分子生物学副本Word文件下载.docx

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在供体基团的一个共价结合的氢原子（-O-H）和受体基团上的一对非成键电子（O=C-）间形成。

•范德华力：

电中性分子间的非共价结合力的总称。

•疏水相互作用（疏水堆积力）：

一些非极性分子倾向于聚集起来以减少暴露给水的表面积，从而产生的力。

疏水相互作用是蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂类相互作用以及核酸结构中的主要稳定力。

第三章　基因的概念

正确理解基因的内涵、了解证明核酸是遗传物质的三个实验、基因概念的多样性（名词解释）以及一个典型原/真核基因的结构。

1.基因概念的发展

a.孟德尔的“遗传因子”

1909年丹麦学者约翰森提出了“基因”

b.基因位于染色体上---摩尔根的染色体-基因学说

c.核酸是遗传物质

d.一个基因一种酶（onegene-oneenzyme）

e.一个顺反子一条多肽链

Ø

顺反子（cistron，又叫作用子）是由互补测验定义的遗传功能单位，是一个基因功能不可分割的单位。

突变子（muton）是基因突变时，产生突变的最小单位。

一个突变子可以小到只是一个核苷酸对。

重组子（recon）是基因重组时，可交换的最小单位。

交换有时也只有一个核苷酸对。

证明遗传物质是核酸（DNA或RNA）有3个著名的实验：

①肺炎双球菌的转化试验；

②噬菌体感染实验；

③烟草花叶病毒的感染实验。

2.基因概念的多样性

a.结构基因和操纵基因

操纵子模型解开了基因表达的调控机制

操纵基因是原核生物的操纵子中调节蛋白的结合位点，为控制结构基因转录的DNA序列

b.重叠基因

不同的基因共用一段相同的DNA序列

c.断裂基因

原核生物的基因一般是连续的，而真核生物的绝大多数基因都是不连续的断裂基因。

无编码意义的插入片段称为内含子（intron），有编码意义的基因片段称为外显子（exon）。

d.跳跃基因（转座子）

可移动的遗传基因存在，某些基因具有游动性。

转座子除了含有与改变自身位置有关的基因以外，还携带与插入功能无关的基因。

e.不编码蛋白质的基因

RNA基因，或者分别称为rRNA基因和tRNA基因

f.假基因

指具有与功能基因相似的序列，但不能翻译有功能蛋白质的无功能基因。

它往往存在于真核生物的多基因家族中。

•

（1）常规假基因：

指基因的核苷酸序列因为突变而发生改变，导致基因失活。

如珠蛋白假基因。

•

（2）已加工的假基因：

以某个基因的mRNA合成的cDNA拷贝再次插入到基因组后，由于缺少上游调控序列不能转录而引起的基因失活。

基因家族：

一组功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因。

它们可以串联排在一起，形成基因簇；

也可以位于不同的染色体上。

基因：

能够表达出一个有功能的多肽链或功能RNA分子的核酸序列。

原核生物的基因应包括：

调控序列，5’-非翻译区，编码序列，3’-非翻译区。

真核生物的基因应包括：

调控序列，5’-非翻译区，外显子，内含子，3’-非翻译区。

•许多真核生物的基因都被内含子所隔断。

•RNA剪接：

去除内含子并连接外显子的过程。

•在原核生物中，基因和顺反子通常等价。

•在真核生物中，顺反子等价于基因的外显子。

内含子在进化中的意义

有利于生物遗传的相对稳定。

增加变异概率，有利于生物的进化。

遗传重组是生物进化的主要动力；

遗传重组容易发生在内含子中。

扩大生物体的遗传信息储量。

　　改变读码框架；

可变剪接。

利用内含子进行代谢调节。

第四章　核酸的结构和性质

核酸的二级结构：

双螺旋模型、加卡夫法则、双螺旋结构的类型（左手、右手，A、B、Z）、稳定力；

三级结构：

连接数、缠绕数、扭曲数，拓扑异构酶；

理化特性和热力学特性：

RNA水解敏感性高的原因；

增色效应和减色效应；

变性、复性，Tm；

回文序列。

嘌呤为双环结构，嘧啶为单环结构

在DNA中则为脱氧核糖，即2’位的羟基为氢原子所取代。

核苷=碱基+戊糖

核苷酸（nucleotide）：

由一个或多个磷酸分子与核苷共价结合而成。

5’-三磷酸脱氧腺苷（dATP）

NTP和dNTP是组成核酸大分子的基本元件，但DNA和RNA链中的重复单位是单磷酸（脱氧）核苷

DNA是由脱氧核糖核苷酸通过3’,5’-磷酸二酯键连接起来的生物大分子。

DNA/RNA序列:

