基因工程.docx

基因工程.docx

《基因工程.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程.docx（16页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

基因工程

基因工程

生物技术是近10多年来迅速发展起来的高技术、新技术，具有十分明显的社会高效益和经济效益。

在所有的生物技术领域中，农业生物技术，特别是有关作物生物技术的研究和发展，同医药生物技术一样被认为是最有现实意义的技术，将在下一世纪出现的“绿色革命”及“医药革命”中发挥巨大的作用，而这两种生物技术都是以基因工程为基础的。

基因工程自其诞生至今已有十多年历史了，已经形成了一整套的技术路线。

这主要包括目的基因的取得，目的基因与表达性载体的重组，重组体对寄主细胞的转化及目的基因的表达，表达产物的纯化与生物活性测定。

在农业生物技术中，植物基因工程取得了一系列引人注目的成果，人们成功地获得了抗虫、抗病毒、抗除草剂等转基因植物，并已开始了大田实验。

人们可以在一定范围内开始根据意愿来改造植物的一些性状，从而获得高产、稳产、优质和抗逆性强的品种了。

向动物体转移外源基因并使之在动物体内表达能够有效地克服物种之间固有的生殖隔离，实现动物物种之间，或动物和植物及微生物之间遗传物质的交换。

因此，动物基因工程对于深入研究基因结构、功能及其表达调控，对于培育高产、优质和抗逆动物品种，对于开发动物体作为活的生物反应器生产珍稀蛋白质等方面，均有巨大应用潜力；而基因工程在医药领域的应用在于能利用生物体生产基因工程药物，为人类的健康打下坚实的医学基础。

一、基因转移方法

1.向动物体内转入外源基因

这一方法的尝试是从70年代中期开始的，到80年代，科学家们已经相继建立了多项转基因技术。

（1）显微注射法这种方法是1981年由美国科学家戈登（Gordon）等人首先实验成功的。

他们将小鼠的受精卵取出来，在显微镜下将胸苷激酶基因用玻璃微管送入受精卵的雄原核，然后立刻输入假孕母鼠的输卵管中，使其在子宫内着床，最终发育成转基因小鼠。

在此后约一年多时间内，人的珠蛋白基因和胰岛素基因也被转入了小鼠。

随后，生产转基因小鼠的经验迅速地被移植到生产转基因家畜上。

到1985年，哈默（Hammer）等人首先报道用显微注射法生产出转基因兔、羊和猪。

显微注射虽然是有效的方法，但转基因动物生产仍是一项困难的技术，即使具备了良好的设备和训练有素的技术人员，注射和移植一百个小鼠胚胎，仅能获得五只转基因小鼠。

家畜的胚胎细胞核不易看清，不能直接注射，必须先作离心处理后才能注射，这样，生产转基因个体的机率又下降了一个数量级。

鱼类和两栖类的卵是多黄卵，在显微镜下不易辨认原核，有些科学家采用基因注入卵母细胞核的方法，因为卵母细胞核大些，可以在显微镜下看见，基因可以注入卵母细胞核中，让卵母细胞体外成就并受精，最终受精卵发育成小鱼。

（2）动物病毒载体法与显微注射法相反，动物病毒逆转录病毒对细胞染色体的整合是按照已经了解的机制准确地结合到被传染细胞的基因组中，往往只有一个单一的病毒拷贝插入到已知的染色体位点上，不易引起寄主基因组大规模的重排，只会在整合位点上的很短的一段寄主DNA序列上产生重排。

把小鼠胚胎在子宫着床前浸泡在浓的病毒原液中，或是把它们与产生病毒的单层细胞一起培养，即可达到转基因的效果。

目前，这种方法主要应用于转基因牛和转基因鸡的生产。

转基因牛生产成本太高，不适宜使用大量注射和移植受精卵的方法生产。

鸡蛋中的胚胎已经是多细胞胚胎，不适宜用显微注射法。

到目前为止，美国科学家已用RSV载体生产出转基因牛，用RV载体生产出转基因鸡。

但这个方法的缺点是对所转移的基因的大小有一定的限制，同时转移的基因在动物体内表达的问题还没有得到完满解决。

（3）电转移法电转移法是将生殖细胞或体细胞置于电场内，同时加入待转移的外源基因，在电场作用下外源基因导入细胞内。

近年来，利用电转移器将外源基因导入小鼠卵中等研究都取得了成功。

这种方法操作比较简单，效果较好，但不易普及，因为电转移器较昂贵。

（4）胚胎干细胞法胚胎干细胞是从胚泡中将内细胞团取出在体外培养建立的，在培养过程中保持了它的正常核型，胚胎干细胞注入寄主胚泡后，能掺入胚胎，并参与嵌合体动物的生殖系。

