GST标签的去除.docx

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GST标签的去除

GST标签的去除

GST标签的去除可在目的蛋白的功能或结构研究之前进行。

根据目的蛋白的性质不同，完全消化所需的蛋白酶量、温度、及孵育长度也各异。

含有PreScission蛋白酶、凝血酶或Xa因子识别位点的标签蛋白可在与GlutathioneSepharose层析填料结合时切割，或者洗脱后在溶液中切割。

当GST蛋白与柱结合时，切割释放了目的蛋白，它与结合缓冲液一起洗脱，而GST部分仍与填料结合。

一般来说，柱上切割是推荐使用的方法，因为许多潜在的杂质都能洗掉，目的蛋白在洗脱时具有更高的纯度。

如果需要优化切割条件，建议洗脱后切割。

从蛋白或肽段制备中去除丝氨酸蛋白酶如凝血酶、Xa因子和PreScission蛋白酶，可利用BenzamidineSepharose4FastFlow来进行，此填料有大包装。

为了方便，BenzamidineSepharose4FastFlow也有预填充的HiTrapBenzamidineFF1ml和5ml柱。

凝血酶

凝血酶能够对带有可接近的凝血酶识别序列的融合蛋白进行位点特异的切割，用于消化包含凝血酶识别序列的pGEX载体所制备的GST标签蛋白（pGEX-1λT、pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2及pGEX-4T-3）。

在22°C，1×PBS中，一个单位的酶16小时可切割100μg待测GST标签蛋白，切割效率在90%以上。

Xa因子

纯化自牛血浆的Xa因子特异切割四肽Ile-Glu-Gly-Arg之后的蛋白，可用于消化包含此序列的pGEX载体所制备的GST标签蛋白（pGEX-3X、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2和pGEX-5X-3）。

在22°C，1mMCaCl2、100mMNaCl和50mMTris-HCl（pH8.0）的反应体系中，一个单位的酶16小时可切割100μg待测GST标签蛋白，切割效率在90%以上。

PreScission蛋白酶

PreScission蛋白酶是一种遗传改造的融合蛋白，由人鼻病毒3C蛋白酶和GST组成。

这种蛋白酶是专为蛋白酶的去除而设计，能实现同时的蛋白酶固定和pGEX-6P载体（pGEX-6P-1、pGEX-6P-2和pGEX-6P-3）所产生的GST融合蛋白的切割。

PreScission蛋白酶特异切割Glu和Gly残基之间的识别序列LeuGluValLeuPheGlnGlyPro。

蛋白酶在4°C具有最大活性，因此切割在低温下进行，改善了目的蛋白的稳定性。

在5°C，50mMTris-HCl、150mMNaCl、1mMEDTA、1mMDTT（pH7.0）的反应体系中，一个单位的酶16小时可切割100μg待测GST标签蛋白，切割效率在90%以上。

GST标签蛋白可通过亲和层析，利用固定在基质上的谷胱甘肽从例如细菌裂解液中轻松纯化。

GST与谷胱甘肽之间的高特异性确保了单个步骤就能获得高纯度。

洗脱在温和、非变性的条件下进行，因此保留了蛋白的抗原性和功能。

通用电气医疗集团现有多种亲和纯化产品。

GlutathioneSepharose填料（表1）也有多种形式，从预填充的MultiTrap™96孔过滤板到预装柱的SpinTrap™、GraviTrap™、HiTrap™及HiPrep™柱，或实验室包装（填料包装的体积从25ml到500ml）。

