土壤微生物的分离纯化与鉴定.docx
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土壤微生物的分离纯化与鉴定
微生物学实验报告
题目：
土壤微生物的分离纯化与鉴定
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一、目的要求
1．通过从土壤中分离纯化细菌，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的分离纯化方法和无菌操作技术。
2．掌握常用的微生物鉴定方法，复习以前学过的各种染色方法，掌握生理生化试验的原理与方法。
3．掌握微生物的鉴定技术、菌种保藏技术。
二、基本原理
1．培养基的配制与灭菌。
培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。
在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。
但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。
不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母的培养基的pH一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的pH一般为中性或微碱性的（嗜碱细菌和嗜酸细菌例外）。
所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。
此外，由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。
2．微生物的分离与纯化。
自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
土壤是微生物生活的大本营，可以从中分离到很多有价值的菌株。
本实验将采用平板划线分离法。
3．分离菌株的鉴定。
微生物的分类鉴定是微生物的重要内容，一般从菌落特征、细菌特点及生理生化、分子生物学等方面进行鉴定。
各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。
不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发酵的类型和最终产物也不一样。
不同细菌对营养的要求不同也说明了它们有不同的合成能力。
所有这些都反映了它们是有不同的酶系统。
细菌的这种生化反应的多样性在自然界产生了两种结果：
第一、使自然界所有的有机分子都有可能得到分解；第二、使不同细菌之间有了互相作用和互相依赖的基础。
另一方面，微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一，细菌的生化反应的多样性也被人们作为细菌的鉴定和分类方法来利用，可以鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。
三、实验器材
1．菌种：
大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。
2．培养基：
牛肉膏蛋白胨培养基，马铃薯培养基，固体油脂培养基，固体淀粉培养基，葡萄糖发酵培养基试管，乳糖培养基试管（内装有倒置的德汉氏小管），蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基。
3．溶液和试剂：
50%乙醇，20%的甘油，硝酸银染色液、香柏油、二甲苯、0.01％美兰水溶液，卢戈氏碘液，甲基红指示剂，5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液，革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式（Lugol）碘液，95%乙醇，番红复染液，香柏油，二甲醇等。
4．土样：
于山东大学中心校区图书馆前光草坪内地表10cm下取得土样。
5．仪器和其他用品：
普通光学显微镜，擦镜纸，酒精灯，载玻片，双层瓶，接种环，试管架，镊子，滴管，二甲苯，香柏油，蒸馏水，盖玻片，吸水纸，无菌平板，无菌试管，U型玻棒，解剖刀，无菌吸管等。
四、操作步骤
1．培养基的制备与分装。
（1）称量：
按培养基配方比例依次准确地称取药品。
（2）熔化：
在沸水浴锅中或电炉上加热熔化。
（3）调pH：
用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调pH至培养基所需pH。
（4）分装：
将溶化的固体培养基趁热加至漏斗上，装试管时，注意管口不要沾上培养基。
液体分装装量不超过试管的1/4，固体分装装量不超过试管的1/5，分装三角瓶的量不超过三角瓶容积的一半，半固体分装装量为试管的1/3，灭菌后垂直待凝。
（5）加棉塞：
培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能，然后包扎一层牛皮纸。
试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。
2．无菌水的制备。