利用动物病毒载体法等方法可以将外源基因导入胚胎干细胞，选出带有目的基因的细胞克隆，然后导入小鼠胚胎，这就为创造特定的预知转基因动物开拓了一条新途径。

（5）精子载体法这项工作始于意大利，意大利科学家首先利用小鼠精子作为载体，使精子与CAT（氯霉素乙酰转移酶）基因混合，待精子头部吸收CAT基因后，用该精子使小鼠卵体外受精，之后移入雌鼠体内。

在出生的30％小鼠中检出了CAT基因。

该方法在青蛙和海胆的实验中也得到了成功。

我国在这方面进展比较大，自1989年以来，北京农业大学与中国农科院畜牧研究所、湖北农科院畜牧兽医研究所和新疆畜科院等单位合作，在家兔、猪、羊和牛等动物上进行了大量试验，目前已获得了转基因家兔、猪和绵羊。

转基因效率达到3％，略高于显微注射的效率。

另外，我国用鱼精子作载体，把外源人生长激素基因经鲤鱼精子导入鱼卵，表达率为50％，高表达幼苗生长速度为不表达幼苗的2倍。

我国还成功地进行了用鸡精子导入病毒基因的实验。

应该说，我国在精子载体法转移基因的研究中，是走在世界前列的。

（6）定位整合技术转基因动物技术上的最大缺点是盲目性：

导入的外源基因对受体细胞基因组的插入是随机的。

因此，实现外源基因的定位整合技术（SitedirectedIntegrationofGene）以及同期建立的小鼠胚胎多能干细胞系（ES细胞系）的体外培养方法，为基因定位整合进而为哺乳动物种系改造开拓了充满希望的前景。

其大意是利用DNA体内同源重组的原理，将外源基因稳定地插入特定的位点，再经适当的筛选，从而得到既定的转化细胞。

这一技术不仅在动物育种上，而且在缺陷基因的修复上（遗传性疾病与恶性肿瘤）以及生命科学的理论研究上，都将有很大的应用价值。

2.向植物体内转移外源基因

开展此项研究最早是在1985年，之所以比动物转基因晚，除了研究热点以外，主要是因为植物细胞外有一层细胞壁，这层细胞壁给转基因带来了很大的不便。

对一个成熟、实用性强的植物转基因系统，它应该具备以下条件：

获得转基因植株的效率高；重复性要好；设备要简单，易于操作；由转化至获得转基因植株的时间相对较短；无基因型的依赖性，即方法的适用范围广，能在同一个植物种的许多基因型上成功，特别是在优良的栽培品种上成功。

近年来，植物转基因的方法不断有所创新，大体可分为三类。

（1）农杆菌介导的基因转移根癌农杆菌和发根农杆菌可以使范围很广的双子叶植物（前者）、也可使部分裸子植物分别形成冠瘿瘤和发状根（hairyroot）。

近年已有一些证据显示根癌农杆菌的Ti质粒也可向一些单子叶植物（如石万柏、百合、薯蓣等）转移外源基因并表达。

野生型根癌农杆菌的Ti质粒由于携带与生长素和细胞分裂素合成有关的基因，使转化的细胞产生过量的植物激素而形成肿瘤。

利用这种野生型农杆菌作为基因载体，常使转化的细胞丧失分化能力。

利用野生型农杆菌进行转化时，所形成的肿瘤或发状根本身即是一种天然的选择标记，在无激素的培养基上就可以获得转化细胞系。

由于发根农杆菌感染后形成的发状根在很多情况下可诱导再生形成植株，以及发状根本身的单细胞起源，近年利用发根农杆菌进行转化的工作也已受到不少重视。

根据所用植物材料的不同，常用的农杆菌转化方法大致可分如下三类：

①整株感染——用处于对数生长期的野生型农杆菌感染植物的受伤部位，将得到的肿瘤或发状根切下，置于含羧苄青霉素的无激素培养基上培养并杀菌，这是获得转化细胞系的最简便的方法。

