发酵工程实验讲义Word文件下载.docx
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6、冷却：
发酵结束，将酸奶从发酵室取出，用冷风迅速将其冷印到10℃以下，一般2h，使酸奶中的乳酸菌停止生长，防止酸奶酸度过高而影响口感。
7、冷藏和后熟：
经冷却处理的酸奶，贮藏在2-5℃的冷藏室中保存。
8、感官指标
1）色泽：
色泽均匀一致，呈乳白色，或稍带微黄色。
2）组织状态：
凝块稠密结实均匀细腻，无气泡，允许少量乳清析出。
3）气味、味道：
具有清香纯净的乳酸味，无酒精发酵味，无霉味和其他外来不良气味。
（二）乳酸菌活菌检测
1
①、检测培养基：
蛋白胨15g，牛肉膏5g，葡萄糖20g，氯化钠5g，碳酸钙10g，琼脂粉20g，水1000ml，115～121℃灭菌20min，灭菌后放置水浴52℃保温备用。
②、稀释：
取10克样品放入添加90ml无菌水的带玻璃珠的250ml三角瓶中，摇床180rpm1－样品溶液；
再从中取1ml至添加9.0ml震荡30min，即为10无菌生理盐水的三角26－－，即稀释了10010万倍瓶中，稀释至10;
，……以此类推稀释至-4-5-6的乳酸菌悬液中取1ml101010、，在无、③、倒制培养平板，分别从上述已稀释到菌操作台上注入90cm培养皿中，再将已经灭了菌的保持在52℃水浴锅中的呈溶解状态的培养基，倒入15毫升左右于培养皿中，全部浸到培养皿，与菌悬液充分混合均匀（倒入培养基后，马上用手转动培养皿，转动几下，让其混合均匀），然后等其凝固再移入培养箱中培养，注意最后一步倒平皿必须在超净台无菌操作，以免杂菌污染。
每次稀释均要换灭好菌的移液管。
④、培养条件：
37℃恒温培养箱培养48～72h
⑤、培养完毕后，取出进行计数，因为是稀释了1万、10万、100万倍，所以一个透明圈菌落代表1万、10万、100万/克，如果有200个透明圈，则是200万、2000万、2亿/克。
2
实验结果：
1、对酸奶的评价：
香味很浓郁，口感丝滑，无其他气味，但是略酸，可能是糖加的比较少。
色泽均一，呈乳白色。
瓶子上层酸奶较稀，下层凝块稠密。
2、乳酸菌活菌检测结果：
10-4-5-6样品溶液1010样品溶液样品溶液
第一组菌数38554178
第二组菌数48118350
第三组菌数535
381
40
237（2370万303（303/克）万/克）207（2.07亿/平均值克）
实验分析：
1、接种时是从高浓度到低浓度的顺序来的，因此，可能存在一些误差。
2、每次接种后没有清洗移液管，造成较大的误差。
（PS：
因为我们忘了拍照，所以只记录了数据，没有图片。
）
思考题：
乳酸菌的保藏通常为低温条件，这给运输带来很大的成本，请问可采用什么方法使乳酸菌在常温条件下有很高的存活率以减少运输成本？
答：
在基因水平上对乳酸菌进行基因重组，进而获得耐高温乳酸菌。
在基因库里筛选抗高温的基因并利用基因重组技术将其重组在乳酸菌基因上，对乳酸菌的基因进行修饰使其表达，以此来获得耐高温菌株。
3
1、学习了解固态发酵原理；
2、以枯草芽孢杆菌为对象，了解固态发酵的控制技术；
3、掌握枯草芽孢杆菌活菌计数方法与操作。
作为抗生素的替代品，益生菌和酶制剂等的研究与开发近几年成为绿色饲料添加剂的热点，其中益生菌倍受关注。
作为益生菌的一种，芽孢杆菌制剂在动物生产中的研究和应用一直都是畜牧业科研和生产人员关注的焦点。
目前芽孢杆菌多采用液体深层发酵技术，再经喷雾干燥进行生产，对设备要求高，生产工艺复杂；
而固体发酵采用的原料一般是廉价的农副产品（如草粉、麸皮等），采用的设备也较液体发酵简单，生产成本大大低于液体发酵。
所以近年来各生产厂家都在积极探索芽孢杆菌的固体发酵技术，以求简化生产工艺，提高产量，降低生产成本。
固态发酵定义：
指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性固态基质中，培养一种或多种微生物的生物反应过程，其是以气相为连续相的生物反应过程。
枯草芽孢杆菌属于好氧微生物，实验室条件下利用稀释涂布培养的方法，让菌在有氧条件下生长，每个单菌落代表一个微生物细胞。
枯草芽孢杆菌
培养基成分
培养箱、灭菌锅，培养皿
1、液体种子培养基配制：
