梯度洗脱高效液相色谱法快速测定13丙二醇发酵液中有机酸概要.docx

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梯度洗脱高效液相色谱法快速测定13丙二醇发酵液中有机酸概要

食品与发酵工业

FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES

梯度洗脱高效液相色谱法快速测定

1,3丙二醇发酵液中有机酸

*

王元好,董悦生,修志龙

（大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系,辽宁大连,116024

摘要提出了一种快速分析发酵液中9种有机酸的高效液相色谱方法。

该方法利用RSpakKC-811色谱柱（300mm8mmid,采用超纯水-4mmol/L高氯酸为流动相进行梯度洗脱。

流动相流速10mL/min,紫外检测波长210nm,柱温60时,能够快速、准确地分离测定发酵液中的丙酮酸、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸等8种有机酸,分析时间只需15min。

各种有机酸的线性相关系数R2!

09992,精密度的相对标准偏差为0.97%-2.72%,样品回收率为968%-1025%,具有较高的精密度和准确度,可以用于1,3丙二醇发酵液中有机酸的分析。

关键词高效液相色谱,梯度洗脱,有机酸,1,3丙二醇,发酵液

第一作者:

博士研究生（修志龙教授为通讯作者。

*

∀863#计划项目（2007AA02Z208和∀973#计划项目（2007CB714306

收稿日期:

2009-07-10,改回日期:

2009-11-16

代谢组学（metabonomics是近几年来的一门新兴学科,主要应用高效液相色谱、气相色谱质谱、液相色谱质谱以及核磁共振等现代分析仪器手段,定性定量的研究生物体内代谢产物及其随时间变化的

规律[1]

。

质谱及核磁共振等分析手段由于仪器价格昂贵、专业性强,限制了其普及应用。

因而开发常规仪器HPLC在代谢组学领域的应用具有重要意义。

微生物代谢过程中会生成有机酸,分析有机酸的种类、含量和变化趋势,对于了解不同条件下菌体内的代谢通量分布,发酵过程的优化控制具有指导意义。

有机酸分析的方法主要有:

气相色谱法、离子色谱法、酶法和液相色谱法。

气相色谱法需衍生步骤,

误差大[2];离子色谱法易受干扰,对样品要求高[3]

。

酶法分析价格昂贵,不能同时分离多种有机酸[4]

。

相比之下,HPLC法操作简便、准确度高,应用较

多

[5-8]

。

牟英

[9]

等对1,3-丙二醇（1,3PD厌氧

发酵过程中的6种有机酸进行了分析,但对微氧条件下三羧酸循环（TCA中的主要有机酸没有进行测定。

1,3PD是一种重要的化工原料。

目前,生物转化法生产1,3PD得到了国内外的普遍重视[10]

尤

其是微氧发酵工艺受到广泛关注

[11]

但微氧条件下

细胞代谢的途径,尤其是TCA循环是否完整,微氧与厌氧代谢的区别等问题始终没有明确的答案。

本实验以1,3PD发酵液为主要研究对象,选用H+

型强

离子交换树脂充填的ShodexRSpakKC-811色谱柱,建立了测定发酵液中多种有机酸的方法,结果稳定、可靠。

应用这一基于HPLC的代谢组学技术,也为其它微生物代谢物中的有机酸分析建立了检测技术平台。

1材料与方法

11试剂与仪器

试剂:

高氯酸（天津鑫源化工厂,氯仿（天津天河化学试剂厂,甲酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸（沈阳试剂三厂,延胡索酸（北京金龙化学试剂公司,丙酮酸、酮戊二酸、乳酸、苹果酸（美国Sigma公司,所用试剂均为分析纯。

实验用水为MilliQ超纯水。

仪器:

Waters600型高效液相色谱仪;Waters2487紫外检测器;ZW色谱柱恒温箱（大连依利特分析仪器有限公司;LG16W离心机（北京医用离心机厂。

12流动相的配制

用超纯水配制4mmol/L的高氯酸溶液,过045m滤膜进行真空抽滤即可用作流动相。

13有机酸标准混合液的配制及样品制备

称取一定量酮戊二酸、丙酮酸、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、乳酸、甲酸和乙酸,用上述流动相配制成混合标准溶液。

浓度为酮戊二酸02402g/L、丙酮酸01186g/L,柠檬酸12000g/L,苹果酸06022g/L,延胡索酸00061g/L,琥珀酸12014g/L,乳酸1863g/L,甲酸12024g/L,乙酸122272g/L。