（1）用量筒量取90ml水于带玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。
（2）用10ml吸管取9ml水于试管中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。
3．器皿的准备。
（1）培养皿的包装：
每10套一包，用旧报纸或牛皮纸包扎（或放在特制铁皮圆筒里，加盖扣严）。
（2）吸管的包装：
首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用长纸条包扎、打结。
（3）玻璃涂布棒的包装：
方法同吸管的包装。
（4）枪尖的包装：
放入枪尖盒，牛皮纸包装。
4．高压灭菌。
（1）将所要灭菌物品放入高压蒸汽灭菌锅内，根据需要设定灭菌温度和时间（一般121℃，20min灭菌，若培养基中含有葡萄糖等成分时，113℃，30min灭菌）。
如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
（2）灭菌完毕，将试管培养基搁成斜面，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。
培养基冷至50℃左右，倒平板。
5．微生物的分离与纯化。
（1）制备土壤稀释液：
称取10g土壤，放入灭好菌的无菌水中用玻璃珠打碎土壤，放置30min以上。
然后取10mL土壤原液于1支试管中，再从该试管中取1mL浸液于装有9mL无菌水的试管中，依次操作，分别将土壤浸液稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍，将7支试管按稀释倍数分别记作0，-1，-2，-3，-4，-5，-6号试管。
（2）涂布平板：
分别取各稀释度试管中0.2mL浸液于准备好的细菌培养基平板上，用刮刀分别涂布。
再分别取各稀释度试管中0.2mL浸液于准备好的霉菌培养基平板上，用刮刀分别涂布。
每个稀释度的浸液涂布3个平板。
（3）培养：
将细菌培养基平板置于37℃恒温箱培养24h，将霉菌培养基平板置于27℃恒温箱培养3d。
（4）平板计数及菌落描述：
将培养好的细菌进行平板计数，计算1g土壤中细菌数；并观察其菌落形态特征，记录结果。
（5）平板划线分离：
分别将培养好的细菌、霉菌进行平板划线分离。
分别在适宜温度培养。
（6）菌种保藏（留作鉴定）：
将分离得到的菌种进行斜面保藏。
每株菌保存3支斜面。
6．分离菌株的鉴定。
（1）记录菌种的培养特征。
（2）细菌的革兰氏染色，记录菌体特征与染色特性。
<1>制片：
制片方法与简单染色相同。
<2>初染：
加适量（以刚好覆盖菌为宜）的结晶紫染色液染色1.5min，水洗。
<3>媒染：
碘液媒染1min，水洗。
<4>脱色：
连续滴加95%乙醇脱色20—30s至流出液无色，立即水洗。
<5>复染：
滴加番红复染1.5min，水洗。
<6>镜检：
干燥后，油镜镜检观察。
（3）细菌的芽孢染色。
<1>制片：
按常规方法涂片、干燥及固定。
<2>加热染色：
向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热染液冒蒸气计时并维持5min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。
<3>脱色：
待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。
<4>复染：
用0.5%番红水溶液复染2min。
<5>水洗：
用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。
<6>镜检：
将载玻片晾干后油镜镜检。
（4）细菌的鞭毛染色。
<1>载玻片制备：
将载玻片用洗涤剂清洗干净，置于95%乙醇中浸泡5min，使用时用镊子取出在火焰上烧去乙醇及可能残留的油迹。
<2>制片：
在载玻片一端滴一滴清水，用接种环从斜面培养物种蘸一两下，再在清水中蘸一两下，然后倾斜玻片，使液体缓慢流向载玻片另一端，用吸水纸洗去多余液体，自然干燥。
<3>染色：
滴加硝酸银染液A液覆盖菌面3~5min后用蒸馏水充分洗去A液。
用硝酸银染液B液洗去残留水分后，再滴加B液覆盖菌面40~50秒，其间可用微火加热，当菌面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗，自然干燥。
<4>镜检：
用油镜镜检观察。
（5）细菌的半固体穿刺试验。
<1>培养基试管的制备：
将半固体培养基倒入试管中灭菌后，垂直放置待凝。
<2>接种：
将各菌种用接种针分别穿刺接种于半固体培养基中，37℃恒温箱中培养24h。
<3>观察：
观察细菌生长范围并记录，判断细菌是否有运动性。
（6）查伯杰氏手册，初步对细菌菌种进行鉴定。
（7）进行以下细菌的生理生化试验：
<1>淀粉水解试验
1将固体淀粉培养基溶化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。
2用记号笔在平板底部划成4个部分。
3将选取的各菌分别在不同的部分点一下，在平板的反面分别在4个部分标明所接种细菌。
4将平板倒置在37℃温箱中培养24h。
5观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。