葡萄糖0.2%，NaCl0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，pH7.0。
2、液体种子培养：
每300mL三角瓶装量50mL液体种子培养基，在115℃条件下灭菌30min。
降温后从斜面接一环菌苔至种子培养基。
置37℃控温摇床培养。
转速200r·
min-1，至芽孢率达90%以上时停止，约需24h。
4
3、固体发酵培养基：
麸皮60%，稻壳10%，玉米粉5%，豆粕25%，硫酸镁0.05%，硫酸铵0.5%，料水比为1:
1.1。
4、三角瓶固体发酵培养：
每250mL三角瓶装量30g（湿重），固体发酵培养基原料试剂混合料，加水，料水比为1:
1.1，搅拌均匀，培养基经121℃灭菌30min，降温后接种量为3ml（V/M：
V—液体菌种体积数，M—固体发酵培养基的质量），然后置37℃培养箱中静止培养，间时拍打，使其均匀生长。
至脱落芽孢率为80%以上时，停止发酵，约需48h。
然后于60℃烘干、粉碎、计活菌数。
枯草芽孢菌活菌检测
葡萄糖0.2%，NaCl0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，琼脂粉2%，pH7.0。
115℃灭菌20min，灭菌后放置水浴52℃保温备用。
再从中取1ml至添加9.0ml震荡30min，即为10无菌生理盐水的三角27－－，即稀释了1千万倍;
，……以此类推稀释至10瓶中，稀释至10③、倒制培养平板，将已经灭了菌的保持在52℃水浴锅中的呈溶解状态的培养基，倒入15-5-6、10分别从上述稀释到10、毫升左右于培养皿中，全部浸到培养皿，待培养基凝固；
10-7倍的菌悬液中取0.2ml于已凝固的培养基表面，用玻璃刮铲涂布均匀，静止10min，然后再移入培养箱中培养。
37℃恒温培养箱培养24～48h；
⑤、培养完毕后，取出进行计数，因为是稀释了10万、100万、1千万倍，所以一个透明圈菌落代表50万、500万、5千万/克。
5
实验结果：
详细描述枯草芽孢杆菌固态培养物：
1、枯草芽孢杆菌呈淡黄色，中间颜色较深，表面较平整，无光泽，边缘不整齐，形成的菌落为圆形。
培养基中的枯草芽孢杆菌有腥臭味，长势良好，无明显染菌现象。
记录个人活菌测定中各平行数据，计算最终平均值。
2、
10-510-610-7
16377166第一组菌数36
第二组菌数257
938
100（50亿8.1162（亿/克）/克）/平均值4.275855（亿克）
3、实验结果：
在枯草芽孢杆菌固态培养过程中，为了防止霉菌与酵母的污染，可采用什么方法？
答：
可以加入抗真菌制剂。
6
1．了解酒精发酵的主要类型、工艺原理及其控制条件
2．熟悉酒精生产的工艺流程、掌握酒精发酵的操作方法
3.掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法
4.掌握在实验室中模拟酒精发酵的工艺流程
玉米粉、大米粉中可供发酵的物质主要是淀粉，而酿酒酵母由于缺乏相应的酶，所以不能直接利用淀粉进行酒精发酵，因此必须对原料进行预处理，包括蒸煮（液化）、糖化等，蒸煮可使淀粉糊化，并破坏细胞，形成均一的醪液，能更好的接受糖化酶的作用，并转化为可发酵性糖，以便酵母进行酒精发酵。
在无氧条件下酵母菌利用可发酵性糖转化为酒精和二氧化碳的作用，称为酒精发酵，是生产酒精及各种酒类的基础，可通过测定发酵过程中产生CO的量和最终产物酒精的量得2知酵母的发酵能力。
活性干酵母
培养基各成分、大米粉、活性干酵母、淀粉酶、糖化酶、大可乐瓶（学生自备）
溶液：
10%H2SO4、1%K2Cr2O7、10%NaOH
试管、培养箱、灭菌锅、三角瓶、水浴锅、粉碎机、离心机
实验内容
1、原料的粉碎
将玉米、大米用粉碎机粉碎到一定程度，玉米淀粉含量为70%，大米淀粉含量为75%。
2、蒸煮糊化
称取一定量的粉碎后淀粉质原料，按照一定的料水比（100g：
200ml），调制淀粉乳，90-100℃条件下恒温水浴加热，淀粉乳受热后，在一定温度范围内，淀粉粒开始破坏，晶体结构消失，体积膨大，粘度急剧上升，呈粘稠的糊状，即成为非结晶性的淀粉。
3、糖化
经蒸煮糊化后的醪液，经过淀粉酶的糖化作用，将原料中的淀粉转化为可发酵性糖，供酵母利用。
7
缩短糖化时间，但酶用量太高，反而使复合反应严为加快糖化速度，可以提高酶用量，尽量延长糖化时间，应充分利用糖化罐的容量，重，最终导致葡萄糖值降低，在实际生产中，减少糖化酶用量。