一般用碱基字母代表，通常从左向右按5’到3’端方向书写。

6.DNA与RNA的异同点：

相同点：

结构的基本单位相同，5’3’方向，线性分子。

不同点：

a.在DNA中，戊糖是脱氧核糖；

在RNA中戊糖是核糖。

b.TU

c.RNA主要是单链形式；

DNA主要是双链形式。

DNA的二级结构－双螺旋

1WatsonandCrick（1953）提出的DNA双螺旋结构模型：

DNA分子通常以右手双螺旋形式存在，两条核苷酸链反向平行，且互为互补链。

戊糖－磷酸骨架在分子的外铡，在分子表面形成大沟和小沟，碱基堆积于螺旋内部.

碱基间通过氢键相互连接，A和T以2个氢键配对，G和C以3个氢键配对.

螺旋中相邻碱基间相隔0.34nm，每10个碱基对螺旋上升一圈，螺距为3.4nm，直径为2nm。

2.Chargaff（加卡夫）法则：

1）所有DNA中，A与T的摩尔含量相等（A=T），G与C的摩尔含量相等（G=C）,即嘌呤的总含量与嘧啶的总含量相等（A+G=T+C）。

2）DNA的碱基组成具有种属的特异性，但没有组织和器官的特异性。

3）生长和发育阶段，营养状态和环境的改变都不使DNA的碱基组成改变。

4.DNA双螺旋结构的类型:

