蛋白质连接技术Word下载.docx
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可是，在实际应用中，它所涉及的问题较多，不管从理论上或在实践中都还存在一些需要进一步说明和有待解决的问题。
此刻，涉及这一技术的国内外文献及著述很多见，也是大伙儿超级数悉的。
但是，至今未见到对此类技术较为全面系统的论述。
为知足有关科技研究工作的需要，咱们几位作者，依照连年科研实践之所得，并参阅有关文献，从介绍化学反映的要紧类型动身，以生物医学研究中的实际应用为目的编写本书，愿为同行提供有效的研究工具。
由于本书涉及内容较广，作者水平有限，体会不足，书中不免有谬误的地方，敬请读者批评指正。
洪孝庄
军事医学科学院毒物药物研究所
1992年5月
第一章蛋白质交联方式及其应用
仲伯华龚雄麒
（军事医学科学院毒物药物研究所）
蛋白质交联系指将小分子物质（如药物、半抗原等）或大分子物质（如酶、蛋白毒素等）以共价键的方式连接于蛋白质分子，以制备人工抗原、酶标抗体、载体释放药物、抗体导向药物和免疫毒素等。
随着放射免疫分析法、酶标免疫技术、载体药物学和导向物学的进展，蛋白质交联技术的方式和手腕也不断改良和完善，而且在生物学和医学领域取得愈来愈普遍的应用。
蛋白质交联方式第一进展于人工抗原的制备研究。
自70年前Landsteiner第一次合成人工抗原以来，人们将许多没有抗原性的小分子物质（半抗原）如化学药物、神经递质和激素等与蛋白质或多糖等载体大分子共价结台；
使其具有抗原性，以诱发动物产生特异性抗体，用于放射免疫分析等。
为了使放射免疫分析达到灵敏度高、特异性强的要求，前人对半抗原和蛋白质连接的方式进行了大量的研究，成立了重氮化法、戊二醛法、混合酸酐法、二异氰酸酯法及卤代硝基苯法等交联技术。
近10连年来进展起来的酶标免疫检测技术，要求制备维持酶的生物活性和抗体的免疫结合活性的酶—抗体偶合物。
经常使用的交联方式如戊二醛法、碳二亚胺法和混合酸酐法不可幸免地要产生酶或抗体的自身交联产物或多聚物，致使交联效率降低、结合物活性减弱。
为了克服这一不足，人们进展了异型双功能交联试剂，如N—羟基琥珀酰亚胺—3—（2吡啶基二硫）—丙酸酯，以实现操纵交联，提高交联反映的选择性和交联产物的均一性。
将药物与大分子载体连接，制备药物一载体结合物，以改善和操纵药物在体内的转运和代谢，实现缓释给药和定向给药，提高生物利费用和医治指数。
这是现代药物研究领域一个崭新的分支。
载体药物必需能够在体内定量、定位释放原型药物，因此要求设计pH灵敏或特定酶灵敏的偶联键。
导向药物的进展对蛋白质交联方式提出了更高的要求。
早在1906年，Ehrlich就提出了靶向给药的假想。
随着生物医学的进展，这一假想不断取得具体的实现。
单克隆抗体作为导向载体的显现，更使导向药物的研究成为今世药物研究中最活跃和最引人注目的领域之一，而其中研究得最普遍的是肿瘤医治的抗体导向研究。
其载体要紧有针对肿瘤细胞表面相关抗原的抗体及其片断，肿瘤细胞表面受体的模拟配基。
这些载体与药物或毒素分子连接而成的偶合物，能够选择性地杀伤肿瘤细胞，被誉为“生物导弹”。
为了最大限度地维持导向载体和药物弹头的生物活性，同时实现最大的药物载运量，人们不断创新交联剂，改良交联方式，进展了一批新的各具特性的异型双功能交联剂，提高了导向药物的有效性和有效性。
随着新的交联试剂和交联方式的显现，使得放射免疫、酶标免疫和导向药物的研究不断深切；
而后者的进展又反过来增进蛋白交联技术趋于成熟。
