神经营养因子家族及其受体在重组人骨形态发生蛋白.docx

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神经营养因子家族及其受体在重组人骨形态发生蛋白

神经营养因子家族及其受体在重组人骨形态发生蛋白

【关键词】骨形态发生蛋白

摘要：

［目的］通过观察重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP2）诱导成骨进程中神经营养因子（NTFs）家族及受体的表达，探讨神经营养因子在BMP骨诱导中的作用。

［方式］成立小鼠右边股后部异位成骨模型，实验组植入rhBMP2胶原复合物，对照组仅植入相同体积的胶原海绵。

别离于术后7、14和21d取材，进行组织学、免疫组化及RTPCR检测。

［结果］组织学证明rhBMP2胶原复合物具有良好的骨诱导能力，而对照组未见成骨。

术后第7d，在大量软骨形成期NGF和TrkA阳性染色达到顶峰，成纤维细胞、成软骨细胞、软骨细胞、肥大软骨细胞和成骨细胞中均有阳性表达；BDNF在软骨细胞及软骨基质中有阳性染色，其受体TrkB仅在成软骨细胞和软骨细胞中有表达；NT3与NGF表达相似，其受体TrkC仅在成软骨细胞和软骨细胞中有阳性染色。

术后第14d，NGF和TrkA阳性表达局限于部份成骨细胞、骨样细胞和成骨样细胞；NT3在软骨细胞、成骨细胞中明显表达。

术后21d，只有少量成骨细胞、成骨样细胞中有NGF和TrkA的表达。

RTPCR检测结果显示，NTFsmRNA于术后第7d表达最高，与免疫组化中蛋白质的表达结果相一致。

［结论］NTFs及其受体在rhBMP2诱导成骨进程明显表达，提示NTFs可能通过直接和间接的方式协同BMP的诱导成骨进程。

关键词：

骨形态发生蛋白；骨诱导；神经营养因子；受体

Abstract：

［Objective］Toidentifytheexpressionofneurotrophicfactors（NTFs）andtheirhighaffinityreceptors（Trk）duringtheboneinductionbyrecombinedhumanbonemorphogeneticprotein2（rhBMP2）anddiscusspossiblerolesofNTFsontheosteoinductiveactivityofBMP［Method］Afteratotalof36ICRmiceweredividedintoexperimentalgroupandcontrolgroupatrandom,rhBMP2/collagenspongeandcollagenspongewereimplantedintotherightthighmusclepouchesoftwogroupsrespectivelyTissuesintheimplantedsitesoftwogroupswereremovedonthe7th,14thand21stdayafterimplantationHistological,immunohistochemicalandRTPCRanalyseswereperformedtodetectosteoinductiveeffectofrhBMP2andtheexpressionofNTFsandTrk［Result］RhBMP2/collagenspongedisplayedapotentabilityinducingboneformation,whiletheexpressionofNTFsandTrkwasobservedinthecourseofosteoinductionbyrhBMP2Especiallyonthe7thdayintheexperimentalgroup,NGFandTrkApositiveimmunostainingreachedthepeakinthestageofchondrogenesis,includingchondroblasts,chondrocytes,hypertrophicchondrocytesandosteoblasts,thendecreasedinthenumberofpositivecellsandtheintensityofimmunostainingonthe14thand21stdayBDNFwasonlyobservedinchondrocytesandcartilagematrix,andTrkBwasexpressedinchondroblastsandchondrocytesatthe7thdayafterimplantationExpressionofNT3wassimilartothatofNGF,whileTrkCwasexpressedinchondroblastsandchondrocytesonday7ExpressionlevelofthemRNAofNTFspeakedat7daysaftertheimplantation,thendecreased,whichwasnearlycoincidentwithimmunohistochemicalresults［Conclusion］ManydifferentkindsofcellsareinducedbyrhBMP2expressNTFsandTrk,whichsuggeststhatNTFsmayplayanimportantroleintheosteogenesisinitiatedbyBMPthroughdirectandindirectpathways

Keywords：

Bonemorphogeneticprotein;Osteoinduction;Neurotrophicfactors;Receptor

骨形态发生蛋白（bonemorphogeneticprotein，BMP）能诱导未分化间充质细胞不可逆地分化形成骨和软骨，在骨折愈合和骨修复进程中发挥着重要作用。