三种形态的DNA：

A-DNA,B-DNA,Z-DNA

两类：

右手螺旋和左手螺旋

DNA的三级结构－超螺旋

正超螺旋：

DNA扭曲的方向与双螺旋方向相同。

具正超螺旋的DNA处于过旋状态。

（左手超螺旋）

负超螺旋：

DNA扭曲的方向与双螺旋方向相反。

具负超螺旋的DNA处于欠旋状态。

（右手超螺旋）

超螺旋的水平可以用连接数的变化（Lk）来衡量。

连接数Lk（Linkingnumber）：

两条链相互连接的数目。

负超螺旋DNA具有比松弛的DNA更高的能量。

这一能量会使DNA螺旋更易于局部解旋。

因此，负超螺旋有利于一些需要螺旋解旋的细胞过程，如转录起始或复制。

2.超螺旋的拓扑学

缠绕数Tw（Twistingnumber）：

双螺旋本身的螺旋数。

扭曲数Wr（Writhingnumber）：

围绕超螺旋轴扭曲的圈数。

连接数=缠绕数+扭曲数；

Lk=Tw+Wr

拓扑异构体：

一个具有给定连接数的DNA分子。

除非DNA的一条或两条链发生断裂，否则连接数保持不变。

当连接数不变时，DNA分子的构型可以发生改变。

主要通过缠绕数和扭曲数的变化来实现。

3.超螺旋的转变

1）嵌入剂如溴化乙锭（EB）影响DNA双螺旋内部缠绕：

缠绕数减少，扭曲数增加，而连接数不变。

2）拓扑异构酶：

能调控DNA分子超螺旋水平的酶。

拓扑异构酶I：

在一条链的磷酸骨架上产生断裂，每次断裂使Lk变化±

1，一条链穿过缺口。

利用水解磷酸二酯键提供能量，不需要额外的能量。

拓扑异构酶II：

在2条链的磷酸骨架上都产生断裂，每次断裂使Lk变化±

2。

反应由ATP提供能量，2条链穿过缺口。

在原核生物（大肠杆菌）中，拓扑异构酶I称为酶；

拓扑异构酶II称为螺旋酶或旋转酶。

生物体内通过两种拓扑异构酶的相互抑制作用，维持了体内基本恒定的5%的负超螺旋密度。

生物体内DNA的负超螺旋密度低于或超过5%时，均不利于其生长发育。

体内DNA超螺旋的形成或去除与DNA功能相联系。

如：

DNA复制，转录等。

4.超螺旋的功能：

a）在DNA解链过程中更容易打开DNA。

负超螺旋

b）使DNA不易受到核酸酶等的攻击。

c）有利于更加紧密的结构的形成，如染色体结构。

在真核生物细胞内，DNA三级结构与组蛋白八聚体共同组成核小体，核小体是染色质的基本结构单位。

在核小体基础上，DNA链经反复折叠形成染色体。

五、DNA的结构多样性

1）单链DNA

a.几类病毒的DNA呈单链状态。

球形病毒Ø

X174，棒型病毒MB。

b.单链DNA分子内可形成部分双链，不规则的发夹结构。

c.单链DNA的密度通常比双螺旋DNA大。

2）线性DNA

3）环状DNA

猴病毒SV40，质粒，大多数细菌染色体。

a.开环DNA：

双链中一条链呈闭合环状，另一条链的骨架上有缺口。

b.闭环DNA：

两条链都呈闭合环状，也称为共价闭环DNA。

4）反向重复与回文序列

反向重复的２个拷贝间不一定要相互连接在一起

六RNA的结构和功能

1）RNA分子通常以单链形式存在

2）RNA分子局部发生分子内碱基配对形成二级结构

3）碱基配对，其它氢键的相互作用以及碱基堆积作用使RNA形成复杂的三级结构

1.真核生物成熟mRNA的结构特点：

1）5’端帽子结构

即在5’端加上一个7-甲基鸟苷

帽子结构能促进核糖体与mRNA的结合，加速翻译起始速度，同时可以增强mRNA的稳定性。

2）3’末端多聚A的尾巴。

可能与mRNA从核内向胞质转移及mRNA的稳定有关。

mRNA的功能是把核内DNA的碱基顺序按照碱基互补的原则，转录并转送至胞质，指导蛋白质的合成。

2.转运RNA是细胞内分子量最小的一类核酸，其功能是在蛋白质合成过程中作为各种氨基酸的载体。

tRNA的特点：

（1、tRNA分子中含有10~20%的稀有碱基，包括双氢尿嘧啶（DHU）、假尿嘧啶（Ψ）和甲基化的嘌呤（mG，mA）。

（2、tRNA中存在一些能局部互补配对的区域，能形成局部双链，进而形成一种茎-环或发夹结构。

由于茎环结构的存在，使tRNA形成了三叶草形的二级结构。

（3、tRNA共同的三级结构：

倒L型。

3.核糖体RNA（ribosomalRNA，rRNA），是细胞内含量最多的RNA，约占RNA总量的80%以上。

rRNA与核蛋白体蛋白共同构成核糖体（ribosome）。

核小RNA（SnRNA）：

发现于真核生物细胞核中，与前体mRNA剪接成成熟mRNA的过程相关。

核仁小RNA（snoRNA）：

发现于真核细胞核的核仁区，在rRNA分子的加工过程中起到核心作用（比如在某个核苷酸位点上加上一个甲基）。

微小RNA（miRNA）和短干扰RNA（siRNA）：

是调控个别基因表达的小RNA。

七、核酸的理化特性

1.核酸结构的稳定性

氢键促成了双链的形成，但对核酸结构的稳定性无多大影响。

核酸螺旋的稳定性取决于：

1）碱基对间的疏水堆积作用

2）碱基相互作用的范德华力

2.酸效应

强酸＋高温核酸完全水解为碱基、核糖／脱氧核糖和磷酸。

pH=3-4连接嘌呤（A和G）和核糖的糖苷键发生断裂，产生脱嘌呤核酸。

3.碱效应

1）DNA

1.pH>

7-8时，碱基的互变异构态发生变化，由酮式向烯醇式转化。

2.这种变化影响到特定碱基间的氢键作用，结果导致DNA双链解离，称为碱变性。