目前的交联方式能够将任一个半抗原或细胞毒分子以必然方式与载体交联，取得所需的偶合物。
下面别离介绍蛋白质交联中经常使用的试剂、方式及其应用。
一、交联方式
一样说来，蛋白分子中能够用于交联的活性基团有游离氨基（如赖氨酸的c—氨基或结尾氨基）、游离羧基（如天冬氨酸残基，谷氨酸残基及结尾羧基）、苯基（苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸）、酚基（酪氨酸）、巯基（半胱氨酸）、羟基（丝氨酸或苏氨酸）、咪唑基（组氨酸）、吲哚基（色氨酸）或胍基（精氨酸）等。
为了幸免蛋白质变性及其生物活性的损失，药物或半抗原等与蛋白的交联应采纳具有中等反映活性的试剂，在温和的条件（如接近中性的pH、室温、水溶液中）进行。
（一）重氮化法
含芳香胺的化合物，能够与亚硝酸反映形成重氮盐，然后直接连接于蛋白质分子中酪氨酸残基上酚羟基的邻位，即得以偶氮键相联的结合物。
这种重氮盐也能与组氨酸残基上的咪唑环或色氨酸残基的吲哚环反映：
本方式副反映较多，故一样限于人工抗原的制备。
（二）戊二醛法
同型双功能交联剂戊二醛的两个醛基能够别离与两个相同或不同分子上的伯氨基形成Schiff氏碱，将两分子以五碳链的桥连接起来。
戊二醛连接反映是最温和的交联反映之一，可在4~40℃温度范围，pH6.0~8.0的缓冲水溶液中进行，可是缓冲组份中不得含有氨基化合物。
以硼氢化钠或氰基硼氢化还原Schiff氏碱能够形成稳固的单键；
依照对偶联键的不同要求，还原步骤也可省略。
可是，本交联方式易形成相同蛋白间的连接；
产物的均二性较差。
因此，多用于酶标抗体的制备。
（三）过碘酸盐氧化法[1]
糖类或含糖基化合物分子中的邻二醇结构可被过碘酸钠氧化为醛基，然后与蛋白分子中的氨基形成Schiff氏碱：
与戊二醛的交联反映相似，过碘酸钠氧化法比较温和，可在常温和中性pH的条件下进行。
这是一个两步反映，第一步生成醛基衍生物后，过量的过碘酸盐必需除去或消耗后，方可进行与蛋白交联的第二步反映。
（四）混合酸酐法
半抗原或药物及其衍生物分子中的羧基能够在三级胺存在下与氯甲酸异丁酯反映，生成活泼中间体混合酸酐，然后与蛋白载体上的伯氨基反映，形成酰胺交联键：
本反映进程简单，毋需制备和分离中间产物。
（五）碳二亚胺法
碳二亚胺是一类很强的脱水剂，能使羧基和氨基脱水形成酰胺键。
在反映时，一种分子中的羧基先与碳二亚胺反映生成一个加成中间产物，再与另一分子上的氨基反映形成酰胺键，实现二者的交联：
除戊二醛外，碳二亚胺是常见的另一类交联剂，最先用于药物化学和有机化学领域；
脂溶性的二环己基碳二亚胺至今仍被普遍用于多肽合成领域，但其反映必需在有机溶剂中进行，不适用于蛋白质交联。
水溶性的1—乙基—3—（3—二甲基氨基丙基）—碳二亚胺（EDC）等的显现，使这一缩合反映成功地用于蛋白质交联中。
本交联反映条件温和即便在冷却条件下，也能于中性pH中进行。
可是，由于碳二亚胺的缩合反映没有选择性；
易形成蛋白分子间的自身聚合，产生非均一性产物；
先将含羧基的药物或半抗原分子与EDC反映，活化羧基后，再加入蛋白反映物，能够减少蛋白分子交联。
（六）活泼酯法[2]
含有羧基的半抗原或药物在二环己基碳二亚胺（DCC）的作用下，与N—羟基琥珀酰亚胺反映，生成活泼酯衍生物，后者与载体蛋白上的氨基反映，形成以酰胺键连接的偶合物：
本法是对碳二亚胺法的改良：
由于幸免了碳二亚胺对蛋白的直接作用，从而幸免了蛋白分子间的交联。
活泼酯法在导向药物的研究中取得普遍的应用。
（七）多元酸酐法[3]
