析，结果显示，M]CSF和DMSO组细胞形态没有变化（图1A）。
不同浓度紫杉醇都能抑制骨髓细胞分化成巨噬细胞（图1B）,10〜20血/L紫杉醇使骨髓细胞分化成巨噬细胞数量明显降低（P0.05）。
与对照组比较，20血/L紫杉醇处理骨髓细胞对诱导分化成的巨噬细胞表面的特异标志物F4/80表达没有
影响，各组巨噬细胞表面分子F4/80表达的阳性率接近100%（图
1C）。
图1紫杉醇诱导分化的巨噬细胞形态和数量的变化（略）
Fig1Thecellcountandmorphologyofmacrophagesinducedbypaclitaxel
A:
Themorphologyofmacrophagesindifferenttreatedgroups;B:
Thecellcountofmacrophagestreatedwithpaclitaxel;C:
Theidentificationofmacrophagesstainedwithanti_|F4/80
monoantibody.
2.2紫杉醇对诱导分化的巨噬细胞表面标志的影响利用荧光
素标记的小鼠mAb,对分化发育的巨噬细胞表面分子进行双染色检测（图2）,结果显示紫杉醇处理组的巨噬细胞表面表达的共刺激分子CD80升高，LPS受体CD14表达升高，但是MHCH分子（]Ad）表达降低。
图2紫杉醇诱导巨噬细胞表面分子的表达
Fig2Theexpressionofsurfacemoleculesinmacrophageinducedbypaclitaxel
A:
TheexpressionofCD80,CD14orIjAdinF4/80+（CD11b+）macrophagesdetectedbyFCM;B:
StatisticanalysisontheexpressionofIJAd,CD80andCD14inmacrophagestreatedwithpaclitaxel.aP0.05vsMJCSF.
2.3紫杉醇对分化的巨噬细胞吞噬能力的影响通过流式细胞术检测巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力（图3）,与对照相比，紫杉醇处理能明显提高分化发育的巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力（P0.01）。
图3紫杉醇对巨噬细胞吞噬能力的影响（略）
Fig3Effectsofpaclitaxelonthephagocytosisofmacrophages
A:
PhagocytosisofmacrophagesonCFSElabeledcRBCsdetectedbyFCM;B:
Statisticanalysisonphagocytosisrateofmacrophagesindifferentgroups.bP0.01vsM[CSF.
2.4紫杉醇对诱异分化的巨噬细胞的免疫原性影响用紫杉醇
处理骨髓细胞诱导分化得到的巨噬细胞和经过预处理的异基因小鼠的脾细胞同时给小鼠耳朵皮层注射，24h后观察小鼠耳朵厚度的变化。
与对照组比较，紫杉醇处理组的巨噬细胞使小鼠发生轻度DTH
反应，小鼠耳朵增厚的能力明显降低（P0.05,图4）,而M]CSF和DMSO分别使小鼠发生重度和中度DTH反应。
图4紫杉醇处理的巨噬细胞诱导的DTH反应（略）
Fig4DTHreactioninducedbypaclitaxelJtreated
macrophages
aP0.05vsMCSF.
3讨论
有研究表明紫杉醇还能够降低受者产生抗供者的细胞毒性抗体，降低细胞毒性T细胞的活性和IL]2的产生，降低排斥反应从而延长受者的存活时间，提示紫杉醇可能具有免疫抑制作用，未来可开发为免疫抑制剂应用在器官移植，尤其是肿瘤患者的器官移植。
近几年来，人们对巨噬细胞有了新的认识，把巨噬细胞分成经典激活的巨噬细胞和替代激活的巨噬细胞，在免疫系统中的调节替代激活的巨噬细胞主要表现为作用选择性免疫抑制和抑制淋巴细胞增殖、促进
Th1向Th2型转化。
紫杉醇能够抑制排斥反应，此作用与巨噬细胞发育分化有无关系未见报道。
本实验中在诱导骨髓细胞分化成巨噬细胞的过程中加入紫杉醇，研究紫杉醇对巨噬细胞发育分化和功能的影响。
采用流式细胞术分析巨噬细胞表面分子，结果表明，紫杉醇处理骨髓细胞，培养7d分化发育的巨噬细胞共刺激分子（CD80）表达升高，MHCH分子表达降低。
吞噬作用是机体的重要防御手段，是评价巨噬细胞生物学功能的重要指标之一，吞噬试验结果显示紫杉醇能明显增强分化发育的巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力。
巨噬细胞作为
一类重要的抗原提呈细胞，在引发获得性免疫中起着重要的作用。
DTH实验是常用的检测巨噬细胞免疫原性的实验手段。
DTH反应表
明紫杉醇能降低巨噬细胞免疫原性，研究结果与一些文献报道的替
代激活巨噬细胞的生物学特性（吞噬能力增加，抗原提呈能力降低
等）相符合[8],提示体外骨髓细胞诱导分化成巨噬细胞的过程中，加入紫杉醇处理得到的巨噬细胞可能为替代激活的巨噬细胞。
替代激活
的巨噬细胞具有选择性免疫抑制和抑制淋巴细胞增殖的特性，这为
未来开发紫杉醇作为免疫抑制剂应用于移植免疫提供理论基础和实验依据。
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