。
绝干淀粉，糖化时间1h℃，ph4.5，酶2400U/g酶参考用量：
淀粉乳33%，60恒温下不断搅拌，℃，60pH4.5，往其中加入一定量的糖化酶（120U/g）糊化醪液调整直至粘度下降到一定程度，淀粉完全糖化。
、发酵4。
目的：
的温水中复水20min1:
20的比例投放于37℃）干酵母活化：
将干酵母按（1恢复酵母细胞的正常功能。
上清液于洁净的大可乐瓶中，加相同体积的水稀释，）淀粉醪液糖化后，取400ml（236h左右。
，混匀，28度培养箱中静止培养5ml加入活化好的酵母种液5、二氧化碳生成的检验1）观察三角瓶中的发酵液有无气泡溢出；
（于发酵液试管中，观察，如气体逐渐消失，则说明有二氧1ml）滴入210%氢氧化钠（化碳的存在；
、二氧化碳生产量的测定6W1;
）接种完，擦干瓶外壁，于天平上称量，记为（1；
记为W2）2实验结束，取出瓶轻轻摇动，使二氧化碳尽量溢出，在同一天平上称量，（=W1-W2）二氧化碳生成量（3、酒精生成的检验71）打开瓶塞，嗅闻有无酒精气味；
（2ml；
5ml，加10%硫酸
（2）取发酵液则说明有酒精产生。
滴，如颜色由黄色变为黄绿色，溶液）3再加入1%KCrO10-20（722）SO+CrCOOH+KOH+CH+HCrKOSOCH——CHSO（3
227243243242
8
1、实验数据：
W=820g1W=813g
2故二氧化碳生成量=820-813=7g
2、实验分析
①二氧化碳生成的检验：
培养后观察发现，瓶壁边缘有一小串微小气泡，称量后发现质量减少了7g。
②酒精生成的检验：
打开瓶塞，闻到有浓重的酒精气味，取发酵液5ml，加10%硫酸2ml，加1%K2Cr2O7溶液10-20滴，颜色由黄色变为黄绿色，实验现象如下图
现有3株不同来源的酒精酵母，请设计实验判断哪株酵母发酵酒精能力最强？
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1、了解米曲霉固体发酵产酶情况
2、掌握微生物固体发酵操作技术
3、了解纤维素酶提取方法及酶活性定性测定方法
纤维素酶是降解纤维素的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系，属于诱导酶，其产生需要纤维素类物质的诱导。
实验中以米曲霉为发酵菌株，稻草作为产酶诱导物。
米曲霉
土豆、稻草、麸皮、硫酸铵、羧甲基纤维素钠（CMC）
培养箱、灭菌锅、三角瓶、摇床、离心机、天平、三角瓶
1、米曲霉菌种活化
（1）配制PDA培养基：
称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖和20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），15磅蒸气（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。
（2）在无菌超净台上接种保藏的米曲霉于PDA斜面，28℃培养5-7天，斜面上长满孢子。
2、配制发酵培养基
15g麸皮+10g稻草粉，0.5%KH2PO4，0.5%（NH4）2SO4，加15ml水（加水量40%～60%），拌匀，装瓶；
3、灭菌
121℃灭菌30min，冷却至室温。
4、米曲霉孢子悬浮液制备
已培养好的米曲霉孢子斜面一支，加入约10ml无菌水，洗下孢子，制成孢子悬液。
5、接种
用移液管在无菌条件下吸取一定量的悬液，移入灭菌好的固体培养基中，于30度条件下培10
养96h，期间每隔12h摇动三角瓶一次。
6、提取粗酶液
向瓶中加入无菌水约50ml，浸泡固体曲30min-1h；
过滤得粗酶液。
7、酶活性测定
（1）配制1%CMC底物平板：
配方：
1g羧甲基纤维素钠，1.8g琼脂，100ml，琼脂完全溶解后，加入0.03g曲利本蓝，倒平板，每皿约15ml。
（2）打孔：
打孔器经酒精燃烧灭菌后，每平板打4孔，并在酒精灯火焰上稍稍加热打孔处，使孔周围的培养基微融，然后平放冷却。
（3）加样：
往孔内加入粗酶液适量（约100ul），同时需设对照。
（4）培养（反应）：
将加样后的平板小心平端放入30℃培养箱，放置20小时左右。
（5）观察结果：
可直接观察透明圈有无、测定透明圈直径。
11
、描述固体培养基发酵前后的状态。
