大肠杆菌及菌落总数范文Word格式.docx
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3.加盖，并将盖上的排气管插入内层的排气槽内，再2两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
4.本实验用0.1MPa，121.5℃，20min灭菌。
灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。
（2）大肠菌群的测定；
1）培养基：
①乳糖胆盐蛋白胨培养基：
蛋白胨20g，猪胆盐（或牛、羊胆盐）5g，乳糖10g，
0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，pH7.4。
制法：
将蛋白胨、胆盐从乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每瓶50mL或每管5mL，并倒置放入一个杜氏小管，l15℃灭菌15min。
双倍或三倍乳糖胆盐蛋白胨培养基：
除水以外，其余成分加倍或取三倍用量。
②伊红美蓝琼脂培养基：
蛋白胨10g，乳糖10g，K2HP042g，2％伊红水溶液20Ml，0.65％美蓝水溶液lOmL，琼脂17g，水1000mL，pH7.1。
将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。
临用时加入乳糖并熔化琼脂，冷至50-55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。
③乳糖发酵管：
除不加胆盐外．其余同乳糖胆盐蛋白胨培养基。
2）器材：
灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
（四）实验方法
（1）水样的采集：
1）自来水：
先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。
2）池水、河水、湖水等地面水源水：
在距岸边5m处，取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。
如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存。
（2）细菌总数的测定：
1）水样稀释及培养：
①按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释：
⑦根据对水样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度（饮用水如自来水、深井水等，一般选择1、1:
10两种浓度；
水源水如河水等，比较清洁的可选择1:
10、1:
100、1:
1000三种稀释度；
污染水—被选择1:
1000、1:
10000三种稀释度），吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个重复。
③将熔化后保温度45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL，并趁热转动平皿混合均匀。
④待琼脂凝固后，将平皿倒置于37℃培养箱内培养24±
1h后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。
2）计算方法：
作平板计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。
在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。
3）计数的报告：
①平板菌落数的选择：
选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。
一个稀释度使用两个重复时，应选取两个平板的平均数。
如果一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数。
若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可计算半个平板后乘2以代表整个平板的菌落数。
②稀释度的选择：
a.应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以该稀释倍数报告之（表1例1）。
b．若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，则视二者之比如何来决定。
若其比值小于2，应报告其平均数；
若比值大于2，则报告其中较小的数字（l例2、例3）。
c．若所有稀释度的平均菌落均大于300，则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（l例4）。
d．若所有稀释度的平均菌落数均小于30、则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（1例5）。
e.若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之（表1例6）。
f.若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以最接近30或300的平均菌落数乘以该稀释倍数报告之（表l例7）。
③细菌总数的报告：
细菌的菌落数在l00以内时，按其实有数报告；
大于100时，用二位有效数字，在二位有效数字后面的数字，以四舍五入方法修约。
为了缩短数字后面的0的个数，可用10的指数来表示，如表1“报告方式”一栏所示。
（3）大肠菌群的测定（多管发酵法）：
表1稀释度的选择及细菌数报告方式
稀释度及菌落数
两稀释度之比
菌落总数/（cfu/g或cfu/mL）
报告方式（菌落总数）/（cfu/mL或cfu/g）
10-1
10-2
10-3
1
多不可计
164
20
-
16400