采用逐级稀释法配成一系列浓度的混合标样。

分析与检测

本实验所用的1,3PD发酵液由克雷伯氏杆菌（DSM2026批式培养获得。

培养过程分别通入008vvm氮气和008vvm的空气保持厌氧和微氧条件。

取经离心（12000r/min,20min去除菌体的发酵液,加入等体积CHCl3离心除去蛋白,然后过022m的滤膜,即得待测样品。

14液相色谱条件

色谱分析柱ShodexRSpakKC-811300mm8mmid（ShowaDenkoKKJapan;紫外检测波长210nm;流动相流速10mL/min;柱温60;进样量20L。

外标法定量。

流动相A如12所述,B为超纯水,洗脱程序如下所示:

0min,25%A;0-75min,A由25%线性上升至75%;75-15min,75%A。

2结果与讨论

21分析条件的选择211分离条件的选择

采用文献

[12]

方法,利用4mmol/L的高氯酸溶液

作为流动相（pH=24,发现只用高氯酸做流动相时,有机酸标准混合液中的延胡索酸和琥珀酸无法做到基线分离。

为了分析代谢产物中的9种有机酸,本实验采用梯度洗脱的方法。

流动相流速为10mL/min,紫外检测波长为210nm,在0-75min内,使高氯酸的浓度从开始的1mmol/L上升到3mmol/L,然后保持此浓度,直至洗脱出所有待测组分。

这样,既能有效地分离出弱保留组分,又缩短了强保留组分的分析时间,能够满足快速、准确的分析要求。

212检测波长的选择

通过对9种有机酸标准品进行扫描,发现各种有机酸在210nm处均有最大吸收,因此选择210nm作为紫外检测波长。

213柱温的选择

有机酸在水溶液中存在离解平衡HA=H+

+

A-。

当温度升高时,会增加溶质的离解,从而促使保留时间的减少,利于缩短有机酸的分离时间。

本实验柱温为60,采用上述分离条件,色谱图见图1,标准品和发酵液样品中,9种有机酸均得到了较好的分离,图1（b中10号峰为未知峰,有待进一步确定。

1--酮戊二酸;2-丙酮酸;3-柠檬酸;4-苹果酸;5-延胡索酸;6-琥珀酸;7-乳酸;8-甲酸;9-乙酸;10-未知峰

图1有机酸标准混合液（a与发酵液的液（b相色谱图

22有机酸定量参数的确定

221线性回归分析与检出限

一系列（7个不同浓度的有机酸混合标样,在上述色谱条件下进样,以3倍信噪比（S/N计算检出限,线性回归处理峰面积为Y和有机酸含量为X,各有机酸的回归方程,相关系数,线性范围及检出限见表1,各有机酸的线性相关系数R2

!

09992。

表1回归分析和检出限

有机酸

回归方程

相关系数（R2线性范围/（mg∃L-1

检出限/（mg∃L-1

酮戊二酸Y=13394612X-3712609999

60-240250

丙酮酸Y=27903044X-15877609997297-11860018柠檬酸Y=1388525X+1969970999615-600085苹果酸Y=1379910X-95620999215-602060延胡索酸Y=150120203X+4124009999015-60004琥珀酸Y=806753X-296010999830-12010120乳酸Y=746408X+826309999465-1863185甲酸Y=117670X-887109999301-12024100乙酸

Y=728938X+177580

10000

3057-122270

190

222方法的精密度实验取同一发酵液样品重复进样5次,测定实验精密

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度,表2中列出了5次分析的浓度（mg/L、平均值

和相对标准偏差。

从表中可以看出,9种有机酸的相对标准偏差（RSD,%都小于3%,说明这种分析方法重现性好。

表2精密度实验测定结果（n=5

有机酸12345平均值RSD%酮戊二酸651464346456682567516596272丙酮酸457344784381442144354457147柠檬酸36.9236933605363236413653106苹果酸554355525799564656135630183延胡索酸452452441446448448097琥珀酸120256120333117552118413118573119025103乳酸275982697026774269232655426964144甲酸743.03766.87735.34742.18750.99747.68162乙酸