半抗原或药物分子中的羟基或氨基与琥珀酸酐、顺—乌头酸酐等在无水吡啶催化下反映，形成单酯或单酰胺衍生物，引入游离羧基，然后以活泼酯法或碳二亚胺法与蛋白交联：
多元酸酐法能够十分方便地将小分子中的羟基或氨基转变成合游离羟基的衍生物，具有较广的应用范围。
可是，与羟基形成的酯健在血浆中不稳固；
而与氨基形成的酰胺键又往往不能充分降解；
释放游离药物，阻碍导向药物的效价。
有趣的是，药物通过顾—乌头酸与蛋白形成的偶合物，在中性pH介质（如血浆中）稳固，而在酸性pH介质中充分解离，释放活性药物。
由此产生的溶酶体内降解性复合物，经细胞内化后，进入溶酶体内，在酸性条件下解离。
（八）二异氰酸酯法
二异氰酸酯类双功能试剂中的两个异氰酸基别离与两个不同分子上的氨基反映，介以不同碳链长度的桥将二者偶联：
这种试剂除能与氨基反映形成取代脲外，（在pH＞7时为要紧反映），尚能与羟基反映形成氨基甲酸酯衍生物；
水溶液中的副反映（如第二个异氰酸酯基水解产生的胺，能与另一异氰酸酯分子连接），可能通过疏水作用致使蛋白的聚合。
（九）偶氮苯甲酸法
对氨基苯甲酸重氮化后，与带苯环的半抗原偶联引入羧基，再利用羧基的反映连接于蛋白上：
（十）O—羧甲基羟胺法
半抗原上的酮基与O—羧甲基羟胺反映，制备羧甲基肟衍生物。
引入的羧基再与载体蛋白的氨基反映，形成半抗原—蛋白偶合物：
（十一）对-肼基苯甲酸法
带酮基的半抗原也能够与对—肼基苯甲酸反映，引入羧基，再按常法与载体蛋白交联；
（十二）．叠氮化法[4]
羧酸甲酯衍生物经肼解、亚硝化，转变成叠氯化物，再与载体蛋白上的氨基反映：
（十三）氯乙酸钠法
半抗原的羟基与氯乙酸钠反映，形成羧甲基醚衍生物，再通过羧基与蛋白交联：
（十四）亚胺酸酯法
双功能试剂亚胺酸酯类如丙双亚胺酸二乙酯双盐酸盐能够与半抗原和载体蛋白的氨基交联，中间介以一个三碳桥：
亚氨酸酯类水溶性良好，反映条件温和，与氨基的反映选择性高，这种试剂的最大特点是，可与蛋白分子上的赖氨酸残基普遍反映，而不阻碍蛋白分子的净电荷改变。
具有不同碳链长度的亚氨酸酯可将半抗原间以必然距离与蛋白连接。
（十五）卤代硝基苯法
双功能试剂二硝基二氟苯或二氟二硝基苯砜分子中的氟原于，由于临近硝基的活化作用，易和半抗原或载体蛋白上的亲核基团如氨基、羟基、巯基等反映：
（十六）Mannich反映法
酮、酚类半抗原，能够用Mannich反映引入羧基，然后与常法与蛋白交联；
（十七）苯醌法
交联进程分两步进行，第—步反映完成后，分离除去过量试剂，再进行第二步反映。
（十八）E11man试剂法[5]
E11man试剂即5．5’—二硫—2，2’—双硝基苯甲酸（DTNB），该试剂能够与巯基作用，交联反映分两步进行：
本法用于游离巯基的爱惜和活化，以便与游离巯基的另一蛋白分子进行巯基互换反映。
（十九）马来酰亚胺基类活泼酯法
马来酰亚胺基结构中的双键比较活泼，可与游离巯基进行选择性加成反映。
马来酰亚胺基取代羧酸衍生物的N-羟基琥珀酰亚胺酯试剂与含氨基的药物或蛋白反映，引入马来酰亚胺基，与另—含有游离巯基的分子通过巯基对双键的加成反映连接起来。
这是一组异型双功能交联剂，经常使用的有N—羟基琥珀酰亚胺基—间—（N—马来酰亚胺基）-苯甲酸酯（SMB），N—羟基琥珀酰亚胺—4—（N—马来酰亚胺基）-苯丁酸酯（SMPB）等。
（二十）SPDP试剂法[6]
异型双功能交联剂N-羟基琥珀亚胺基-3—（2-吡啶基二硫）—丙酸酯（SPDP）能够通过其分子中的活泼酯组份与氨基反映，也能够通过2—吡啶二硫基团与脂肪硫醇反映.SPDP能够于蛋白分子中引入巯基，然后利用巯基互换反映或巯基加成反映与另一分子交联：