如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。
根据透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。
<2>油脂水解实验
1将熔化的固体油脂培养基冷却至50℃左右时，充分摇荡，使油脂均匀分布，无菌操作倒入平板，待凝。
2用记号笔在平板底部划成4部分，分别在4部分标明所接种细菌。
3用无菌操作将选取的各菌分别划十字线接种于平板的相对应部分的中心。
4将平板倒置，37℃温箱中培养24h。
5取出平板，观察菌苔颜色。
如出现红色斑点，说明脂肪水解，为阳性反应。
<3>糖发酵试验
1用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基的名称和所接种细菌。
2取数支葡萄糖发酵培养基试管，分别接入所选菌种，另取一支葡萄糖发酵培养基试管不接种，作为对照。
取数支乳糖发酵培养基试管，同样分别接入所选菌种，另取一支乳糖发酵培养基试管不接种，作为对照。
在接种后，轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。
3将接过种和作为对照的试管均置37℃中培养24~48h。
4观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。
<4>吲哚试验
1将所选菌种分别接入数支蛋白胨水培养基中，置37℃培养48h。
2向培养基内加入3~4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。
在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。
<5>甲基红试验
1将所选菌种分别接入数支葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃培养48h。
2将1支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。
（8）霉菌的形态观察。
<1>培养小室的灭菌：
在平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤纸片，再放一U形玻棒，其上放一洁净载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖、包扎后于110℃灭菌20~30min，烘干备用。
<2>琼脂块制备：
通过无菌操作，用解剖刀由马铃薯琼脂薄层平板上切下1cm2左右的琼脂块，将其移至培养小室的载玻片上，每片两块。
<3>接种：
通过无菌操作，用接种针分别从各霉菌马铃薯琼脂平板培养物中挑取很少量孢子，接种于小室中琼脂块边缘上，将盖玻片覆盖在琼脂块上。
<4>培养：
通过无菌操作，在培养小室中圆滤纸片上加3~5mL灭菌的20%甘油（用于保持湿度），盖上皿盖，于28℃培养7天。
<5>镜检：
取出载玻片用低倍镜和高倍镜镜检。
（9）对照霉菌图谱，对霉菌菌种进行鉴定。
五、实验结果
1．细菌的平板计数：
【表1】细菌的平板计数结果
菌液浓度
原浸液×10-4
平板
1
2
3
平均
菌落数
13
14
13
13.3
1g土壤中细菌数：
6.7×106个
2．细菌的形态观察：
【表2】细菌菌落的形态特征记录
细菌编号
形状
大小
干湿
颜色
边缘
表面
1
圆形
中等
干
白色
不整齐
隆起
2
圆形
中等
湿
淡黄
整齐
隆起
3
圆形
小
湿
白色透明
整齐
隆起
4
不规则
大
湿
乳白透明
不整齐
不隆起
5
不规则
大
湿
白色
不整齐
不隆起
3．细菌的染色半固体穿刺实验结果
（1）表格：
【表3】细菌的染色半固体穿刺实验结果记录
细菌编号
形状
革兰氏染色
芽孢染色
鞭毛染色
半固体穿刺
1
长杆状
G+
有芽孢
有鞭毛
运动
2
短杆状
G-
无芽孢
无鞭毛
不运动
3
短杆状
G+
有芽孢
无鞭毛
不运动
4
短杆状
G+
有芽孢
有鞭毛
运动
5
短杆状
G+
有芽孢
有鞭毛
运动
（2）图片：
细菌的染色实验结果
<1>革兰氏染色
【图1】1号菌革兰氏染色（10×100）【图2】2号菌革兰氏染色（10×100）
【图3】3号菌革兰氏染色（10×100）【图4】4号革兰氏染色（10×100）
【图5】5号菌革兰氏染色（10×100）【图6】金黄色葡萄球菌革兰氏染色（10×100）
【图7】大肠杆菌革兰氏染色（10×100）
<2>芽孢染色
【图8】1号菌芽孢染色（10×100）【图9】2号菌芽孢染色（10×100）
【图10】3号菌芽孢染色（10×100）【图11】4号菌芽孢染色（10×100）
【图12】5号菌芽孢染色（10×100）
<3>鞭毛染色
【图13】1号菌鞭毛染色（10×100）【图14】2号菌鞭毛染色（10×100无鞭毛）
【图15】3号菌鞭毛染色（10×100无鞭毛）【图16】4号菌鞭毛染色（10×100）
【图17】5号菌鞭毛染色（10×100）
查伯杰氏手册得知，各菌所属类群如下：
【表4】各菌所属类群
菌种编号
所属类群（属）
该属主要特征
1
芽孢杆菌属
菌体杆状，直或接近直，0.3-2.2×1.2-7.0微米，多数运动，鞭毛典型侧生。