这一方法的优点是实验周期短、操作简便，但在用根癌农杆菌转化形成肿瘤组织时，常混有未转化的正常细胞，即形成的是嵌合体。

②叶圆片法——该方法用打孔器取得叶圆片或用解剖刀将叶切成小块，在过夜培养的农杆菌菌液中浸几秒钟到几分钟后，用滤纸吸干后在培养基上共培养2～3天，再转移到含抗菌素的选择培养基上培养并杀菌，再由获得的转化细胞诱导形成再生植株。

这一方法已广泛用于多种植物的转化。

其他各种外植体，包括茎切段、叶柄、胚轴等以及悬浮培养的细胞均可用类似的方法进行转化。

例如，在拟南芥上发展起来的利用根切段和萌发种子的转化技术，已表明有很高的转化频率。

③原生质体和农杆菌共培养法——将处于再生壁时期的原生质体（在原生质体群体中通常已可见部分已开始第一次分裂）与根癌农杆菌共培养36～48小时，分离洗涤去菌后培养在含抗菌素的选择培养基上即可得到转化的细胞克隆。

与上面两种方法比较，此法得到的转化体一般不会是嵌合体。

利用这一方法已使多种烟草属植物、矮牵牛、龙葵、胡萝卜等植物的细胞转化，并获得转基因植物。

共培养法同样适用于发根农杆菌Ri质粒的T-DNA转移。

在共培养过程中，新形成的细胞壁和一些二价阳离子为农杆菌的附着和转化所必需。

当由胡萝卜悬浮培养细胞刚分离的原生质体与发根农杆菌混合时并不形成转化细胞团，发现如果将此混合物放置2小时后进行二次电脉冲处理，则可明显提高转化频率。

（2）以原生质体或细胞作为受体的直接基因转移直接基因转移，是指经特殊处理后直接将DNA转移到植物细胞或原生质体中导致细胞转化的技术。

常用的DNA直接转化技术可分为化学和物理方法两大类。

①利用特定的化合物诱导的DNA直接转移——在利用原生质体作为受体进行外源基因导入的研究中，已发现一些化合物有助于原生质体摄取外源DNA，包括PEG（聚乙二醇）、PLO（聚-L-鸟氨酸）、磷酸钙等。

聚乙二醇法是将原生质体悬浮于含有DNA的介质中，用分子量为4000～6000的PEG在pH8～9下促进DNA的摄取，从而使细胞转化。

很多因素都会影响PEG诱导的转化，如加入DNA和PEG的次序，是否加入了携带DNA（carrierDNA），导入的DNA的形式如何，加入的PEG的最终浓度多少等。

用经同步化处理后的烟草叶肉原生质体，已发现在细胞周期的S期或M期时的转化频率明显高于其他时期，在用PEG处理前用低剂量的X射线或紫外线处理原生质体，可使抗性细胞团增加2～7倍，而不影响细胞团的形成和植株再生，这可能是因多辐射使更多的细胞有效地整合外源基因。

其他一些因素，如保温处理的时间，在加入DNA之前对原生质体的热休克处理等也有一定的影响。

至今，利用PEG法已使多种重要的禾谷类作物，如水稻、高粱、小麦的原生质体获得了基因植物。

②利用物理方法诱导的DNA直接转移——这类方法的原理是基于许多物理因素均可通过对细胞膜的影响，促进外源DNA分子进入细胞，或通过机械损伤后直接将外源DNA导入细胞。

常用的诱导DNA直接转移的物理方法有电穿孔法、微注射法、基因枪法等。

电穿孔法（electroporation）的基本原理是利用新鲜分离的原生质体在高压电脉冲作用下在质膜上形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。

有两种不同的处理方式，一种是采用较低的电压处理较长时间，另一种是采用高压电处理很短的时间。

为提高转化频率，通常可把电穿孔法与PEG法结合起来。

电穿孔法的优点是操作简便，适用于对农杆菌感染不敏感的植物，导入DNA的效率也特高，特别适于瞬间表达（transientexpression）的研究；其缺点是易造成原生质体的损伤，使植板率降低。

利用微注射法（microinjection）进行基因导入时，通常需先把原生质或培养的细胞固定在琼脂、低熔点的琼脂糖或alginate中，或用聚赖氨酸处理附着在玻璃平板上，也可通过一固着的毛细管将原生质体吸着在管口，再进行操作，即通过一极细的毛细管将一定量的DNA注入细胞内，甚至直接注入核内。