研究表明，在骨折愈合中，除BMP的诱导成骨作用外，尚有其他众多因子的表达和参与，如TGFβ、VEGF、IGFI和bFGF等，以增进新骨的形成和成熟。

神经营养因子（neurotrophicfactors，NTFs）家族在中枢和外周神经元的生长、发育、分化和维持正常存活中起着重要的作用〔1〕。

NTFs及其受体Trk在全身普遍散布，并在骨折愈合进程中有明显的表达〔2〕，外源性NGF具有增进骨折愈合的作用〔3〕。

可是在外源性BMP诱导成骨进程中是不是也有NTFs及Trk的表达尚未见报导。

本文对rhBMP2异位诱导成骨进程中NTFs、Trk的表达和NTFsmRNA的表达规律的研究进行报导。

1材料和方式

11动物和材料

雄性ICR小鼠36只，体重20~22g。

实验利用的rhBMP2胶原复合诱导材料（骨诱导，含rhBMP2025mg／片）和胶原海绵均由华东基因技术研究所提供。

NTFs及TrkA、TrkB、TrkC兔抗小鼠多克隆抗体及SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司，RTPCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。

12动物实验模型

将36只ICR小鼠随机分为实验组和对照组，每组18只。

氯胺酮腹腔注射麻醉，取rhBMP2复合材料1／2片（含0125mgrhBMP2）植入实验组小鼠右边股后部肌间隙中，对照组小鼠植入相同大小胶原海绵。

两组别离于术后第7、14和21d遍地死6只小鼠取材，别离进行组织学、免疫组织化学检测和NTFsmRNA的RTPCR检测。

13检测项目

131组织学观察

标本采用4％多聚甲醛固定24h，第14及21d所诱导骨组织需采用10％EDTA脱钙液脱钙，充分水洗，逐级脱水、浸蜡，常规石蜡包埋，3μm持续切片，行HE染色，光镜下观察。

132免疫组化染色（SABC法）

石蜡切片经脱蜡入水后，3％H2O2+甲醇灭活内源性过氧化氢酶，正常羊血清封锁，采用SABC法进行免疫组化染色。

抗原经微波热修复后，别离滴加NGF、BDNF、NT3和TrkA、TrkB、TrkC兔抗小鼠多克隆抗体（工作液浓度为1∶200），室温下孵育2h。

生物素化山羊抗兔IgG及SABC复合物各孵育30min，各步骤间均采用001mol/LPBS洗涤。

以二甲基联苯胺（DAB）显色，阳性显示为棕色，苏木素轻度复染。

133RTPCR法检测NTFsmRNA的表达

采用QiagenRNA试剂盒抽提实验组样本总RNA，采用Takara一步法RTPCR试剂盒扩增小鼠NGF、BDNF、NT3及内参照G3PDH的cDNA。

经15％琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶图像系统进行图像收集和分析。

按照小鼠上述cDNA序列设计引物：

NGF上游引物：

5′ATAAAGGTTTTGCCAAGGACG3′，下游引物：

5′GGGGTCTACAGTGATGTTGCG3′，扩增产物长度为281bp。

BDNF上游引物：

5′GCCCAACGAAGAAAACCATAA3′，下游引物:

5′TCGGCATTGCGAGTTCCAGT3′，扩增产物长度为394bp。

NT3上游引物：

5′AGTGACAGCACCCCTTTGGAG3′，下游引物：

5′CGGACATAGGTTTGCGAAGTT3′，扩增产物长度为359bp。

以G3PDH作为内参照，其上游引物：

5′AAGGCTGTGGGCAAGG3′，下游引物：

5′GGAGATTCAGTGTGGTGGG3′，扩增产物长度为469bp。

将NGF、BDNF、NT3与内参照G3PDH的cDNA条带的吸光度对比，进行不同时间段的比较。

2结果

21组织学观察

HE染色结果显示：

实验组术后第7d，大量软骨前体细胞、软骨细胞和肥大软骨细胞周围形成，伴有毛细血管和间充质细胞侵入软骨组织中，并可见由此分化而来的成骨细胞。

第14d，大量的骨样组织和编织骨形成小梁状骨结构，可见原始骨髓腔、骨髓细胞，成骨细胞排列于骨组织表面，残留的软骨细胞转变成骨样细胞。

第21d，小梁骨进一步成熟，可见有编织骨塑形为板层骨，骨陷窝清楚可见，骨髓腔内有大量骨髓细胞和脂肪滴（图1）。

对照组各时间段均未见有骨组织形成。

22免疫组化染色

NGF和TrkA免疫组化结果显示：

实验组术后第7d，成软骨细胞、软骨细胞、肥大软骨细胞、成骨细胞和周围的成纤维细胞中均有普遍的阳性染色，在部份软骨细胞外基质中也可见阳性染色。

第14d，在新生骨组织表脸部份成骨细胞、成骨样细胞和幼稚骨样细胞中有阳性染色，同时破骨细胞和骨髓组织中的巨噬细胞和多核巨细胞亦呈现阳性染色。

第21d，阳性细胞进一步减少，仅在少数骨表面成骨样细胞和破骨细胞中有阳性染色，骨髓中巨噬细胞和多核巨细胞阳性表达亦减少。

TrkA和NGF的表达大体相似（图2）。

BDNF和TrkB免疫组化结果显示：

实验组术后第7d，在软骨细胞和软骨基质中有明显的表达，尤其在软骨基质中表达最为显著；术后第14、21d均未见明显阳性染色。

TrkB仅于术后第7d于软骨细胞和成软骨细胞中有阳性表达，而术后14、21d未见表达（图3）。

NT3和TrkC免疫组化结果显示：

实验组术后第7d，于成软骨细胞、软骨细胞、肥大软骨细胞和成骨细胞中均见明显的阳性染色；术后14d，于软骨细胞和成骨细胞中可见表达，术后21d未见表达。

TrkC仅于术后第7d于成软骨细胞和软骨细胞中有表达，而术后14、21d均未见表达（图4）。

23NGF、BDNF、NT-3及G3PDHmRNA的检测结果

RTPCR结果显示：

实验组于术后第7d，NGF、BDNF及NT3mRNA均有明显的表达。

第14dNGF及NT3mRNA表达均有所减弱，而BDNF未见明显表达。

第21dNGFmRNA可见弱表达，而BDNF和NT3mRNA无明显表达（图5）。

3讨论

BMP被发现以来，人们已熟悉到这种唯一具有异位诱导成骨能力的骨生长因子在骨折愈合进程中起着关键作用。

大量实验和临床研究已证明天然和重组人BMP具有显著的诱导成骨、增进骨修复的作用。

本研究组织学发现，rhBMP2胶原复合材料具有良好的异位诱导成骨能力，植入后第7d即有大量软骨前体细胞、软骨细胞、成骨细胞和类骨组织的形成，周围有大量成纤维细胞增殖聚集，第14d可见小梁状骨和骨髓腔、骨髓组织的出现，第21d板层骨和成熟骨髓组织形成。

而对照组未见任何成骨现象。

但骨折愈合、骨再生是一个十分复杂的进程，不仅有BMP的参与，其它因子在不同时期不同环节中也发挥着重要的作用，如TGFβ、VEGF、IGFI和bFGF等。

已有研究表明，神经纤维在骨组织中的支配对骨细胞代谢相当重要。

在正常骨组织中存在普遍的交感神经和感觉神经支配〔4〕，尤其在生长板周围散布丰硕〔5〕。

这些肽能神经可通过神经末梢释放相应的神经肽，作用于靶细胞来影响骨细胞的代谢〔6〕。

在骨折愈合进程中，已有人证明新生骨痂中有大量新生神经纤维长入〔7〕，而且在失神经的情况下，骨折骨痂变大，而生物力学强度明显减弱〔8〕。

说明神经因素在骨再生、骨组织修复进程中也起着重要的作用。

Barde以为神经元通过神经纤维支配其靶组织，而靶组织细胞分泌神经营养因子以营养其支配神经元。

神经营养因子主要包括神经生长因子（nervegrowthfactor,NGF）、脑源性神经营养因子（brainderivedneurotrophicfactor,BDNF）和神经营养素3（neurotrophin3，NT3）等，它们在中枢和外周神经元的生长、发育、分化和维持正常存活中起重要作用，而且在全身具有普遍的散布〔1〕。

