临床检验基础实验指导Word格式.docx

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1．采血部位应选择皮肤完整，不能有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症。

2．针刺应迅速，深度适宜（约2－3mm）。

待血液自行流出，擦去第一滴血。

3．微量吸管取血时应将微量吸管管尖侧着插入血滴中央。

若血流不暢，可以左手自采血部位远端向指尖稍压力至血液流出为止。

切忌用力挤压，造成组织液混入，影响结果准确性。

4．计数板在使用中勿让手指接触计数池及盖玻片表面，以访油腻污染，致使充液时起泡。

二、血涂片的制作,瑞氏染色

掌握血片制作方法，瑞氏染色原理及方法。

瑞－吉氏复合染液（Ⅰ液、Ⅱ液）

显微镜、载玻片、推玻片、一次性针头、消毒棉球、洗耳球

细胞的着色既有化学的亲和作用，又有物理的吸附作用，不同的细胞由于其所含化学成分不一样，化学性质各不相同，所以对染料的亲和力也不一样，因此将细胞染成不同的颜色。

一、瑞一吉氏复合染液配制

Ⅰ液：

取瑞特染粉1g，吉姆萨染粉0.3g，置洁净研钵中，加少量甲醇（分析纯），研磨片刻，吸出上层染液，再加少量甲醇，继续研磨，再吸出上层染液。

如此连续几次，共用甲醇500ml。

收集于棕色瓶中，每天早晚各振摇3′共5天，再存放一周，将染液过滤后即可使用。

Ⅱ液：

磷酸盐缓冲液（PH6.5—6.8），取磷酸二氧钾（无水）6.64g，磷酸氟二钠（无水）2.56g，加少量蒸馏水溶解，调整PH后，加水至1000ml。

二、血片制作、瑞氏染色方法

取清洁干燥载玻片，边缘光滑清洁推玻片各一张。

1、制备血涂片：

取载玻片→取血1滴于载玻片右端（边缘留1.5cm空隙）→左手持载玻片，右手持推玻片→将推玻片放至血滴前沿逐渐后移至血滴沿推片散开后，推玻片与载玻片成30°

～35°

的夹角以平稳的速度将血液向前推进→干燥（手持载玻片末端迅速在空气中挥动干燥）。

2、染色：

将干透的血涂片放在水平位置→加瑞吉氏复合染液Ⅰ液数滴，以染液覆盖整个血膜为度→静置染0.5～1min→滴加约2倍于Ⅰ液量的Ⅱ液→用洗耳球吹气混匀→染色5－10min→平持玻片用流线型水洗→干燥→镜检

1．严格皮肤消毒。

2.血滴大、血黏度高、推片角度大、速度快则血膜厚，反之则血膜薄。

3.染料放置时间越长，美兰逐渐氧化为天青，染色效果越好。

4．染液淡，室温低，细胞多则染色时间长，反之减少染色时间。

5．水洗方法为平持血涂片流线型水缓缓冲洗干净，不要先倒掉染液。

三、白细胞计数（WBC）

掌握白细胞计数的原理、操作方法与结果报告。

用白细胞稀释液将全血稀释一定的倍数并破坏红细胞，充入血细胞计数池，显微镜下计数一定体积的白细胞数，经换算求出每升血液中的白细胞数量。

白细胞稀释液

显微镜、改良Neubauer计数板、试管、微量吸管、玻璃棒

取清洁干燥试管一支，加0.38ml白细胞稀释液。

采血部位按摩→75％乙醇棉球进行刺针部位皮肤消毒→待酒精挥发干（否则血流不成滴）→自指尖腹内侧迅速刺针→擦去第一滴血→准确吸取20ul血液→用无菌干棉球压住伤口止血→用无菌干棉球擦去管尖外围余血后→将血液轻轻释放到稀释液底部→回吸上清液2-3次→混匀→室温静置至液体变为棕褐色即红细胞破坏完全→清洁计数板、盖玻片→充池→静置2－3min待细胞下沉→低倍镜下计数四角大方格内的白细胞总数→计算→报告。