形成抗热内生孢子，在一个孢子囊细胞中，孢子不多于1个。
暴露与空气中时，不妨碍孢子的形成。
革兰氏反应为：
阳性、仅在生长早期为阳性、阴性。
有机化能营养，利用多种底物进行严格呼吸代谢，严格发酵代谢或呼吸和发酵二者兼有的代谢。
在呼吸代谢中，最终的电子受体是分子氧，在一些种种可疑用硝酸盐代替氧，大多数种产接触酶。
严格好氧或兼性厌氧。
2
不动杆菌属
杆菌，通常非常短粗，对数期典型菌为1.0-1.5×1.5-2.5微米，静止期近乎球状，排列以成对和短链占优势，在所有的培养物中有少量的大而不规则的细菌和丝状体，但也可占优势，不形成芽孢无鞭毛。
有些菌株在固体的表面在特殊情况下显示“抽搐”式的运动。
荚膜和纤毛可能有或没有。
不产生聚-β-羟基丁酸盐细胞内含物。
革兰氏染色阴性。
具氧化代谢的化能异养菌。
作为碳和能源而利用的有机物通常是多样化的。
无特殊的生长需要，从糖类可能或不能产酸。
氧化酶阴性，接触酶阳性。
不产生乙酰甲基甲醇、吲哚和H2S。
专性好氧菌，最适温度为30-32℃，最适pH约为7。
抗青霉素。
3，4
梭菌属
杆状，一般以周生鞭毛运动，很少不运动。
形成卵园到球形孢子，一般孢子使杆状菌体膨大，通常为革兰氏阳性，至少在生长的早期如此。
有机化能营养。
有些种是解糖的，有些是解朊的，有的两者兼备，有的两者皆否，发酵糖，多元醇、氨基酸、有机酸、嘌呤和其他有机化合物。
有些种固定N，都不还原硫酸盐。
虽然有些种可在大气压下，在存在空气的情况下生长，但绝大多数菌株是严格厌氧的。
一般不产生接触酶，即使产生，数量也少。
5
芽孢乳杆菌属
细胞直杆状，0.7-0.8×3-5微米，单个、成对、很少呈短链，仅为数不多的长周生鞭毛运动。
形成内生孢子。
革兰氏阳性。
有机化能营养，发酵代谢己糖是通过仅仅产生乳酸的典型的同型发酵途径。
不含有血红素化合物，如接触酶或细胞色素。
微好氧。
4．细菌的生理生化试验：
【表5】细菌的生理生化试验结果记录
（注：
“+”表示在淀粉水解试验、油脂水解试验、甲基红试验、吲哚试验中呈阳性以及在葡萄糖发酵试验、乳糖发酵试验中产酸或产气；“-”表示在淀粉水解试验、油脂水解试验、甲基红试验、吲哚试验中呈阴性以及在葡萄糖发酵试验、乳糖发酵试验中不产酸不产气）
细菌编号
淀粉水解试验
油脂水解试验
葡萄糖发酵试验
乳糖发酵试验
甲基红试验
吲哚试验
1
-
-
+
-
+
-
2
-
-
-
-
-
-
3
-
-
+
-
+
-
4
-
-
-
-
-
-
5
+
-
+
-
+
-
空白
-
-
-
-
-
-
5.霉菌的形态观察：
（1）形态特征：
【表6】霉菌形态特征
霉菌编号
形态特征
1，2
菌丝有隔，分生孢子梗亦有隔，顶端不膨大，无顶囊，其分生孢子梗多次分枝，产生对称或不对称的小梗，小顶端有孢子，形如扫帚，称为帚状体。
（2）图片：
【图18】1号霉菌（10×40）【图19】2号霉菌（10×40）
【图20】1号霉菌孢子梗【图21】2号霉菌孢子梗
（3）对照霉菌图谱，得知：
1号菌和2号菌均属于青霉属。
六、附：
本实验用到的各种培养基配方。
（注：
半固体培养基中琼脂用量减半）
1.牛肉膏蛋白胨培养基
牛肉膏1.5g
蛋白胨5g
NaCl2.5g
琼脂10g
水500mL
pH7.0~7.2
121°C灭菌20min
2.马铃薯培养基
马铃薯200g
蔗糖（或葡萄糖）20g
琼脂22~25g
水1000mL
pH自然
马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000mL。
110℃灭菌30min。
3.固体油脂培养基
蛋白胨10g
牛肉膏5g
NaCl5g
香油或花生油10g
1.6%中性红水溶液1mL
琼脂15~20g
蒸馏水1000mL
pH7.2
121℃灭菌20min。
注：
（1）不能使用变质油。
（2）油和琼脂及水先加热。
（3）调好pH后再加入中性红。
（4）分装时，需不断搅拌，使油均匀分布于培养基中。
4.固体淀粉培养基
蛋白胨10g
NaCl5g
牛肉膏5g
可溶性淀粉2g
蒸馏水1000mL
琼脂15~20g
121℃灭菌20min。
5.葡萄糖发酵培养基试管
蛋白胨10g
NaCl5g
葡萄糖12.5g
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1~2mL
蒸馏水1000mL
pH7.6
110℃灭菌30min。
6.乳糖培养基
蛋白胨10g
NaCl5g
乳糖12.5g
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1~2mL
蒸馏水1000mL
pH7.6
110℃灭菌30min。
7.蛋白胨水培养基
蛋白胨10g
NaCl5g
蒸馏水1000mL
pH7.6
121℃灭菌20min。
8.葡萄糖蛋白胨水培养基
蛋白胨5g
葡萄糖5g
K2HPO42g
蒸馏水1000mL
将上述各成分溶于1000mL水中，调pH7.0~7.2，过滤。
分装试管，每管10mL，112℃灭菌30min。
七、参考资料
1.《伯杰细菌鉴定手册》第八版，R.E.布坎南、N.E.吉本斯等编，科学出版社。
2.《微生物学实验》第4版，沈萍、陈向东主编，高等教育出版社。
3.霉菌图谱
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