2）RNA

pH较高时，同样导致内部氢键断裂，RNA的螺旋区域发生变性。

同时，2’-OH参与磷酸二酯键分子内裂解，形成2’,3’-环磷酸二酯。

因此，即使在中性条件下，RNA水解的敏感性也比DNA高得多。

4.化学变性：

化学变性：

在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链。

监测指标为A260的变化。

一些化学物质，如尿素（H2NCONH2）和甲酰胺（HCONH2）能使DNA或RNA在中性pH条件下变性。

这些物质破坏了氢键作用，由碱基堆积形成的疏水作用被减弱，导致核酸变性。

5.黏性

DNA很细而长，是一个相对刚性的线性高分子，因此在溶液中黏性很强。

长的DNA分子易被机械力和超声波损伤。

而RNA分子远小于DNA，粘度也小得多。

应用：

利用机械力和超声波可产生特定长度的DNA片段。

当要分离大片段的DNA分子时，要避免机械作用。

6.浮力密度

在8M氯化铯（CsCl）溶液中，DNA与溶液的密度大致相同，约为1.7g·

cm-3。

平衡（等）密度梯度离心

八、核酸的光谱学和热力学特性

1.紫外光吸收：

核苷酸的嘌呤、嘧啶环上由于有共轭双键，能强烈地吸收紫外光，在波长为260nm处吸收达到最大值，利用该特性可以对核酸进行检测、定量与纯化。

增色效应和减色效应

单一的核苷酸在260nm的光吸收值最大，其次是单链DNA（ssDNA）或RNA，而双链DNA（dsDNA）最小。

ssDNA（单链）dsDNA（双链）：

减色；

dsDNAssDNA：

增色。

2.DNA的纯度

可大致由A260/A280的比值来确定。

纯dsDNA的A260/A280为1.8，纯RNA的A260/A280为2.0。

而蛋白质由于lmax=280nm，A260/A280小于1（实际上在0.5左右）

3.DNA热变性

除化学物质外，加热也可使DNA和RNA中双链部分氢键的断裂，从而导致变性。

1）DNA热变性从开始到完全解链是在一个相当窄的温度范围内完成的。

通常把DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为DNA的解链温度，用Tm表示。

2）Tm是DNA样品中（G+C）含量的函数，对于长DNA分子，其取值范围是80~100°

C。

3）影响Tm值的因素：

a）DNA片段的均一性，dsDNA的含量越高，Tm越大

b）（G+C）含量。

DNA每增加1%的（G+C）含量，Tm值增加大约0.4°

c）介质的离子强度。

介质的离子强度低时，Tm值也低，熔解温度范围也宽。

4）环状DNA的变性：

（a）如果两条链都是闭合环状的,变性可以打破双螺旋结构，但两条单链相互缠绕在一起，不能分开。

（b）如果其中一条或两条链上有切刻，两条链在热变性时将分开。

4.DNA复性

在一定条件下，变性的DNA的互补碱基对间氢键重新形成，恢复原来的双链状态，称为复性。

热变性DNA经缓慢冷却后即可复性，也称为退火。

v快速降温：

仅在局部区域发生碱基配对，重新形成双链。

光吸收值下降很小。

如dsDNA加热变性后将其迅速冷却至4℃以下，则不可能发生复性。

比Tm低25℃为DNA复性的最佳条件。

v慢速降温：

互补链相互配对，形成完全的双链DNA。

光吸收值与原初样品相同。

v核酸杂交：

利用变性、复性技术使不同来源的核酸互补序列结合形成双螺旋结构的过程。

例：

Southern杂交、Northern杂交。

分子杂交：

在DNA复性过程中，双链分子的再形成既可以发生在序列完全互补的核酸分子之间，也可以发生在碱基序列部分互补的不同的DNA之间或DNA与RNA之间，这种现象称为分子杂交。

第五章　DNA的复制

基本概念：

DNA半保留复制、前导链、后随链、冈崎片段、复制子、复制泡、引发体、复制体等；

DNA复制的特点；

原核生物DNA复制的过程及其与真核生物DNA复制间的比较；

复制过程中涉及到的酶（DnaA、DnaB、DnaC、SSB蛋白、DNA拓扑异构酶、DNA聚合酶I、II、III）及其功能；

端粒的结构、复制过程及其与其它部分DNA复制的异同点；

klenow大片段

1.关于DNA复制机制的学说

全保留复制

分散复制

半保留复制

二、复制子

复制子（replicon）：

生物体的复制单位，一个复制子只含有一个复制起始点。

——复制的起点（Originofreplication）：

复制开始于分子内部的某个点。

——复制泡：

DNA合成时从复制起点开始向一边或两边移动，形成的泡状中间产物。

——复制叉（replicationfork）：

复制时DNA双链解开分成二股单链，新链沿着张开的二股单链生成，复制中形成的这种Y字形的结构称为复制叉。

——DNA分子复制时，有两种类型的区域：

（1）亲代双链组成的父本区

（2）进行子代链合成的复制区

——复制的方向可以单向，也可以双向

单向复制：

起点只有一个复制叉。

双向复制：

起点处有两个复制叉，向相反方向移动。

原核生物染色体、许多噬菌体及病毒的DNA分子都是作为单个复制子进行复制的，一个起点，双向进行。

真核生物染色体含有多个复制子，可以同时在多个起点进行双向复制。

复制叉移动的方向和速度可以多种多样，但以双向等速为主。

三、DNA复制的特点

1.链增长方向为5’3’