计算：

WBC=四个大方格内的白细胞数（N）/4×

10×

20×

106=N/20×

109/L

3.稀释液要过滤使用，试管、计数板均须清洁，以免混入杂质被误认为白细胞。

4.加稀释液、血液量应精确，以保证稀释倍数。

5.计数池内细胞分布要均匀，每个大方格间白细胞数差异不得超过均值的±

10％，否则要重新充液计数。

6.严格掌握计数原则，以免人为扩大或缩小计数区域。

7.白细胞数量过高时，可加大稀释倍数，反之白细胞过低时可计数8个大方格内白细胞数或加大取血量。

四、白细胞分类计数（DC）

掌握显微镜法外周血分类计数的方法、各种白细胞的镜下形态。

将血液制备成涂片，经瑞－吉氏染色后显微镜下根据白细胞的形态特征进行分类计数。

通常分类100个白细胞，计算得出各种白细胞所占百分比。

瑞－吉氏复合染液

显微镜、外周血标本片、香柏油、擦镜纸、清洁剂

血涂片制备及瑞－吉氏染色待干

低倍镜下选择细胞分布均匀、着色良好的区域→转油镜按一定的规律移动视野，依次进行分类计够100个白细胞→算出各种白细胞的百分比→报告

1.涂片制备要厚薄适中、均匀、头体尾分明。

2.分类时要有程序地连续进行，避免主观选择视野。

3.分类中如见幼红细胞，不计入100个白细胞内，以分类100个白细胞过程中见到幼红细胞多少个来报告，并应注明其所属阶段，

4.分类中应注意观察成熟红细胞、血小板的形态染色及其分布情况，注意有无寄生虫（如疟原虫）及其他异常所见。

五、白细胞计数（WBC）及分类计数（DC）

掌握白细胞计数及分类计数原理、方法与结果报告

白细胞计数原理：

白细胞分类计数原理：

白细胞稀释液、瑞－吉氏复合染液

显微镜、改良Neubauer计数板、试管、微量吸管、玻璃棒、载玻片、推玻片、香柏油、擦镜纸、清洁剂

1.取清洁干燥试管一支，加0.38ml白细胞稀释液。

2.取清洁干燥载玻片，边缘光滑清洁推玻片各一张。

采血部位按摩→75％乙醇棉球进行刺针部位皮肤消毒→待酒精挥发干（否则血流不成滴）→自指尖腹内侧迅速刺针→擦去第一滴血→准确吸取20ul血液→用无菌干棉球擦去管尖外围余血后→将血液轻轻释放到稀释液底部→回吸上清液2-3次→混匀→另取血一滴于载玻片的右端→立即推制血膜→用无菌干棉球压住伤口止血→清洁计数板、盖玻片→充池（静置2－3min待细胞下沉）→低倍镜下计数四角大方格内的白细胞总数→将干透的血膜进行瑞－吉氏染色→油镜下分类计数→计算→报告。

六、红细胞计数（RBC）、Hb测定

掌握红细胞计数，Hb测定原理、操作方法，规范的报告结果

红细胞计数原理：

用等滲稀释液将血液稀释一滴倍数，充入计数池，在显微镜下计数一定体积内的红细胞数，经换算求得内升血液中的红细胞数。

Hb测定（HiCN法）原理：

血红蛋白被高铁氰化钾氧化为高铁血红蛋白，后者再与氰离子结合形成稳定地氰化搞铁血红蛋白（HiCN），HiCN在规定波长（540nm）和液层厚度（1cm）的条件下具有一定的毫摩尔消光系数。

可用标准的高精度分光光度计进行直接定量测定，或用HiCN标准液进行比色法测定，根据标本的吸光度即可求出血红蛋白浓度。

红细胞稀释液（甲醛枸木缘酸盐稀释液），HiCN转化液

改良Neubauer计数板、显微镜、分光光度计、玻璃试管、微量吸管、玻璃棒、

RBC：

取清洁干燥试管一支→加红细胞稀释液1.99ml→加未梢血10ul于稀释液底部→吸取上清液嗽洗3—4次→颠倒混匀→清洁计数板，盖玻片→充液→静置2′—3′→计数（中央大格中四角及正中5个方各细胞数）→计算

RBC=5个中方格细胞数×

5×

200×

106=5个中方格细胞数×

1012/L。

Hb测定:

1.直接定量测定法：

取中号试管一支→加HiCN转化液5ml→加未梢血20ul→混匀静置5′→721比色，波长540nm，以转化液为空白对照管→测其吸光度“A”→计算（“A”×

367.7）→报告

2.标准曲线法：

将血红蛋白标准液稀释成不同的三种浓度（150g/L、100g/L、50g/L）分别测其吸光度“A”，以“A”为纵坐标，血红蛋白标准液参考值（g/L）为横坐标，绘制标准曲线。

通过标准曲线查出待测样本的血红蛋白浓度。

1.取血应顺利、准确，采血部位不得有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症，不得过渡挤压，红细胞数量明显增高者可适当加大稀释倍数。

