微免实验.docx

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微免实验

人血涂片（Giemsa染色）

（红色箭头示白细胞，兰色箭头示红细胞）

E玫瑰花环实验

1、小吞噬细胞：

即中性粒细胞。

胞内富含溶酶体酶等杀菌物质，是血液中数量最多、具有吞噬功能的细胞。

可随血流迅速动员至感染部位，在机体抗感染中发挥重要作用。

吞噬化脓球菌等。

革兰染色呈红色。

圆，体积小于单核细胞。

核呈分叶状，2、3叶居多。

2、大吞噬细胞：

单核巨噬细胞。

包括大单核细胞和巨噬细胞。

吞噬病原体、凋亡的细胞和异物。

革兰染色呈蓝色。

圆，体积大，核偏大偏向一侧。

3、吞噬百分率：

计数100个中性粒细胞中具有吞噬作用的细胞数。

即为吞噬百分率。

吞噬指数：

观察100个中性粒细胞，计算被吞噬的细菌的总数，求平均每个中性粒细胞吞噬的细菌数即为吞噬指数。

4、淋巴细胞转化实验原理：

淋巴细胞在体外培养时，受到刺激物的刺激后可表现为体积增大、代谢物旺盛、蛋白质和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。

此现象称为淋巴细胞的转化现象。

分型：

小淋巴细胞、过渡型、淋巴母细胞、染色体型

意义：

淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的免疫水平，因此可作为测定机体细胞免疫状态的指标之一。

E花环形成实验原理：

T细胞表面有绵羊红细胞的受体，可在自然情况下于绵羊红细胞结合，形成E玫瑰花环。

结果判定：

淋巴细胞呈蓝紫色或淡蓝色，绵羊红细胞不着色，凡结合3个绵羊红细胞或以上者为E花环形成细胞即是阳行反应。

计数200个淋巴细胞，求出E花环形成率（%）。

意义：

根据花环形成的多少，可测知T细胞的数目，从而间接了解机体细胞免疫功能状态。

硫化氢试验

硫化氢遇铅盐或铁盐形成黑色硫化铅或硫化亚铁沉淀物。

吲哚（靛基质）试验

有些细菌分解色氨酸生成吲哚（靛基质），

与加入的二甲基氨基苯甲醛反应生成玫瑰吲哚

呈玫瑰红色为阳性；黄色为阴性。

尿素酶试验

有些细菌具有尿素酶，能分解尿素形成大量的氨，

使培养基PH上升，而变成碱性，使含有酚红指示剂的培

养基呈红色为阳性；不变色为阴性。

细菌的生化反应：

糖发酵（产气为阳性）吲哚试验（上层变红为阳性）

尿素试验（变红为阳性，指示剂是酚红）硫化氢（黑为阳性）

液体培养基

沉淀生长混浊生长表面生长

半固体培养基有鞭毛细菌混浊生长

无鞭毛细菌线状生长

衣氏放线菌的S-R转变

葡萄球菌G＋链球菌G＋

肺炎链球菌G＋淋病奈瑟氏菌G－

金黄色葡萄球菌普平板

金黄色葡萄球菌血平板

化脓性链球菌形态见实验书P29—30

金葡菌透明溶血环，甲型链球菌和肺炎链球菌草绿色溶血环，乙型透明溶血环

奈氏菌在巧克力琼脂平板上培养。

链球菌

G＋

营养要求较高，需补充血液、血清、葡萄糖等。

-在血清肉汤中易形成长链，管底呈絮状沉淀-在血琼脂平板上，不同菌株溶血不一

淋球菌G-成双排列

肥达试验

原理：

用已知的伤寒沙门菌菌体（O）抗原和鞭毛（H）抗原，以及引起副伤寒的甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌H抗原的诊断菌液与受检血清做试管或微孔板凝集实验，测定受检血清中有无相应抗体及其效价的试验。