不同的形式提供了从微克到克规模的样品的纯化选择。

表1.GlutathioneSepharose填料的特征

1每毫升填料结合的重组谷胱甘肽硫转移酶。

GST蛋白的结合取决于上样样品中蛋白的大小、构象和浓度。

GST与谷胱甘肽的结合也是流速依赖的，低流速通常会提高结合能力。

这对于上样过程很重要。

蛋白性质、pH和温度，以及使用过的填料也会影响结合能力。

2室温下的水。

仪器的选择将取决于特定的纯化。

在利用微型离心柱时洗脱在台式离心机中进行，或利用重力流柱手动进行，或利用蠕动泵或注射器再加上预填充的GSTrap柱进行分步梯度洗脱。

GSTMultiTrap96孔板是为小体积的高通量筛选而设计的，每孔能纯化多达～500μgGST标签蛋白。

每根GSTSpinTrap柱能纯化多达500μg蛋白。

对于更大量的纯化，预装柱如GSTGraviTrap、GSTrap和GSTPrep16/10则提供了卓越的形式。

GSTSpinTrap柱

GSTSpinTrap柱非常适合放大之前的表达水平及纯化条件的筛选。

柱的设计可用于微型离心机。

每根柱子含有50μlGlutathioneSepharose4B，足够纯化最多500μg重组GST。

柱子在含有0.05%Kathon™（一种抗菌的防腐剂）的1×PBS缓冲液中经过了预平衡。

每个包装含有50根柱子。

随机选择大肠杆菌转化物，这些转化物中含有表达带GST标签的人肌红蛋白的cDNA，之后表达，并用GSTSpinTrap柱进行纯化。

人肌红蛋白的cDNA与线性化的pGEX-5X-1连接，并转化大肠杆菌BL21细胞。

24个随机选择的克隆接种到3ml培养基中，过夜培养。

用IPTG诱导表达2小时。

取每个培养物1.5ml，通过反复冻融步骤制备裂解液，再上样到GSTSpinTrap柱中。

取每种还原型谷胱甘肽洗脱液的等份，上样到SDS凝胶中，用于SDS-PAGE的分析（图1）。

结果显示，24个转化物中的7个表达了带GST标签的肌红蛋白。

图1.筛选24个随机选择的含有表达带GST标签的人肌红蛋白的cDNA的大肠杆菌转化物，将洗脱液进行SDS-PAGE分析。

M=LMW-SDSMarkerKit。

1-24泳道含有利用还原型谷胱甘肽从GSTSpinTrap柱上洗脱下来的产物。

GSTGraviTrap柱

GSTGraviTrap是方便的一次性柱子，其中预装了2mlGlutathioneSepharose4B，足够纯化最多20mgGST标签蛋白。

每个包装含有10根预装柱，是由生物兼容的聚丙烯制造的。

特殊的釉料保护填料在纯化过程中不会变干。

GSTGraviTrap柱在送达时的包装可便利地转化成柱子支架（Workmate）。

产品包装中的塑料托盘可用于收集废液。

当处理体积超过10ml时，将Labmate™PD-10BufferReservoir与柱子连接，能将上样量增加至大约35ml。

GSTBulk试剂盒

GSTBulk试剂盒含有10ml大包装的GlutathioneSepharose4B和5根一次性的柱子。

有了这个试剂盒，GST标签蛋白可利用柱层析或分批法进行纯化。

GSTBulk试剂盒含有足够的试剂，能纯化最多50mgGST标签蛋白。

GSTMultiTrap96孔过滤板

GSTMultiTrap96孔过滤板目前有两种选择：

GSTMultiTrapFF和GSTMultiTrap4B，分别预装了GlutathioneSepharose4FastFlow和GlutathioneSepharose4B。