16000或1.6×
104
2
295
46
1.6
37750
38000或3.8×
3
271
60
2.2
27100
27000或2.7×
4
313
或3.1×
105
5
27
11
270
270或
6
＜10
7
305
12
30500
31000或3.1×
1）生活饮用水或食品生产用水的检验：
①初步发酵试验：
在2个各装有50mL的3倍浓缩乳糖胆盐蛋白胨培养液（可称为三倍乳糖胆盐）的三角瓶中（内有倒置杜氏小管），以无菌操作各加水样100mL。
在10支装有5mL的三倍乳糖胆盐的发酵试管中（内有倒置小管），以无菌操作各加入水样10mL。
如果饮用水的大肠菌群数变异不大，也可以接种3份100mL水样。
摇匀后，37℃培养24h。
②平板分离：
经24h培养后，将产酸产气及只产酸的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板（EMB培养基）上，37℃培养18—24h。
大肠菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带有或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深；
挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。
③复发酵试验：
将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落1—3个，37℃培养24h，如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。
④报告：
根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管数，查表107-2（或表107-3），报告每升水样中的大肠菌群数（MPN）。
2）水源水的检验：
用于检验的水样量，应根据预计水源水的污染程度选用下列各量。
①严重污染水：
1，0．1，0．01．0．00lmL各1份。
②中度污染水：
10．1，0．1，0．01mL各1份。
③轻度污染水：
100，10，1，0．1mL各l份。
④大肠菌群变异不大的水源水：
10mLl0份。
表2大肠菌群检索表（饮用水）
备注
每升水样中大肠菌群数
＜3
接种水样总量300mL（100mL2份，10mL10份）
8
18
13
38
14
24
52
30
70
22
36
92
43
120
31
51
161
9
230
10
40
69
＞230
表3大肠菌群数变异不大的饮用水
阳性管数
接种水样总量300mL（3份100mL）
＞18
表4大肠菌群检索表（严重污染水）
接种水样量/mL
0.1
0.01
0.001
＜900
接种水样总量为1.111（1，0.1，0.01，0.001mL各一份）
+
900
950
1800
1900
2200
2300
2800
9200
9400
18000
23000
96000
＞
表5大肠菌群检索表（中度污染水）
＜90
接种水样总量为11.11（10，1，0.1，0.01mL各一份）
90
95
180
190
220
280
920
940
9600
23800
＞23800
表6大肠菌群检索表（轻度污染水）
100
＜9
接种水样总量为111.1（100，10，1，0.1mL各一份）
9.5
19
23
28
94
960
2380
＞2380
表7大肠菌群变异不大的水源水
160
接种水样总量100mL（10mL10份）
操作步骤同生活用水或食品生产用水的检验。
同时应注意，接种量1mL及1mL以内用单倍乳糖胆盐发酵管；
接种量在1mL以上者，应保证接种后发酵管（瓶）中的总液体量为单倍培养液量。
然后根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数，查表107-4、表l07-5、表107-6或表107-7，报告每升水样中的大肠菌群数（MPN）。
附：
滤膜法
滤膜法所使用的滤膜是一种微孔滤膜。
将水样注入已灭菌的放有滤膜的滤器中，经过抽滤，细菌即被均匀地截留在膜上，然后将滤膜贴于大肠菌群选择性培养基上进行培养。
再鉴定滤膜上生长的大肠菌群的菌落，计算出每升水样中含有的大肠菌群数（MPN）。
（1）准备工作：
1）滤膜灭菌：
将3号滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中蒸煮灭菌3次，每次15min。
前两次煮沸后需换无菌水洗涤2-3次，以除去残留溶剂。
2）滤器灭菌：
准备容量为500mL的滤器，用点燃的酒精棉球火焰灭菌，也可用121℃高压灭菌20min。
3）培养：
3）培养：
将品红亚硫酸钠培养基放入37℃培养箱内预温30-60min。
（2）过滤水样：
1）用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将祖糙面向上贴放于已灭菌的滤床上，轻轻地固定好滤器漏斗。
水样摇匀后，取333mL注入滤器中，加盖，打开滤器阀门，在—50kPa压力下进行抽滤。
2）水样滤完后再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用无菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上与培养基完全紧贴，两者间不得留有间隙或气泡。
若有气泡需用镊子轻轻压实，倒放在37℃培养箱内培养16-18h。
（3）结果判定：
1）挑选符合下列特征的菌落进行革兰氏染色，镜检。
①紫红色，具有金属光泽的菌落。
②深红色，不带或略带金属光泽的菌落。
③淡红色，中心颜色较深的菌落。
2）凡是革兰氏阴性无芽胞杆菌，需再接种于乳糖蛋白胨半固体培养基，37℃培养6-8h，产气者，则判定为大肠菌群阳性。
3）1L水样中大肠菌群数等于滤膜法生长的大肠菌群菌落数乘以3
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