2.HiCN转化液应置棕色瓶于4℃冰箱中，不能储存于白色瓶、塑料瓶及强光下，否则会使CN－丢失，结果偏低。

3．HiCN转化液中有氧化钾剧毒，防止污染。

测定后的比色液不能与酸性溶液混合，否则可产生剧毒的氢氰酸气体。

4.所用分光光度计的波长、吸光度需要校正，带宽应小于1nm，比色杯光径1.000cm时，测定温度为20℃～25℃。

七、血液常规检验

掌握血常规的连续操作规程并规范的报告结果。

见实验二、三、四、六

红细胞稀释液、白细胞稀释液、瑞－吉氏复合染液、HiCN转化液

改良Neubauer计数板、分光光度计、玻璃试管、微量吸管、显微镜、玻棒。

取大、中、小号试管各一支→分别加HiCN转化液5ml、红细胞稀释液2ml、白细胞稀释液0.38ml→手指消毒针刺→分别取未梢血10ul于红细胞稀释液中、20ul于白细胞稀释液中、20ul于HiCN转化液中→并及时混匀→取清洁干燥玻片粘取1滴血液于玻片一端→推制血片→待干→721比色→瑞氏染色→白细胞及红细胞计数→DC→计算→报告（血常规结果报告）

正常值：

成人儿童新生儿

1.WBC:

（4－10）×

109/L（5－12）×

109/L（15－20）×

成年男性成年女性儿童

2.RBC:

（4－5.5）×

1012/L（3.5-5）×

1012/L（6-7）×

1012/L

3.HB:

120-165g/L110-150g/L170-200g/L

4.DC:

N:

杆状1－5％

分叶50－70％

L：

20－40％M：

3－8％

E：

0.5－5％B：

0－1％

1.取血应顺利、准确，采血部位不得有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症，不得过度挤压。

2．HiCN转化液中有氧化钾巨毒，防止污染。

3．细胞计数混合不易过分震摇。

4.瑞氏染色时加染液与缓冲液的比例为1：

1或1：

2。

5.采取标本的顺序：

红细胞计数、血红蛋白测定、白细胞计数、血片制作

八、血小板计数（BPC或PLT）

掌握血小板的计数原理、方法、镜下形态及结果报告。

用稀释液将血液稀释一定倍数后混匀，充入计数池中，于显微镜下计数一定体积的血小板数，经换算求得每升血液内的血小板数。

10g/L草酸铵液

显微镜、：

改良Neubauer计数板

取清洁干燥的小试管一支，加10g/L草酸铵液0.38ml

准确取自然流出的外周血20ul→轻轻放入到上述稀释液底部→回吸上清液漱洗吸管2－3次→混匀→室温静置10min→清洁计数板、盖玻片→混匀细胞悬液后充池→静置10min－15min→于高倍镜下计数中央大方格内四角和中央5个中方格内血小板总数→计算→报告

血小板数/L＝5个中方格内血小板总数×

1.．所用试剂、器材应10g/L草酸铵液稀释液中无尘埃、细菌等污染。

2.毛细血管采血时，针刺深度应达3mm。

采血要快避免血液凝固.若遇血小板成簇分布时，应重采标本计数.

3.细胞悬液充入计数池中静置时，应注意保持湿度，避免水分蒸发。

4.计数时光线不可太强，注意微有折光性的血小板与尘埃的鉴别。

血小板为轻度折光性的园形、椭园形。

5．血小板计数应在1h内完成，否则结果可降低。

九、网织红细胞计数（RC）

掌握网织红细胞计数原理、测定方法、镜下形态、结果报告。

网织红细胞为晚幼红细胞脱核后，但尙未完全成熟的红细胞。

其胞质中尙残存核糖体、核糖核酸等碱性物质，经活体染色后于胞质中可见蓝绿色网点状或点粒状结构。

10g/L黄焦油篮生理盐水溶液

显微镜、试管、载玻片、推玻片

取清洁干燥小试管一支，加10g/L黄焦油篮生理盐水溶液2－3滴

取外周血2－3滴于上述试管中→立即混匀→37℃下染色15－20min→取试管里的混合血液一滴于载玻片一端→推制成薄血膜→待干燥→油镜下计数（于目镜筒中放一缩小视野的硬纸片）至少1000个红细胞中的网织红细胞数→计算→报告

网织红细胞百分比＝计数的网织红细胞数/100

1.网织红细胞必须在活体染色下才能显示。

2.染色时血液与染料的比例约为1：

1，贫血时适当增加血量，室温较低时适当延长染色时间或置37℃温箱.