两种产品都能提供高重复性、高通量的筛选，从不澄清或澄清的样品中小规模快速纯化GST标签蛋白。

典型的应用包括不同重组子的表达筛选，蛋白可溶性的筛选，以及小规模平行纯化条件的优化。

利用GSTMultiTrap可直接从不澄清的细胞裂解液中纯化最多500μgGST标签蛋白/孔，缩短了操作时间，将敏感目的蛋白的降解降至最低。

96孔板形式具有很大的灵活性，可与自动化的机器人系统共同使用，也可通过离心或抽真空手工操作。

孔与孔之见、板与板之间的一致性能确保了高重复性。

利用GSTMultiTrapFF来设计缓冲液筛选研究，确定纯化GST-海马钙结合蛋白的最佳缓冲液条件。

检测的参数有缓冲液、pH、氯化钠、甘油、DTT和谷胱甘肽。

同时还进行了超声破碎与市售细胞裂解试剂盒的使用效果比较。

利用MODDE™软件（Umetrics）来进行因子设计（实验设计）和统计分析。

不同缓冲液条件和样品制备方法随机应用到过滤板中。

样品、结合缓冲液或洗涤缓冲液中谷胱甘肽的存在显著降低了纯化的GST-海马钙结合蛋白的产量，而缓冲液对产量无影响。

低pH改善了产量，而pH和添加剂如DTT、甘油或氯化钠未显著影响纯度（图2）。

筛选结果表明，对于GST-海马钙结合蛋白的纯化，获得最高产量和纯度的缓冲液条件是介于10到20mM的磷酸钠，140到400mM的NaCl，pH6.2-7.4。

样品制备可通过市售的细胞裂解试剂盒及超声破碎来进行，不会显著影响纯化结果。

图2.将GSTMultiTrapFF过滤板的一些孔中收集而来的GST-海马钙结合蛋白的洗脱组分进行SDS-PAGE（还原条件，ExcelGel™SDSGradient8–18；考马斯蓝染色）。

GST缓冲液试剂盒

GST缓冲液试剂盒含有纯化GST标签蛋白所使用的结合及洗脱缓冲液的储备溶液。

试剂盒省去了耗时的缓冲液制备，促进了快速、便利且重现性好的纯化工作。

足够的试剂可纯化最多20mgGST标签蛋白。

GST缓冲液试剂盒含有10×PBS，还原型谷胱甘肽、稀释缓冲液和操作指南小册子。

蛋白纯化的放大

纯化过程可轻松放大；GlutathioneSepharose4FastFlow、GlutathioneSepharose4B及GlutathioneSepharoseHighPerformance都有更大的预装柱，以及大包装的填料。

推荐增加第二步的凝胶过滤步骤，来精炼目的蛋白，去除可能的聚集物。

GSTrap亲和柱是1ml和5ml的HiTrap预装柱，能纯化毫克级的GST标签蛋白。

GSTrap柱填充有三种不同的GlutathioneSepharose填料——GSTrapFF、GSTrap4B和GSTrapHP。

利用注射器及提供的连接器，蠕动泵或液相色谱系统如ÄKTA™design，可进行样品上样、洗涤和洗脱。

GSTprepFF16/20是预装了GlutathioneSepharose4FastFlow的20mlHiprep柱，可用于毫克至克规模的GST标签蛋白的纯化。