1答：
固体培养基发酵前：
培养基颜色较浅，各成分新鲜，粘度大，成团状。
培养基营养成分被利用，体积缩小。
固体培养基发酵后：
培养基中产生较多黑色孢子及菌体，
图为发酵后培养基。
观察底物平板酶解前后的现象，并测量水解圈大小。
2、打孔滤纸
0.93:
23:
2：
3.13:
0.9第一组
3.2:
13.2:
0.92.8:
1.9第二组2.9:
2
0.9
：
第三组3.13:
0.9
3:
2.1
思考题从理论角度分析如何最大限度地通过酶法利用该资源？
而现纤维素是自然界最丰富的资源，实存在什么问题？
12
实验目的
1.了解并掌握液体发酵产酶操作及酶反应条件的控制
2.与固体发酵产酶进行比较分析
实验原理
甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，其主链是由吡喃甘露糖残基以1,4-β-D糖苷键连接而成。
当主链的某些残基被葡萄糖取代，或半乳糖通过1,6-α-糖苷键与甘露糖残基相连形成分枝，则称之为异甘露聚糖，主要有半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖。
甘露聚糖是半纤维素的第二大组分，在自然界中分布广泛，且多以异甘露聚糖的形式存在，同型甘露聚糖十分少见。
β-甘露聚糖酶以内切方式降解甘露聚糖主链产生不同聚合度的甘露寡糖和少量甘露糖，是甘露聚糖降解酶中最关键的酶。
甘露聚糖酶可广泛应用于食品、造纸、纺织印染等行业。
利用β-甘露聚糖酶可以制取有特殊保健作用的甘露寡糖。
在纸浆制造业，可用于代替碱法进行脱色、漂白。
在纺织印染方面，利用β-甘露聚糖酶与其它酶联合作用，能有效去除产品上粘附的多余染料，降低能耗和对环境的污染等。
甘露聚糖酶的工业化生产将在许多行业产生很大的经济和社会效益。
因此，近年来甘露聚糖酶逐渐成为国内外关注和研究的热点之一。
甘露聚糖酶是一种半纤维素酶，其产生需要一定的诱导物存在。
本实验以枯草芽孢杆菌为菌株，以魔芋粉为诱导物。
蛋白胨、酵母粉、氯化钠、魔芋粉
1.菌种活化
配制LB固体培养基：
蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L）（1，待琼脂充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），15磅蒸气（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。
（2）在无菌超净台上接种保藏的枯草芽孢杆菌于LB斜面，28℃培养2天。
2.配制产酶培养基：
蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，魔芋粉30g/L，13
3.以10%的体积量分装于三角瓶中（25ml液体培养基/250ml三角瓶），121℃灭菌20分钟；
4.菌悬液的制备
已培养好的枯草杆菌斜面一支，加入约10ml无菌水，洗下菌体，制成菌悬液。
5.接种
用移液管在无菌条件下吸取5ml悬液，移入灭菌好的固体培养基中，于37度200rpm条件下培养48h。
6.粗酶液提取
3000rpm离心收集得到粗酶液
7.酶解底物分析
准备两三角瓶，分别加入50ml自来水，46度水浴保温
8.往两三角瓶中各加入1g魔芋粉，然后其中一个加入粗酶液2ml，另一个加入2ml蒸馏水（做空白对照）。
以后每隔5-10min往两三角瓶中各加入1g魔芋粉，前后共加5g
9.酶解反应30-60min，期间观察反应现象。
14
1、描述液体培养基发酵前后的状态。
发酵之前的液体培养基的状态：
在配制产酶培养基时，魔芋粉难溶解，依旧是固体颗粒。
等完全灭完菌后，放正在实验台上，等冷却后，状态比较像固体培养基，但魔芋粉依旧不溶解，其颗粒均匀地分布于培养基中。
经过两天的培养之后，产酶培养基被液化，得到的是含有粗酶液的液体培养基，完全呈黄褐色的液体状。
2、观察底物水解前后的现象。
对照组：
魔芋粉结成团，透明，具有弹性，黏度很大，无法搅拌。
实验组：
魔芋粉已被完全酶解，三角瓶中完全是液体状的酶解产物，溶液呈透明状。
图示：
左侧为实验组，右侧为对照组。
1、魔芋粉的主要成分是葡甘露聚糖，吸水性好，膨胀率高，可被β-甘露聚糖酶分解从而降低黏性。