在这方面，瑞士的诺豪斯（Neuhaus）等人已发展出一套完整的技术。

用此法已在烟草、油菜、苜蓿等植物的原生质体上获得成功。

微注射法的优点是转化效率高，在用线形DNA的一些试验中，转化效率甚至高达60％以上，无需特殊的选择系统，并且没有农杆菌宿主范围的局限性。

今年这一技术也用于培养细胞或胚性细胞团等。

基因枪法（particlegun）又称微弹法（microprojectilebombardment），其基本原理是将DNA包被在微小的金粉或钨粉表面，在高压的作用下高速穿透受体细胞或组织，外源DNA随之导入细胞，整合并表达。

该方法的优点是免去了分离原生质体的麻烦，可以直接转化各种外植体、愈伤组织以及胚性细胞系。

并已有证据不光可将外源DNA导入细胞核，而且可以转化细胞器（如叶绿体）。

利用该法已由烟草、大豆、棉花、玉米等多种植物得到转化植物，目前这种方法的采用越来越广泛。

（3）种系系统的基因转移（germlinetransformation）通常利用子房注射种胚、体细胞胚以及花粉等途径导入外源基因。

由于植物种类的繁多，各种植物特性的不同，无需也不可能有适用于所有植物的转化方法。

因此，从不同的方面以及不同的层次上进行探索，以确定适于个别作物的高效转化方法，仍将是一个值得重视的研究课题。

二、基因工程研究的现状

基因工程的研究和应用虽然历史还不长，但在短短的十年时间中，这个领域所涉及的许多重大技术问题都已得到了解决，因此不但研究工作成绩斐然，而且应用前景极为广阔。

1.动物基因研究

（1）培养优良性状的家畜家禽品种1982年，帕尔蒂曼（Paltimer）和布林斯坦（Brinster）等人构建了大鼠金属硫蛋白和人生长激素融合基因，生产出生长速度比正常小白鼠快一倍的超级小白鼠。

这一结果引起了世界轰动。

此后，许多实验室用人的生长激素基因、猪的生长激素基因、羊的生长激素基因和牛的生长激素基因生产转基因小鼠时，都获得了类似结果。

1988年，西曼克（Seamark）等人用猪的生长激素和大鼠MT融合基因，生产出生长快、瘦肉率高和表现正常的转基因猪。

但是，利用转移生长激素基因技术，在其他家畜上却没有获得令人满意的效果。

哈默（Hammer）和珀斯尔（Pursel）等人用人生长激素基因和牛生长激素基因生产的转基因兔和绵羊，虽然血液中生长激素水平偏高，但生长速度并不比对照家畜快，有的比非转基因家畜还要慢些。

这些转基因家畜有各种各样的病症，寿命都不长。

但是，体脂沉积率下降，饲料转化率提高。

普遍认为，这一结果是生长激素长期维持在高水平上造成的。

人们猜测，小白鼠可能是一种特殊的例子，它似乎是一种适应力很强的动物，对高水平的生长激素可以做出积极反应而无不良后果。

除了生长激素和生长因子基因以外，人们感兴趣的还包括提高抗病性能的抗性基因、提高繁殖机能的基因等等。

事实上，这种培养具有优良性状动物品种的基因工程难度是很大的，因为家禽家畜的许多生产性能，是由许多微效基因控制的，是所谓数量遗传性状。

能否使用转基因技术转移数量遗传性状，主要取决于数量遗传性状基因的定位。

在近期内，这一问题尚无法回答。

另外，还需要解决基因调控表达的问题。

生长激素对家畜的产肉、产奶和产毛性能都有刺激作用，要使外源生长激素基因在适当发育阶段进行适度的表达就需要克隆调控表达元件，并用它来调节外源生长激素基因的表达。

还有就是要解决外源基因的定点整合技术。

目前生产的转基因动物，外源基因都是随机的整合在某一条染色体的某一位点，不同个体基因整合的位点不相同。

由于整合的位点是成对染色体中一条染色体的某一位点，既无法确定它是否有害整合（即破坏了正常基因的整合），也无法用简单交配的方法得到纯合子。

因此，即使生产出性状优良的转基因个体，也不能用于生产新的家畜品系或品种。

未来要解决的问题，或者是从大群转基因动物中找出那些非有害整合的个体，并从它的后代中通过亲源交配生产纯合个体，或是构建定点整合载体，生产在同一位点整合的转基因动物。

（2）改善奶的质量或生产珍贵蛋白1989年，克拉克（Clark）等人把鼠乳清酸蛋白/第九因子融合基因、鼠乳清酸蛋白/α-抗胰蛋白酶融合基因和乳球蛋白/α-抗胰蛋白酶融合基因转入绵羊，在绵羊乳房中获得组织特异表达。