这是目前较为经常使用的一种交联剂，交联反映条件温和，副反映较少，能够定量地于蛋白分子中引入爱惜的巯基，且能够方便地测定其含量。
同类的交联剂尚有N—羟基琥珀酰亚胺—（4—a—甲基—a—（2—吡啶基—二硫代甲基）—苯甲酸酯（SMPT）[7]和N—羟基琥珀酰亚胺—3—（2—毗啶二硫）—丁酸酯（SPDBt[8]）。
通过在二硫键的a—位引入位阻性基团如甲基，能够增加交联物中二硫键的稳固性。
（二十一）苯丁酸氮芥衍生物法[9]
苯丁酸氮芥的N—羟基琥珀酰亚胺基酯或混合酸酐衍生物分子中的活性羧基和氮芥基能够别离与两个蛋白分子中的氨基反映，将二者连接起来：
在中性及微碱性pH条件下,氮芥基偏向于与巯基反映，而在较高pH时偏向于与氨基反映。
（二十二）卤代乙酰衍生物法
卤代乙酸的活泼酯衍生物如N—羟基琥珀酰亚胺基碘代乙酸酯分子中的活泼酯成份和α—位活泼卤素能够别离与蛋白分子中的巯基及氨基反映，实现两种分子的交联：
本交联反映迅速，具有较高选择性，形成的硫醚键在血浆中十分稳固。
（二十三）双马来酰亚胺试剂法[10]
这种试剂的代表为N,N’—邻苯基双马来酰亚胺，能够连接两个含巯基的分子。
这是一类比较温和的交联剂，具有较高的反映选择性，可是易形成同类分子的交联产物。
（二十四）三氯三嗪试剂法
三氯三嗪分子能够与含羟基的分子反映,剩余的第二个氧原子活性稍低，可为蛋白分子上的氨基取代，实现两分子的交联：
必需注意，第一个分子中不能含有氨基及巯基等亲核性较强的基团，不然，易形成自身聚合。
二、交联方式的选择及偶合物的设计
如上所述，蛋白质交联方式的类型繁多，尽管能够知足各方面的需要，但也增加了利用者选择的困难。
评判某一交联方式时，应该考虑以下有关因素：
①交联反映的成效，如交联产物组成的均一性;
②交联反映的产率;
③交联进程对生物活性的阻碍；
④交联操作的简便性；
⑤交联产物纯化的难易；
⑥交联反映结果的可重复性；
⑦偶合物的利用目的。
理想的交联方式应该保证结合物得率较高，结合物的组成均一，结合比适合，最大限度地维持生物活性，操作方便，纯化容易；
在一样条件下，重复性好。
但是，目前尚未一种交联方式能够同时知足上述要求。
由此，必需依照结合物的利用目的，衡量不同方式的优缺点来选择适合的交联方式；
最好同时利用几种交联方式进行比较，择其优者而用之。
在人工抗原的制备中，要紧要求制备的人工抗原维持半抗原的结构特异性；
所用交联方式不要明显改变半抗原结构，要保留抗原决定簇。
必要时可在半抗原与载体之间引入必然碳链长度的桥结构，暴露抗原决定簇，以利于产生针对半抗原的抗体。
阻碍人工抗原的免疫成效的另一重要因素是每分子载体上结合的药物分子数。
一样以为药物结合量越大越好，但最正确结合比也取决于半抗原的本质及载体的性质。
由于抗体的特异性要紧针对半抗原分子中远离偶联键的结构，因此，在设计人工抗原结合物时，应选择远离半抗原特点结构的基团进行交联。
例如，与抗—睾酮—17—牛血清白蛋白相较，抗—睾酮—3—牛血清白蛋白能够更好地识别类似结构的甾体化合物。
通过桥结构将载体蛋白连接于抗原分子中非生物特异性的位置如雌激素的C—6位，黄体酮的C—6或C—11位，制备的人工抗原结合物具有更好的特异性。
由这些结合物产生的抗体能够识别半抗原的所有结构特点。
相应地，抗半抗原的抗体对结合部位或临近结合部位的结构转变是不灵敏的，如3-羧甲基吗啡—蛋白结合物诱生的抗体不能区分吗啡和可待因[11]。