这些因子通过与其各自特异性的高亲和力受体（tyrosinekinase，Trk）TrkA、TrkB和TrkC结合，发挥其生理功能。

1990年Frenkel第一次报导鸡胚软骨细胞和骨细胞中有NGF的表达，以为骨痂内和其它未成熟骨组织的细胞可产生NGF，以诱导神经纤维长入胚胎骨组织和骨痂中〔9〕。

近来在正常骨组织中也发现有NGF、BDNF的表达，尤其在非负重骨中的含量高于负重骨，可能与神经支配的丰硕程度有关〔10、11〕。

文献证明在骨折愈合的进程中，新生骨组织中有NGF、BDNF和NT33种神经营养因子及其受体TrkA和TrkC的表达〔二、3〕，而且于骨折部位应用外源性NGF具有增进骨折愈合的作用〔4〕。

本研究第一次对rhBMP2诱导成骨进程中神经营养因子家族及其受体的表达进行免疫组织学观察。

术后第7d，可见普遍的NGF及TrkA阳性表达，第14、21d表达减弱。

BDNF及TrkB仅于第7d有明显的表达。

NT3于第7和14d有较为普遍的阳性染色；TrkC仅于术后第7d有表达。

通过RTPCR检测，发现NTFs的mRNA表达与免疫组化观察结果相一致。

由此可以证明，外源性rhBMP2诱导成骨进程中有NTFs及其受体的表达，尤其以第7d表达最为显著。

按照NTFs在全身的作用，可以推断，在成骨进程中所表达的NTFs可能起着诱导神经纤维长入并支配新生骨组织的作用，从而通过一种间接途径――神经系统来作用于再生骨组织；另一方面，其高亲和力受体在诱导成骨组织中的表达则表明NTFs可能通过自分泌或旁分泌的形式作用于局部细胞，从而直接影响骨再生进程。

总之，本研究证明了在rhBMP2骨诱导进程中NTFs及其受体的表达，提示NTFs可能在局部通过直接和（或）间接的方式影响BMP的诱导成骨进程，对其作用机理深切研究，将有助于增加对BMP骨诱导机理的熟悉，并为活性骨生物材料的研究打下必然的基础。

参考文献：

〔1〕LewinGR,Bardeoftheneurotrophins［J］.AnnuRevNeurosci,1996,19:

289317.

〔2〕GrillsBL,Schuijerslocalizationofnervegrowthfactorinfracturedandunfracturedratbone［J］.ActaOrthopStand,1998,69（4）:

415419.

〔3〕AsaumiK,NakanishiT,AsaharaH,etofneruotrophinsandtheirreceptors（TRK）duringfracturehealing［J］.Bone,2000,26（6）:

625633.

〔4〕GrillsBL,SchuijersJA,Wardapplicationofnervegrowthfactorimprovesfracturehealinginrats［J］.JOrthopRes,1997,15

（2）:

235242.

〔5〕IrieK,HaraIrieF,OzawaH,etgenerelatedpeptide（CGRP）containingnervefibersinbonetissueandtheirinvolvementinboneremodeling［J］.MicResTech,2002,58

（2）:

8590.

〔6〕ImaiS,Matsusueregulationofbonemetabolismandanabolism:

calcitoningenerelatedpeptide,substanceP,andtyrosinehydroxylasecontainingnervesandthebone［J］.MicResTech,2002,58

（2）:

6169.

〔7〕LiJ,AhmadT,SpeteaM,etreinnervationafterfracture:

astudyintherat［J］.JBoneMinerRes,2001,16（8）:

.

〔8〕MadsenJE,HukkanenM,AuneAK,ethealingandcallusinnervationafterperipheralnerveresectioninrats［J］.ClinOrthop,1998,351:

230240.

〔9〕FrenkelSR,GuerraLA,MitchellOG,etgrowthfactorinskeletaltissuesofembryonicchick［J］.CellTissueRes,1990,260（3）:

507511.

〔10〕YaoM,DooleyPC,SchuijersJA,etgrowthfactorandnorepinephrineconcentrationsinweightbearingandnonweightbearingbonesofeuthyroidandhyperthyroidrats［J］.JMuscaloskelNeuronInteract,2002,2（4）:

327334.

〔11〕YamashiroT,FukunagaT,YamashitaK,etandproteinexpressionofbrainderivedneurotrophicfactorandTrkBinboneandcartilage［J］.Bone,2001,28（4）:

404409.