结核杆菌抗酸染色法。

罗氏培养基呈菜花样菌落。

炭疽杆菌G＋

在普通琼脂培养基上形成灰白色粗糙型菌落，边缘不整齐，在低倍镜下观察边缘呈卷发状。

白喉杆菌：

G＋，但易于褪色，菌体细长微弯，一端或两端膨大呈棒状，排列不规则，常呈字母状或栅栏状。

Albert或Neisser染色

亚碲酸钾血琼脂平板上形成黑色菌落

Eleck平板白喉棒状杆菌毒力试验

破伤风：

G＋；芽胞位于菌体顶端，大于菌体，

使细菌呈鼓槌状；菌体细长，有周身鞭毛

破伤风杆菌为革兰阳性菌，有芽胞位于菌体顶端，芽胞大于菌体，呈鼓槌状。

破伤风杆菌使疱肉培养管中的疱肉变黑色，在培养基上形成不规则菌落，菌落周边疏松似羽毛状，呈迁徙状生长。

破伤风梭菌培养基

厌氧血平板上的羽毛状菌落庖肉培养基

产气荚膜梭菌：

两端几乎平切的G＋粗大杆菌；芽胞位于

次极端，呈椭圆形，不大于菌体；在体内有明

显的荚膜；无鞭毛。

产气荚膜梭菌为革兰阳性菌，芽胞位于次级端，大于菌体。

血平板呈靶样溶血（双层溶血环）。

疱肉培养基中肉渣变鲜红，产气。

有汹涌发酵现象和高层琼脂断裂现象。

血琼脂平板上，双层溶血环（θ、α毒素），“靶样溶血”

庖肉培养基，分解肉渣中的糖类，

产酸产气，肉渣淡红色

牛乳培养基：

可出现“汹涌发酵”

肉毒梭菌：

G＋；芽胞呈椭圆形，粗于菌体，位于次极

肉毒杆菌：

革兰阳性菌，芽胞大于菌体位于次级端，是菌体呈汤匙状或网球拍状。

端，使细胞呈汤匙状或网球拍状；有鞭毛，无荚膜。

血清学反应：

是指相应的抗原和抗体在体外进行的结合反应。

由于抗体主要存在于血清中，进行这类反应时一般都要用含有抗体的血清作为实验材料，所以把体外的抗原、抗体反应称为血清学反应。

这类反应是根据抗原、抗体具有高度特异性的原理来进行实验的，即用已知的一方来检测另一方的存在。

特点：

特异性、可逆性、可见性

影响因素：

浓度比例、电解质、温度、酸碱度。

分类：

凝集反应、沉淀反应、补体结合试验、中和反应、免疫标记技术。

（1）沉淀反应：

可溶性抗原（如血清、毒素、细菌浸出液等）与相应抗体在适量电解质的存在下，若二者相遇，比例适当，形成肉眼可见的沉淀物和沉淀线，称为沉淀反应。

类型和特点：

1、环状沉淀反应，形成白色沉淀环。

2、单向琼脂扩散试验，白色沉淀环的直径与抗原的浓度呈正比。

3、双向琼脂扩散试验，可出现一条或一条以上的沉淀线。

4、对流免疫电泳，沉淀线出现较快。

（2）凝集反应：

颗粒性抗原与相应的抗体结合，在有一定浓度的电解质环境中，抗原抗体凝集成大小不定的凝集块，这种现象叫做凝集反应。

种类：

直接凝集反应和间接凝集反应。

比较是：

前者抗原与抗体直接结合，后者是以与免于无关的微球载体为媒介。

（3）免疫标记技术：

是将已知抗体或抗原标记上易显示的物质，通过检测标记物来反应抗原抗体反应的情况，从而间接地测出被检抗原或抗体的存在与否或量的多少。

常用免疫标记物：

荧光素、酶、放射性同位素或电子致密物。

ELISA常用的方法与用途：

双抗体夹心法：

用已知抗体检测未知抗原。

间接法：

检测特异性抗体。

8、细菌的特殊结构：

芽孢，荚膜、鞭毛。

见于报告。

9、液体培养基：

浑浊生长，沉淀生长，表面生长。

半固体培养基：

线状生长，弥漫生长。

固体培养基：

菌落、菌苔。

10、变异：

菌落的变异（S—）R）鞭毛变异（H—）O）————迁徙生长

12、消毒器材：

高压蒸汽锅、干热灭菌器、紫外线、滤菌器、化学消毒剂

13、细菌的划线分离：

标本中含有多种细菌，要检查标本中是否存在某种病原菌，就必须先分离出单个菌落。

　菌落（colony）由单个细菌（或其他微生物）细胞或一堆同种细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度；形成肉眼可见有一定形态结构等特征的子细胞的群落