还原青蒿素—蛋白结合物所诱生的抗体能够用于测定青蒿素、蒿甲醚及青蒿酯[12]。
而通过不同方式制备的安宁的两种蛋白偶合物所产生的抗体，都能特异性地识别安宁。
这些性质给人工抗原的制备带来极为有利的条件，人们能够适当改变半抗原结合部位的结构或引入交联活性基团，使制备人工抗原的方式加倍多样化。
关于酶标抗体的制备，最重要的是同时维持酶和抗体的生物学活性，制备化学组份均一的结合物。
异型双功能交联试剂的应用，大体实现了交联反映的操纵进行，减少或幸免了自身聚合和交叉聚合，保证了交联产物的有效性。
关于载体药物，第一要求其能够在体内定量或定位地释放出具有生物活性的游离药物。
为此，连接药物与载体的偶合键必需能够在必然条件下以必然速度解离，而且解离速度能够通过pH的改变或体内不同组织小环境的不同（如酶的种类或活性）取得调控,以达到定向给药的目的；
在制备载体药物结合物时，对药物分子的结构不宜作永久性的改变，以避免引发生物活性的改变；
第二还要求每一载体能结合足够量的药物分子，以保证给药的效率。
在抗体导向药物的设计和制备中应该考虑以下几点：
①细胞毒分子—抗体偶合物在抵达作用部位以前维持稳固，在血浆中不被降解；
②结合物的特异性能够反映载体的特异性，即具有原载体的专一性识别和结合作用；
⑤结合物抵达作用部位以后，能以某种方式进入细胞，发挥药理作用，即结合物本身具有细胞毒活性或结合物进入细胞后能够释放活性形式的药物。
因此，对细胞毒分子中药物活性所必需的部位不宜作不可逆化学修饰，而且偶联键要远离活性部位，以幸免立体位阻对生物活性的阻碍。
如甲氨蝶呤分子中的蝶呤部份对二氢叶酸还原酶有高度的亲和性，是抗代谢活性的必需结构，对其进行任何改变，都可致使药物活性的丧失；
可是，远离蝶呤的谷氨酸残基，对酶抑制活性阻碍不大，能够用作交联基团。
又如将细胞毒分子连接于抗体分子中远离抗原结合位点的Fc区，能够最大限度地维持抗体活性[13]。
利用血浆与溶酶体pH的不同，设计pH灵敏的偶联键，制备药物载体偶合物，能够实现药物的操纵释放[14,15]。
如柔红霉素通过顺—乌头酸与蛋白形成的结合物，在生理pH时稳固；
而进入细胞后，能够在溶酶体的酸性条件（pH4~5）下解离，释放柔红霉素原型药物分子，发挥细胞毒作用[14]。
不论利用哪一种蛋白载体，其所能提供的交联基团是相似的。
因此，交联方式的选择和交联物的设计要紧取决于半抗原或药物分子上的功能团结构，下面就依照这些功能团的分类，别离讨论不同交联方式的应用。
（—）羧基
药物或其衍生物分子上的羧基能够通过碳二亚胺法、混合酸酐法等与蛋白上的氨基形成酰胺键，其中碳二亚胺法在这种化合物的偶联反映中的应用最为普遍。
血管紧张素缓和激肽、促胃液素、吗啡、前列腺素、托普霉素、1—B—E—阿糖呋喃胞嘧啶、强的松—21—琥珀酸半酯等都可在水溶性碳二亚胺EDC的作用下，与蛋白或多聚氨基酸等载体结合，制备人工抗原。
许多含羧基的抗肿瘤药物如甲氨蝶呤[2]、苯丁酸氮芥、柔红霉素[3]的二元酸单酯衍生物、丝裂霉素C—戊二酸单酯[16]、新制癌菌素[17]和磷酸酯酶C等都可在EDC作用下与抗体偶联，制备抗体导向偶合物。
同时含有氨基和羧基的小分子，能够先将氨基爱惜后，再用羧基与载体交联，以幸免自身缩合，交联反映完成后再脱爱惜，游离氨基。
不溶于水的药物可先以二甲基甲酰胺溶解，然后再加于蛋白水溶液中，进行交联反映。
为了减少蛋白分子间的自身聚合，能够先将药物分子上的羧基转化为N—羟基琥珀酰亚胺的活泼酯，然后再与抗体交联。
例如，将丝裂霉素C—戊二酸单酯转化为活泼酯后，再与抗体交联，能够提高蛋白回收率和产品的均一性，更好地维持抗体活性[18]。