2、实验组中加入了含有β-甘露聚糖酶的粗酶液，其可分解魔芋粉，使得三角瓶液体的黏度降低。
3、对照组不含有β-甘露聚糖酶，所以随着魔芋粉的添加，黏度不断增大。
以本人液体发酵产酶为例，请详细介绍甘露聚糖酶定量测定的原理与方法。
15
1、从土壤中分离产抗生素的放线菌。
2、抗生素产生菌的抗菌谱测定。
3、掌握微生物的基本操作。
放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。
由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。
分离放线菌常用稀释倒平板法。
根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。
如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌（本实验加入重铬酸钾120㎎／L），霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。
再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。
放线菌可以产生抗生素，抑制其他菌种的生长，挑取纯菌落进行抗菌谱分析，指示菌为大肠杆菌（G-）和枯草芽孢杆菌（G+）。
实验器材及试剂
枯草芽孢杆菌、大肠杆菌
蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂、可溶性淀粉、硝酸钾、氯化钠、K2HPO4?
3H2O、MgSO4?
7H2O、FeSO4?
7H2O、酒精、土壤
培养箱、灭菌锅、三角瓶、摇床、天平、三角瓶、试管、棉塞、涂布棒、接种环
1、高氏一号培养基的制备
可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4?
3H2O0.5g，MgSO4?
7H2O0.5g，FeSO4?
7H2O0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.4。
配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。
112℃灭菌20分钟（实验中所用无菌器具均在此时灭菌）。
2、土壤取样及其悬液梯度稀释
选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。
先除去表层约2cm16
的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。
盛土的容器应是无菌的。
将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等，土样取回后应尽快投入实验。
3、称土样10g于盛有90mL无菌水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中-1浓度的菌悬液，静置30s。
另取装有9ml的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10无菌水-2-3-4-5-1浓度的土壤悬液10、10支，编号1010、1ml、10。
用无菌吸管无菌操作取的试管4-2-2浓度的土壤即为10使与9ml水混匀，并加入编号10的无菌试管中，并吹吸吸管3~4次，-5的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管）稀释液。
依此类推，直到稀释至10。
稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。
4、稀释倒平板法分离土壤中放线菌
-3-4-5菌悬液中吸取0.1-0.21010毫升菌悬液，分别注、10、3取支1毫升移液管分别从-3-4-5的培养皿内，每一梯度两个平板。
将温度为45～50、1010入编号℃的高氏一号培、10养基倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右）培养一周，每天观察培养基表面有无微生物菌落。
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