14、药物敏感试验：

结果判定：

以纸片周围抑菌圈直径的大小为标准。

大于15mm高度敏感，10—15mm中度敏感，7—9mm低度敏感，无抑菌圈为耐药。

15、肠道杆菌（SS平板、双糖培养基）

肠道杆菌：

革兰阴性无芽胞

SS平板：

（含有中性红的培养基），若该培养基加入的是非肠道致病菌（非致病菌能分解乳糖产酸），则菌落变红，反之，致病菌则菌落不变红。

双糖培养基：

分两层（两层中均有酚红指示剂），下层为含葡萄糖的半固体培养基，上层为含乳糖及硫酸亚铁的固体培养基。

若上下层均发酵，则为非肠道致病菌。

若只有下层发酵，则为可疑肠道致病菌。

16、

.肥达反应（原理、意义、凝集效价、结果判定）

原理：

用已知的伤寒杆菌H、O抗原和甲、乙型副伤寒杆菌的H抗原分别与患者血清作试管凝集试验，可测定患者血清中相应抗体的含量及其增减情况，用以诊断伤寒或副伤寒。

意义：

用以诊断伤寒或副伤寒

通过凝集效价来进行结果判定，当伤寒杆菌O抗体的凝集效价在1：

80以上和伤寒杆菌H抗体凝集效价在1：

160以上，才能判定为伤寒感染，若只符合其中的任意一个，都不能判定是否有伤寒感染。

而甲、乙型副伤寒H抗体凝集效价要在1：

80以上才有判定意义。

实验1

1、淋巴细胞转化实验+不同分裂过程的不同形态

【原理】：

1）淋巴细胞在体外培养时，受到刺激物的刺激后可表现为细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。

此现象称为淋巴细胞转化现象（简称淋转）。

2）淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。

植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）可选择性刺激T细胞增殖

脂多糖（LPS）可刺激B细胞增殖

2、E花环实验

【原理】：

T细胞表面具有能与绵羊红细胞（SRBC）表面糖肽结合的受体，称为E受体（CD2）。

当T细胞与SRBC混合后，SRBC便粘附于T细胞表面，呈现花环状。

通过花环形成检查T细胞的方法，称为E花环形成试验。

（根据花环形成的多少，可测知T细胞的数目，从而间接了解机体细胞免疫功能状态，判断疾病的预后，考核药物疗效等。

）

3、大吞噬现象（单核巨噬细胞吞噬鸡血球细胞）

4、小吞噬现象（中心粒细胞吞噬金黄色葡萄球菌）

实验2

1、血清学反应

1）沉淀反应：

可溶性抗原（如血清，毒素，细菌浸出液等）与相应抗体在适量电解质的存在下，若二者相遇，比例适当，形成肉眼可见的沉淀线或沉淀物，称为沉淀反应。

包括：

①环状沉淀反应

②单向琼脂扩散试验P7

【原理】将适量抗体与琼脂混匀，浇注成板，凝固后，在板上打孔，孔中加入（可溶性）抗原，抗原就会向孔的四周扩散，边扩散边与琼脂中的抗体结合。

一定时间后，在两者比例适当处形成白色沉淀环。

沉淀环的直径与抗原的浓度成正比。

③双向琼脂扩散试验

【原理】可溶性抗原（如蛋白质、多糖、脂多糖、病毒的可溶性抗原、结合蛋白等）与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散，二者相遇，在比例合适处形成白色沉淀。

④对流免疫电泳

【原理】在pH值8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白只带有微弱的负电荷，而且它分子又较大，所以泳动慢，受电渗作用的影响也大，往往不能抵抗电渗作用，故在电泳时，反而向负极倒退。