2.冈崎片段与不连续复制：

前导链：

合成方向与复制叉移动的方向一致，通过连续的5’3’聚合反应合成的新的DNA链。

后随链：

合成方向与复制叉移动的方向相反，通过不连续的5’3’聚合反应合成的新的DNA链。

冈崎片段：

相对比较短的DNA链（1000-2000nt），是在DNA后随链的不连续合成期间生成的片段。

3.需要RNA作引物

用RNA引导DNA的复制对DNA复制的高忠实性至关重要

DNA复制的基本特点：

DNA复制是从特定的复制起点开始，大多数是双向进行。

采用半保留和半不连续复制的方式进行复制，方向是5’3’，且需要多种酶和蛋白质的参与，需要RNA作引物。

四、原核生物DNA的复制（E.coli）

1.与解链有关的酶和蛋白质

（1）解螺旋酶（helicase）：

DnaB

（2）单链结合蛋白（SSB蛋白）

c.协同效应：

原核生物中，如果第一个SSB结合到DNA上的能力为1，则第二个SSB的结合能力可高达1000。

真核生物的SSB蛋白无协同作用。

（3）DNA拓扑异构酶

拓扑异构酶作用特点：

既能水解、又能连接磷酸二酯键

2.DNA聚合酶

核酸酶：

切除多核苷酸链中磷酸二酯键的的酶。

－内切酶：

断裂内部二酯键的酶。

内切酶作用产生核酸片段。

－外切酶：

切除末端核苷酸的酶。

外切酶从分子的末端切除，产生单核苷酸。

DNA聚合酶：

合成DNA的酶，完成DNA链的延伸。

DNA聚合酶只能以脱氧核苷三磷酸（dNTP）为底物。

（1）DNA聚合酶I

需要DNA模板才能发挥作用。

一旦与模板结合，不会马上脱离，而是继续作用，称为持续性，保证了复制过程的连续性。

A.5’3’方向的聚合活性。

B.5’3’外切酶活性：

C.3’5’校正外切酶活性：

用枯草杆菌蛋白酶处理DNA聚合酶I，可获得两个片段，大片段的分子质量约76kDa，保留聚合酶活性和3’5’外切核酸酶活性，又叫Klenow片段。

小片段具有5’3’外切核酸酶活性。

DNA聚合酶I不是大肠杆菌复制中主要的合成酶，而是在去除RNA引物、DNA损伤修复以及DNA体外标记中起重要作用。

DNA体外标记的方法

A.缺口平移法（Nicktranslation）（DNA聚合酶I）

B.末端标记法（Klenow片段）

C.随机引物法（Klenow片段）

（2DNA聚合酶II

具有5’3’方向的聚合酶活性和3’5’外切酶活性。

其生理功能还不清楚。

可能主要在DNA损伤修复中起作用

（3）DNA聚合酶III

a.全酶由7种不同的亚单位组成（。

每个亚单位有其特定的功能。

b.它既具有5’3’聚合酶活性，也有3’5’核酸外切酶活性。

c.该酶的活性较强，为DNA聚合酶I的15倍，DNA聚合酶II的300倍，是大肠杆菌DNA复制中起主导作用的酶。

d.复制时，两个PolyIII全酶组成二聚体，结合于复制叉上，同时进行前导链和后随链的合成。

（1）起始

（2）引物合成

a.DNA合成是从DNA引发酶合成的一段RNA引物开始，再由DNA聚合酶从引物3’端开始合成新链。

b.前导链合成前，DNA引发酶在起点合成RNA短链，经RNaseH去除短链中不必要部分。

这些短链把起点处DNA双链分开以便引发体与特定序列结合，进而合成RNA引物。

引发:

引发酶识别单链DNA上专一的DNA序列,合成RNA引物的过程。

引发体（Primosome）:

引发酶和另外6种蛋白质（DnaB,DnaC,n,n’,n’’和I）组装而成的多蛋白复合体。

引发体的作用：

排除SSB、识别起始点、合成RNA引物。

引发体常合成3-5个碱基的引物。

DnaA蛋白辨认起始点,形成起始复合物

DnaB蛋白解螺旋，消耗ATP

DnaC蛋白协助DnaB

DNA拓扑异构酶：

引入负超螺旋

SSB维持单链稳定

（3）延伸

a.前导链和后随链的引物均由DNA聚合酶III全酶来延伸。

b.PolyIII全酶是一个二聚体，一个单体用于先导链的合成，另一个用于后随链的合成，从而可以保证两条链以同样的速度合成。

c.二聚体的两个单体都含有聚合酶亚基、3’→5’校正作用的外切核酸酶亚基和将聚合酶结合于DNA的亚基。

d.每个单体中