3.涂片应厚薄适宜，以红细胞不重叠为度，涂片后应及时计数，否则网状结构消失。

4.计数区域一般选择血膜的体部，自体部向尾部迂回检查。

十、嗜酸性粒细胞计数

掌握嗜酸性粒细胞直接计数的原理、操作方法、镜下形态及结果报告。

用嗜酸性粒细胞稀释液将血液稀释一定的倍数，破坏红细胞和其他大部分白细胞并使嗜酸性粒细胞着色，滴入血细胞计数池，显微镜下计数一定体积内的嗜酸性粒细胞，经换算得出每升血液中嗜酸性粒细胞数。

2％伊红－丙酮嗜酸性粒细胞稀释液

显微镜、改良Neubauer计数板、试管、微量吸管、玻璃棒

取清洁干燥试管一支，加0.38ml嗜酸性粒细胞稀释液。

精确吸取外周血20ul→轻轻放入到上述稀释液底部→回吸上清液漱洗吸管2－3次→混匀→室温静置→清洁计数板、盖玻片→混匀细胞悬液后充池→静置3min－5min→于低倍镜下计数两侧计数池中10大方格（每侧计数池的四角和中央大方格）内的嗜酸性粒细胞数→计算→报告

嗜酸性粒细胞数/L＝10个大方格内嗜酸性粒细胞数×

106/L

1.计数应在30min内完成，因时间过长嗜酸性粒细胞可被溶解，结果偏低。

2.血液加入稀释液后应及时混匀，否则易致血液凝固和细胞聚集，但不易用力振摇以免嗜酸性粒细胞破碎。

3.震摇与残留的中性粒细胞区别，中性粒细胞一般不受色或受色极浅，且其颗粒较小。

4.做嗜酸性粒细胞计数最好固定时间，以免受日间生理变化影响

十一、血细胞分析仪使用、LEC、血沉

熟悉血细胞分析仪的检测原理及方法；

掌握LEC的镜下形态、血沉检测方法及结果观察报告。

见仪器说明书

溶血素、清洗液

血细胞分析仪、显微镜、血沉架、血沉管

红细胞沉降率（ESR）:

取抗凝血约2ml→灌制血沉管“0”刻度→垂直竖立在血沉架上→室温静置1小时→观察红细胞沉降毫米数→报告（红细胞沉降率：

△△mm/h）

十二、凝血酶原时间测定（PT）

目的掌握PT测定方法、原理及结果观察报告

在受检血浆中加入足量的凝血活酶和钙离子，测定血浆凝固所需的时间，即为血浆凝血酶原时间。

本试验是外原性凝血系统常用的筛检试验。

1.血浆

2.组织凝血活酶

3.氯化钙溶液

恒温水浴箱、离心机、试管、微量加样器、秒表

将1.2.3.试剂分别置37℃水溶预热，小试管预热。

取已预热清洁干燥小试管→加血浆0.1ml，同时加组织凝血活酶液0.1ml、cacl20.1ml→混匀、开动秒表计时→在37℃水溶中不断轻轻摇动小试管8″→取出观察，来回倾斜试管，混合物不再流动时（出现胶冻状）立即停表，读取时间即为凝血酶原时间，作3次取均值报告。