520895

517512

506375

508154

510492

512686

122

223方法的回收率测定

取同一发酵液样品2份,其中一份作本底,另一

份添加一定量的9种有机酸标准品溶液后测定各成分含量,每份样品进行3次平行测定,考察方法的回收率,其中酮戊二酸的加标回收率仅为43%（数据

未列出,表明此峰还混有其它未知杂质,采用本方法不能将其定量。

其它8种有机酸的回收率结果见

表3,回收率在968%-1025%,说明这种分析方法准确度高。

表3有机酸的回收率测定结果

有机酸

本底值/（mg∃L-1

加入量/（mg∃L-1

计算值/（mg∃L-1

测得量/（mg∃L-1

回收率/%

平均回收率/%

622

975丙酮酸

315

315

630

628994976617

95911517

1008柠檬酸

5755

5769

11524

11591101210121161510163666

1010苹果酸

1817

1814

3631

35769679773541950324

970延胡索酸

227

100

327

32497098332295076409

937琥珀酸

39379

39518

78897

764099399687633493520172

1008乳酸1007010017200872018110001007202671012甲酸

11227

11133

22360

2260010221025226961030226151023508702

1004乙酸

252862

254733

507595

504895990999509630

1004

231,3PD发酵液中有机酸HPLC检测分析对同等通气量条件下的厌氧和微氧发酵液进行了对比分析,图2表示各有机酸随发酵时间变化的浓度曲线。

由图2（a可以看出,厌氧条件下乙酸和乳酸高于微氧条件下的浓度,甲酸的浓度二者比较相近。

乙酸在厌氧条件下最高浓度达到44g/L,是微

分析与检测

氧条件下乙酸浓度的17倍。

由图2（b可知,TCA循环中主要有机酸包括柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、延胡索酸均在微氧条件下浓度较高,分别为厌氧条件下这4种有机酸浓度最大值的19、17、112和5倍。

发酵稳定期丙酮酸的浓度在2种通气条件下差别很大,微氧条件下丙酮酸有所积累,浓度是厌氧条件下的294倍。

这主要是由于在厌氧条件下,丙酮酸代谢主要进入乳酸和乙酸途径,进入TCA循环的量相应减少。

从甘油生产1,3PD的代谢途径[10]

可以看出,乙酸的产生伴随有ATP生成,这对1,3PD生成是有利的,但随着代谢的进行,乙酸的积累会抑制菌体的生长[13]

;乳酸在生成过程中消耗了NADH,不利于1,3PD生产。

而在微氧发酵的条件下,降低了乙酸的浓度,减轻了抑制作用;由于生成乳酸的量减少,消耗的NADH也减少,利于提高1,3PD产量。

微氧条件促使菌体代谢进入TCA循环,提供更多的ATP及NADH,对提高1,3PD的产量具有重要的意义。

图2厌氧与微氧批式发酵各有机酸浓度曲线图

（∀1#表示厌氧条件,∀2#表示微氧条件

3结论

采用ShodexRSpakKC811色谱柱,15min内可以把9种有机酸完全分离定量,有机酸的线性相关系数R!

09992,RSD为097%-272%,发酵液样品

中8种有机酸回收率在968%-1025%,多次实验结果证明,本方法具有灵敏度高、分析速度快、准确度

高和重现性好等优点,对于及时测定1,3PD发酵液

中有机酸积累情况,分析不同培养条件下的代谢通量分布,指导1,3PD发酵具有重要意义。

参

考

文

献

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RapidDeterminationofOrganicAcidsin1,3PropanediolFermentationBrothwithGradientElutionHighPerformance

LiquidChromatography

WangYuanhao,DongYuesheng,XiuZhilong

（DepartmentofBioscienceandBiotechnology,SchoolofEnvironmentalandBiologicalScienceandTechnology,DalianUniversityofTechnology,Dalian116024,China

ABSTRACTAhighperformanceliquidchromatographicmethodwassetuponacolumnofRSpakKC811（300mm

8mm.id.forrapidmeasuringtheconcentrationsofketoglutaricacid,pyruvicacid,citricacid,malicacid,fumaricacid,succinicacid,lacticacid,formicacidandaceticacid.Themobilephasewaswaterandperchloricacidsolution（4mmol/L,pH2.4ataflowrateof1mL/L.Theratioofperchloricacidtowaterwascontrolledbyagradientelutionprogram.Theassaywascarriedoutatacolumntemperatureof60anddetectionwavelengthof210nm.Themethodcouldeffectivelyseparateanddetect8organicacidsin1,3propanediolfermentationbrothsin15

min.Allthecorrelationcoefficients（R2

werenolessthan0.9992.Therecoveryandprecision（RSDwere96.8%-102.5%,0.97%-2.72%,respectivelyThispre