而一般抗原蛋白质常带较强的负电荷，分子又较小，所以泳动快，虽然由于电渗作用泳动速度减慢，但仍能向正极泳动。

如将抗原置阴极，抗体置阳极，电泳时，两种成分相对泳动，一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相遇，并在比例适当的地方形成肉眼可见的沉淀线。

⑤火箭电泳

2）凝集反应

①玻片凝集试验

【原理】颗粒性抗原与相应抗体的直接结合。

【现象】呈现均匀混浊现象为阴性

呈现乳白色凝集块者为阳性

实验3

1、补体结合试验（5个成分，2个系统）

【原理】利用抗原抗体复合物同补体结合，把含有已知浓度的补体反应液中的补体消耗掉使浓度减低的现象，以检出抗原或抗体的试验。

2、中和试验

3、免疫标记技术（荧光显微镜下观察肝细胞核）

1）免疫荧光技术

2）酶联免疫吸附试验

ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。

此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。

滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。

酶作用底物：

A液：

联二苯胺

B液：

过氧化氢

4、细菌学总论

1）细菌的基本形态：

球菌，杆菌，螺形菌

2）特殊结构：

荚膜，鞭毛，菌毛，芽孢

3）经典的革兰染色方法：

一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤。

（1）载玻片固定。

在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。

（2）草酸铵结晶紫染1分钟。

（3）自来水冲洗，去掉浮色。

（4）用碘-碘化钾溶液媒染1分钟，倾去多余溶液。

（5）用中性脱色剂如乙醇（95%）或丙酮酸脱色30秒，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。

（6）用蕃红染液或者沙黄复染30秒，革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌即被区别开。

实验4

1、细菌的生理

2、消毒、灭菌

1）紫外灯：

空气，物体表面

2）滤过器：

血清，不耐热药品

3）干烤法：

玻璃制皿

4）煮沸法：

针管

5）高压蒸汽灭菌法：

应用最广泛

三、4种生化反应

1）糖发酵试验：

根据发酵后的产酸产气来判断细菌是否分解了相应糖类。

2）吲哚试验：

红色为阳性

3）硫化氢试验：

阳性为黑色

4）尿素酶试验：

红色为阳性

4、合成代谢产物

1）色素

2）水溶性：

绿脓杆菌

3）脂溶性：

金黄色葡萄球菌

5、生长现象

1）固体培养基：

光滑，粗糙，粘液型

2）液体培养基：

沉淀，浑浊，表面生长

3）半固体培养基：

弥漫生长，线性生长

6、细菌的变异

1）H-O变异：

鞭毛的迁徙现象

2）S-R变异：

实验5

一、血平板培养特性

1）金黄色葡萄球菌：

完全透明溶血环

2）白色葡萄球菌：

3）甲型溶血性链球菌：

草绿色溶血环

4）乙型溶血性链球菌：

透明溶血环

5）Elek平板的原理：

沉淀反应

6）炭疽芽孢杆菌：

最大致病菌，卷发样菌落

7）结核分枝杆菌：

抗酸染色（3%的盐酸乙醇脱色）；罗氏培养基；形态

8）肠道杆菌：

形态

9）双糖铁培养基（SS）：

成份：

上层：

蛋白胨，氯化钠，乳糖，硫代硫酸钠，硫酸亚铁，琼脂，水

下层：

蛋白胨，氯化钠，葡萄糖，琼脂，水

克氏双糖铁斜面培养基反应试验

组成：

无糖培基＋1份葡萄糖＋10份乳糖＋铁盐＋酚红

营养底物底物底物指示剂

原理：

只分解葡萄糖产酸（葡萄糖少，产酸量少）上层氧化呈红色

下层缺氧不氧化呈黄色

分解葡萄糖＋乳糖产酸（乳糖多，产酸多）上下层均为黄色

产生H2S＋铁盐FeS培养基成黑色

10）破伤风梭菌

11）产气荚膜杆菌（形态，双溶血环；疱肉鲜红色；牛乳糖--汹涌发酵）

12）肉毒梭菌：

网球拍状

实验6

1）厚膜孢子

2）白假丝酵母菌

3）内基小体

4）大分生孢子

5）新生隐球菌（墨汁负染）