1.采血应“一针见血”，抗凝剂与血液比例（1：

9）应准确。

取血后4h内完成测定。

2.试剂在用前先预温到测定温度，且不能超过30分钟。

3.标本测定前应先测定正常人混合血浆，其PT值在允许范围内才能测定样本。

4.必须在36.5—37.5℃温度下操作。

输血技术

一、ABO血型鉴定（正、反定型）

掌握血型鉴定（正定、反定）原理、测定方法及结果观察、分析、报告。

根据红细胞表面A、B抗原与相应的抗体特异性结合，可使红细胞出现凝集反应这一原理，通过正、反定型来判断型别。

正定型：

用已知抗A、抗B型血清来测定红细胞上有无相应的A、B抗原；

反定型：

用已知A抗原和B抗原红细胞来测定血清中有无相应的抗A、抗B抗体。

标准抗A、抗B血清；

5％A、B型标准红细胞生理盐水悬液；

生理盐水

试管、离心机、记号笔、滴管、显微镜

1、分离血清，并做好标记。

2、洗涤红细胞，制备5％红细胞悬液，做好标记。

一、正定（用已知标准血清鉴定血型）。

取试管2支→分别标明抗A、抗B字样→加5方红C晨液各1滴→离离心（1000转/min1分钟）→观察结果。

二、反定（已知标准红细胞鉴定血型）

取标准红细胞A、B型各1-2滴→分别装在大小相等并表明A、B字样的两支试管中→分别加被检者血清1-2滴→混匀离心→观察结果

结果判断【注：

（＋）示凝集　　　（－）示不凝集】

正定

反定

抗A（B型）

＋

－

抗B（A型）

被检者血型

Ａ

Ｂ

Ｏ

ＡＢ

B型标准红细胞

―

A型标准红细胞

1.格查对，切不可将姓名、标本、血型等搞错，要求正、反定型结果一致。

2.观察结果、登记、出报告均应仔细查对

3.滴管、试管应清洁干燥，各吸管不能混用，避免溶血及相互污染

二、交叉配血实验（同型、异型配血）

掌握盐水介质配血法的原理、操作方法及结果观察、分析、报告。

天然抗体IgM因其分子链较长，在盐水介质中，可以克服红细胞表面电荷的排斥力，与含有相对应抗原的红细胞结合并出现肉眼可见的凝集。

试管、滴管、离心机、记号笔

2、洗涤红细胞，制备2％红细胞悬液，做好标记

一、同型交叉

（1）取试管2支分别注明主侧、次侧：

主侧：

受血得血清1滴+献血者2％红细胞悬液1滴。

次侧：

受血者2％红细胞悬液1滴+献血者血清1滴。

（2）充分混匀→离心1分钟（1000转/min）→观察结果。

（3）结果观察：

在白色背景下，先观察上清液呈正常血清状即无溶血现象，再轻摇试管，试管内血球呈现均匀混浊也无凝集。

为叉配血试验相合，若有溶血或凝集均不可输。

二、异型交叉：

“O”型作为献血者献给“A”或“B”或“AB”型，其结果是：

主侧不凝，次侧凝。

1.严格查对，切不可将受血者、献血者姓名、标本、血型等搞错。

2.观察结果、登记、出报告均应仔细查对。

3.吸管、试管应清洁干燥，各吸管不能混用，避免溶血及相互污染。

4.交叉配血时主侧、次侧一定要分清。

尿液检验

一、尿液理学及化学检验

（尿液外观、SG、PRO、GLU、KET、URO）

掌握尿液的一般理学检验及常用化学检验原理、操作方法及结果观察、报告。

1.PRO原理：

①磺基水杨酸发：

在酸性条件下，磺基水杨酸的磺酸根阴离子与蛋白质氨基酸阳离子结合，形成不溶性蛋白盐沉淀。

②加热醋酸法：

加热煮沸使蛋白质变性凝固，加乙酸使尿pH接近等电点（pH5左右）而加速蛋白质沉淀。

2.GLU（班氏法）原理：

葡萄糖在碱性溶液中加热后，由环状结构变为带醛基的链状结构而具有还原性，可将硫酸铜还原为黄或红色的氧化亚铜（Cu2O）而沉淀。

3.KET（朗格氏环状法）原理：

尿中的酮体（丙酮和已酰乙酸）与亚硝基铁氰化钠和硫酸铵作用，可生成异硝基、异硝基胺，后者与（CN）53－生成紫红色复合物。

4.URO原理：

在酸性溶液中，尿胆原与对二氨基本甲醛反应，生成樱红色化合物。

5％冰乙酸液、200g/L磺基水杨酸液、班氏试剂、亚硝基铁氰化钠、氨水、Ehrlich试剂

试管、PH试纸、滴管、酒精灯、试管夹、尿比重计

1、尿色，透明度：

正常人黄色透明，若遇混浊尿，采取加热加酸法鉴别；

深黄色（黄胆病人）。

2、尿PH值：

正常尿液一般为弱酸必（PH6.5）。

3、尿比重（SG）：

成人为1.015—1.025（多积尿），若受饮水、出汗影响比重波动于1.003—1.030之间（随机尿）。

尿比重测定方法：

斜持比重筒（量筒），将尿液沿管壁缓慢倒入量筒中以将比重计浮起为度，避免激起泡沫，如有泡沫，可用滤纸吸去，将比重计轻轻放入并加以捻转，使其悬浮在尿液中，待比重计稍停稳后，读取液面的比重测度。

4、尿蛋白定性试验（PRO）（两种方法）

（1）加热醋酸法（参考方法）：

取试管→加尿至试管2/3处→用试管夹夹持试管下1/3处→加热上1/3处的尿液（注意：

不断转动试管均匀加热，防止尿液沸溅）→加冰醋酸2—3滴→再加热煮沸→观察结果→报告。

（2）200g/L磺基水杨酸法（首选方法）：

取试管→加尿约1ml于试管内→加磺柳酸数滴→观察结果→报告。