虽然其表达水平尚未达到工业生产的地步，但对于一些不易用细菌生产的珍贵蛋白来说，却找到了一条有希望的生产途径。

1991年，英国药用蛋白公司的人用绵羊乳球蛋白基因（BLG）启动子和人类抗胰蛋白酶因子（alAT）基因的编码序列构建融合基因，转入绵羊中，转基因绵羊的抗胰蛋白酶因子的产量达到35克/升。

在正常情况下，一只绵羊一年产奶1000升，一只山羊每年可产奶2000升，而一头牛每年可产奶6000升。

如果说一只绵羊相当于一个一吨容积的发酵罐的效率，一头奶牛则相当于一个五吨发酵罐的效率，这种活体生物反应器不仅效率高，而且产品已经过体内正确加工，活性比较好。

动物奶中所含有的蛋白质种类比细菌少，提纯目标产品相对比较容易。

这种活的生物反应器可以按需要任意扩展，所受限制条件较少。

可以说，在乳腺中高效表达外源蛋白的技术已经比较成熟了。

有报道，有科学家已经通过转基因猪生产出人血红蛋白，通过转基因牛生产出人乳铁蛋白等其他有用蛋白，以后这种类似的应用将会有更大的发展。

2.医药基因工程

（1）生产分子导向药物目前，许多抗肿瘤药物（包括核素或毒素）往往由于缺乏作用的选择性和特异性而无法付之临床应用，或勉强用于恶性肿瘤的治疗而因毒副作用太大终归于失败。

人们曾经试图应用单克隆抗体的强特异性的特点，把抗肿瘤药物、核素或毒素通过交联技术同某种肿瘤的特异性单抗结合起来，构建成单抗偶合物。

人们希望利用单抗偶合物的高特异性，将细胞毒性物质导向性的运送到人体靶部位（癌细胞或其他病灶），以提高局部药物浓度，充分发挥抗癌药、核素或毒素的杀伤作用，尽量减少对正常组织的损害。

但实践结果并不像预想的那么理想，单抗偶合物虽能提高局部药物的浓度，但并不充分，在杀伤癌细胞的效果和减少对正常组织的损害两个方面均不尽人意。

随着基因工程技术和蛋白质工程技术的发展，人们发展了从分子水平上改造基因并生产分子导向药物的思想，实践证明，分子导向药物的效果是令人满意的。

例如分析表明，白细胞介素Ⅱ（ⅠLⅡ）的N端54个氨基酸的功能是专门结合辅助T细胞受体的。

而白喉毒素则可以区分为三个区段；区段Ⅰ的功能是无特异性地破坏细胞蛋白质合成的延长而致死细胞，人们把白喉毒素的区段Ⅰ基因予以切除，把其区段Ⅱ-Ⅲ同ⅠLⅡ基因重新组合，这样就形成了ⅠLⅡ——白喉毒素Ⅱ-Ⅲ的嵌合基因。

再运用基因工程技术高效表达该嵌合基因，从而提取纯化出相应的杂合蛋白质。

研究结果表明，这样的杂合蛋白质只结合并进入和杀伤辅助T细胞，而对其他类型的细胞或组织无杀伤作用，实现了分子导向的目标。

据报道，曾应用该毒蛋白治疗了一例类风湿病人，效果良好。

再比如，CD4原是辅助T细胞表面同艾滋病毒HIV的gp120糖蛋白结合的受体。

人们克隆了CD4基因，并经分析表明，CD4可以区分为4个功能区段，仅区段Ⅱ-Ⅲ（称PE40）同CD4的区段Ⅰ-Ⅱ基因，重新组合起来，并运用基因工程技术高效表达了该杂合蛋白，再经提取纯化获得了该杂合蛋白质。

体外实验结果表明，该杂合蛋白质既有中和细胞外游离的HIV（因有CD4的Ⅰ-Ⅱ区段存在），又可进入被HIV感染的T细胞，并因杀灭该种T细胞而使HIV病毒无法繁殖，同时不伤害任何其他类型的细胞。