类似地，能够制备D，L—10，11—环氧麝子油酸及蜕皮激素的人工抗原结合物。
混合酸酐法也能用于形成酰胺键。
通过混合酸酐法与蛋白载体交联的半抗原有考的松—21—琥珀酸半酯、尿核苷—5’—磷酸、睾酮—17—琥珀酸半酯、3—O—琥珀酰毛地黄毒甙配基、胆酸、甲状腺素及利血平等。
药物及半抗原的羧酸酯、活泼酯或酸酐衍生物能够与肼反映，转化为相对稳固的酰肼物。
后者在水性介质中，很容易和蛋白分子上的醛基或酮基（由高碘酸钠氧化IgG分子上的糖残基产生）反映，形成腙结构的结合物。
另外，药物分子中的羧基还能够转变成酰基叠氮衍生物，然后再与蛋白分子上的氨基反映，形成以酰胺键连接的结合物，酰基叠氮衍生物能够由酰肼与冷的亚硝酸反映制备，也能够通过酰氯与叠氮钠反映产生。
通过这种方式与蛋白交联的有阿斯匹林、去乙酰长春花碱、甲状腺素等。
（二）氨基
含氨基的半抗原及药物能够分为两类，即芳香胺类和脂肪胺类。
这两类胺的交联方式有所不同，下面别离讨论。
许多芳香胺类的化合物能够在低温条件下与亚硝酸反映形成重氮盐，然后与载体蛋白分子上的酪氨酸或组氨酸残基反映，形成以偶氮键交联的结合物。
芳香环上含硝基的化合物如氯霉素，可将硝基还原为氨基后，再制备重氮盐，与蛋白载体结合。
可是，重氮盐交联法存在难以克服的副反映，可致使蛋白大量沉淀；
而且，与重氮盐反映的酪氨酸和组氨酸残基多存在于IgG分子中抗原结合区及其周围，因此交联反映易致使抗体活性的损失。
因此这一方式一船不用于抗体导向药物的制备中。
脂肪胺类化合物能够在水溶性碳二亚胺作用下，与载体蛋白上的羧基结合。
用此方式连接的半抗原有缓激肽、血管紧张素、托普霉素、庆大霉素、阿霉素、5-羟色胺及精脒等。
脂肪胺还能够与一硝基苯甲酰氯反映，形成对-硝基苯甲酰衍生物，再将硝基还原为氨基后，通过重氮化与载体蛋白结合，以此法交联的半抗原有烟草花叶病病毒蛋白及血管紧张素等。
通过双功能交联剂苯甲基二异氰酸酯将胺类化合物与蛋白上的氨基连接，能够制备缓激肽的人工抗原结合物。
药物分子上的胺基还能够通过戊二醛试剂与蛋白分子上的氨基结合，由此能够制备促肾上腺皮质激素、高血糖素及支甲肾上腺素等到的人工抗原结合物和阿霉素-抗菌素体导向偶合物[44]。
以上交联方式均是利用同型双功能交联剂连接两分子上的氨基。
在交联进程中，不可幸免地会形成部份相同分子间的聚合产物。
为了达到操纵交联的目的，能够利用多元酸酐法，于含氨基的半抗原分子上引入游离羧基,然后再以活泼酯法或碳二亚胺法与蛋白交联。
如先将柔红霉素与琥珀酸酐或顺—乌头酸酐反映，再利用引进的羧基与抗体上的氨基反映，形成抗体导向偶合物[8]。
也能够通过与SPDP反映，于半抗原分子上引入巯基，利用巯基反映与抗体交联。
（三）羟基
含有羟基的半抗原分子包括醇类、酚类、糖类及核苷酸类。
在这种化合物的交联中，通常先要制备其衍生物，以引进能够与蛋白反映的功能团。
例如，甾体化合物能够通过与琥珀酸酐反映，形成琥珀酸单酯衍生物，然后按羧基交联方式与蛋白偶联。
依照类似方式能够制备环腺苷酸、雌酮、B—dl美沙醇、3—羟基氯硝安宁、蜕皮甾酮、心得安、A9—四氢大麻酚及1—B—D—阿糖呋喃胞苷的蛋白结合物。
也能够将醇羟基与光气反映，制备高度反映活性的氯甲酸酯，然后在碳酸氢盐存在下与蛋白分子上的氨基交联。
三氯三嗪或羧甲基取代的二氯三嗪试剂能够连接药物分子上的羟基与蛋白
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