来自通用电气医疗集团（GEHealthcare）的谷胱甘肽硫转移酶（GST）基因融合系统是一种表达、纯化和检测大肠杆菌中所产生的GST标签蛋白的多功能系统。

系统包括三个主要成分：

pGEX质粒表达载体、GST纯化的产品以及一系列GST检测产品。

一系列切割GST标签的位点特异蛋白酶则是该系统的补充。

GST亲和标签实现了温和的纯化过程，不会影响蛋白的天然结构和功能。

GST基因融合系统的优势包括：

• 所有pGEX载体带有tac启动子，实现化学诱导的高水平表达

• 温和、非变性的缓冲液成分，以分离活性蛋白

• 基于GlutathioneSepharose™填料的亲和层析产品实现了从微克到克规模样品的一步纯化

• 方便的预装柱形式适合单个样品或平行筛选多个重组克隆

• pGEX载体上的PreScission™蛋白酶、凝血酶或Xa因子识别位点能将目的蛋白从融合产物中切割下来

• 利用抗-GST抗体轻松检测融合蛋白

在天然情况下，GST以分子量26,000的蛋白存在，它在大肠杆菌中的表达产物具有完全的酶活。

经过鉴定，pGEX载体的重组日本血吸虫（Schistosomajaponicum）GST的晶体结构与天然蛋白一致。

pGEX质粒载体将基因或基因片段与GST融合后，在细胞内高水平诱导表达。

重组蛋白很容易利用GlutathioneSepharose填料通过亲和层析从比如大肠杆菌细胞裂解液中纯化（图1），要么是预装柱，要么是分批纯化。

图1.GlutathioneSepharoseHighPerformance、GlutathioneSepharose4FastFlow以及GlutahioneSepharose4B目前都有大包装填料，预装柱以及多孔板，用于GST标签蛋白的纯化。

利用位点特异的蛋白酶，可实现目的蛋白与GST的切割，此蛋白酶的识别位点位于pGEX载体上多克隆位点的上游。

GST标签的切除是在柱中进行的，作为纯化步骤或纯化后离线的一部分。

重组蛋白可利用GST检测模块中提供的免疫分析来检测，或用抗-GST抗体在Westernblotting中检测，或通过比色分析来检测。

pGEX载体

通过将一个基因或基因片段插入某个pGEX载体的多克隆位点，可构建出GST标签蛋白。

载体提供了三种翻译读码框，从EcoRI限制性酶切位点开始（详见表1）。

pGEX载体是为基因或基因片段的高水平细胞内诱导表达而设计的。

大肠杆菌中的表达产生了标签蛋白，GST部分在氨基端，目的蛋白在羧基端。

目前有13个pGEX载体（详见图2）；所有载体都有tac启动子，用于高水平的化学诱导表达，以及内部的lac1q基因，在任何大肠杆菌宿主中使用。

图2.谷胱甘肽硫转移酶融合载体的图谱，显示出读码框和主要特征。

所有13个载体在三种读码框内多克隆位点的下游都有终止密码子。

（此图谱中未指出）。

9个载体有扩展的多克隆位点（MCS），含有6个限制性酶切位点。

扩展的MCS有助于从多种市售λ载体的文库构建物中获得的cDNA片段的定向克隆。

pGEX-6P-1、pGEX-6P-2和pGEX-6P-3都在GST结构域和多克隆位点之间编码了PreScission蛋白酶的识别位点，用于位点特异的切割。

pGEX-4T-1、pGEX-4T-2和pGEX-4T-3都来自pGEX-2TK，含有凝血酶的识别位点。

pGEX-5X-1、pGEX-5X-2和pGEX-5X-3则是pGEX-3X的衍生物，含有Xa因子的识别位点（详见表1）。

表1.pGEX载体的蛋白酶切割位点

pGEX-2TK设计独特，它通过融合产物的体外直接标记，实现了表达蛋白的检测。

此载体含有从心肌中获得的cAMP依赖蛋白激酶的催化亚基的识别位点。

蛋白激酶位点位于GST结构域和MCS之间。

利用蛋白激酶和[γ-32P]ATP可直接标记表达的蛋白，用标准的放射测定或放射自显影技术可轻松检测。

pGEX-2TK是pGEX-2T的衍生物；它的融合蛋白可用凝血酶来切割。

pGEX载体都提供了三种翻译读码框，从EcoRI限制性酶切位点开始。

pGEX-1λT、pGEX-6P-1、pGEX-4T-1和pGEX-5X-1可直接接受并表达分离自λgt11文库的cDNA片段。

索取pGEX载体的更多资料

为了补充pGEX载体，目前还有GST载体的测序引物，可立即用于pGEX载体中插入的双链DNA的测序。

多种大肠杆菌宿主菌株可用于pGEX载体的克隆和表达。

E.coliBL21，一种用于重组蛋白的最优表达的蛋白酶缺陷的冻干大肠杆菌宿主菌株，也可单独购买。

（未完，待续）