再如，基因工程生产的a转化生长因子TGF-a与PE40的杂合蛋白可明显地延长荷瘤裸鼠的生存期（其表面有TGF的受体）。

该杂合毒素却不杀伤不带其受体的细胞。

乳癌、脑癌、宫颈癌、结肠癌和口腔鳞状上皮癌细胞表面，都有表皮生长因子受体。

美国有30多万病人可望用此杂合毒蛋白治疗。

（2）基因工程改造抗体临床实践表明，单克隆抗体用于疾病治疗不尽人意。

原因在于目前治疗的单抗，绝大多数为小鼠单抗。

小鼠单抗是小鼠免疫球蛋白，对人体而言，则是一种异体蛋白，会引起人体产生人抗鼠抗体（HumanAntimouseAnti-bodies，HAMA）。

此时再度使用小鼠单抗，HAMA与小鼠单抗结合后，不但会中和单抗使之失效，还会产生有害的过敏反应。

为解决这一问题，人们着手运用基因工程技术对抗体进行改造。

①嵌合抗体它是将鼠源单抗的可变区（V区）基因与人Ig的恒定区（C区）基因相连接，构建成嵌合抗体。

目前国内外已制备了数种嵌合抗体。

由于该抗体已“人源化”。

其免疫原性已大大降低。

②重构抗体（ReshapedAntibody）它是将动物抗体中的三个发夹结构所形成的环区（称互补决定区“CDR区”或高可变环区）与人抗体相应的环区交换从而重构抗体的抗原结合区，以进一步“人源化”，降低单抗的免疫原性。

当前已构建数种重构抗体，当然它们的抗原结合能力得以保持。

③单链抗体（Single-ChainAntigen-BindingProt-eins）它是由一个短的人工设计的多肽接头将轻链V区的C末端与重链V区的N末端相连接，如果多肽接头设计合理，能保证B片层结构的正确构型，同时保留了CDR序列，则在E.coli表达系统中可表达具有抗原结合活性的融合蛋白。

从已构建的三种单量抗体看，其免疫原性确实降低了。

④单区抗体（singleDomainAntibody）已经发现，虽然一个抗体是由轻、重两个V区基因装配而成，但可以分离到具有抗原结合活性的单一重链V区基因。

因此，人们可以用PCR法扩增出具有抗原结合活性的VH区。

该方法一反过去单抗研制的烦琐程序，以其快速、多样与有效性，预示着巨大的应用和商业价值。

但据新近一些临床试用人源化嵌合抗体的结果表明，在初期临床试验

中，人源化嵌合抗体能够解决一些问题，且半衰期延长多倍。

但不能解决其免疫原性问题，有的嵌合抗体出现免疫反应，有的则产生独特型抗体（以嵌合抗体为抗原产生抗体）。

⑤全套抗体（immunoglobulinReperoire）它将某一免疫反应的全套VH

基因与有限数目的VL基因排列为方阵，经过排列组合构建抗体，必能产生相当一批有功能活性的抗体，进而从中筛选出有强催化作用的抗体，后亦被用于筛选并克隆表达人单抗或其他单抗，如破伤风类毒素单抗。

这一研究被誉为是“抗体的突破”。

但据最近报道，英国已应用λ噬菌体克隆人Ig成功，并已取得专卖权。

这项成就可能使以杂交瘤为基础研制单抗的技术路线完全过时。

（3）基因治疗基因治疗的常规办法是应用逆病毒做载体，经同外源基因重组后包装成病毒颗粒，之后转染受体细胞，外源基因将整合在受体细胞的染色体上，并以其表达产物弥补原来缺失的基因产物。

运用这一路线现已取得了成功，但近年来出现了一些新方法。

据报道，有人使用两头带气囊的导管将携带半乳糖苷酶的重组逆病毒载体，或使用脂质体包装该基因，经手术导入10头猪主动脉内壁，结果仅在动脉内壁受染部位的内皮细胞中β-半乳糖苷酶的表达，时间长达10日至21周。

而猪的其他器官则无此酶的表达。

人们认为这一方法对于将tPA等植入动脉壁以防治栓塞可能有重要意义。

在糖尿病治疗研究中，日本科学家将表达人胰岛素基因的细胞植入患糖尿病小鼠腹内，结果植入的细胞存活且分泌胰岛素并使小鼠血糖水平明显下降。

还有人不用逆病毒，将功能基因直接注射入活体动物体内就实现基因治疗。

通过直接注射非复制质粒DNA获得表达的方法有三种：

一是直接注射非感染性、非制癌性、由脂质体或免疫脂质体或脂质体与红细胞膜杂交体的质粒DNA，从而获得体内基因表达；二是通过给新生大鼠腹腔内直接注射多种磷酸