多聚酶链式反应扩增DNA片段(经典版).ppt

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课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段,DNA指纹法在案件侦破中有重要作用，刑侦人员通过案发现场的血液、头发等样品中提取的DNA，与犯罪嫌疑人的DNA进行比较，就由可能为案件的侦破提供证据。

讨论：

1.犯罪嫌疑人留在现场的样品一般都是极少量的，刑侦人员要怎样才能得到足够量的DNA呢？

2.你还能说出DNA鉴定技术在其他方面的应用吗？

分子生物学研究中最强大的实验技术之一其本质是在体外模拟细胞内DNA分子复制的过程,美国科学家穆利斯（K.B.Mullis）发明了PCR技术1993年诺贝尔奖,

（一）DNA分子的结构,C、H、O、N、P,1.元素组成：

脱氧核苷酸,2.基本单位:

一、基础知识,脱氧核苷酸,脱氧核苷,磷酸,脱氧核糖,含氮碱基,嘌呤,嘧啶,腺嘌呤（A）,鸟嘌呤（G）,胞嘧啶（C）,胸腺嘧啶（T）,一个核苷酸上的磷酸基团上的“OH”和另一个核苷酸分子的第3位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3和5碳原子之间形成磷酸二酯键。

数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3，5-磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。

通常将DNA的羟基“OH”末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端,3.脱氧核苷酸链的形成,脱氧核苷酸链结构简图,DNA分子的平面结构,5端,3端,识别：

-OH端为3;磷酸基团的末端为5。

4.DNA分子的双螺旋结构,.DNA分子是由的（即一条链为35，另一条链为53）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则结构。

.与交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；排列在链的内侧。

.两条链上的碱基通过连结起来，形成碱基对。

碱基对的组成有特定的规律：

即腺嘌呤一定与配对，一定同胞嘧啶配对。

双螺旋,两条反向平行,脱氧核糖,磷酸,碱基,氢键,胸腺嘧啶,鸟嘌呤,

（1）DNA分子是由的（即一条链为35，另一条链为53）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则结构。

4.DNA双螺旋结构特点：

（2）与交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；排列在链的内侧。

（3）两条链上的碱基通过连结起来，形成碱基对。

碱基对的组成有特定的规律：

即腺嘌呤（A）一定与配对，鸟嘌呤（G）一定同配对。

两条反向平行,双螺旋,脱氧核糖,磷酸,碱基,氢键,胸腺嘧啶（T）,胞嘧啶（C）,

（二）DNA的复制：

1.概念：

由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程。

2.时期：

有丝分裂间期，减数第一次分裂前的间期。

3.场所：

细胞核（主要）、线粒体、叶绿体,4.基本条件：

酶:

解旋酶、DNA聚合酶能量:

ATP原料:

四种脱氧核苷酸模板:

DNA的两条链,5.复制特点：

a.边解旋边复制,b.半保留复制,6.遵循原则：

碱基互补配对原则,7.精确复制的原因,a.规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板,b.碱基互补配对保证了复制准确无误的进行,8.复制的意义:

DNA分子通过复制将遗传信息从亲代传给了后代，保持了遗传信息的连续性。

总结：

细胞内DNA复制的基本体系,打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸,解旋酶,DNA母链,4种脱氧核苷酸,DNA聚合酶,引物（RNA）,打开DNA双链,模板,合成子链的原料,催化子链合成,使DNA聚合酶能从引物3端开始连接脱氧核苷酸,思考：

体外扩增DNA时，如何提供与体内DNA复制相似条件？

变性（80100）,TaqDNA聚合酶（耐高温）,2030个核苷酸构成DNA或RNA,二、PCR（多聚酶链式反应）,

（一）PCR原理,DNA双链,变性（加热80-100）,复性（缓慢冷却）,DNA单链,变性的目的：

解开双链,复性的目的：

有利于引物1和引物2与两条单链的结合,PCR扩增仪,PCR扩增仪实际上就是一台能够自动调控温度的仪器，它可以根据DNA的热变性原理，通过自动改变温度，达到扩增DNA片段的目的。

时间（min）,温度,（）,适温延伸,高温变性,低温复性,重复13步30轮,DNA复制的方向：

DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸,变性复性（退火）延伸,

（二）PCR的反应过程：

二、PCR的反应过程,变性95oC,5,引物1,5,引物2,5,5,模板DNA,2530次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。

三、PCR实验操作,1、PCR仪,

（一）设备及用具,2、微量离心管,一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL,3、微量移液器,用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次,实质上是能够自动调控温度的仪器,4、离心机,一种通过高速转动产生离心现象，能将固体与液体分开的设备。

（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备）

（2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）（3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）（4）将微量离心管放在离心机上（离心）（5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应）,

（二）操作步骤：

四、结果分析与评价,DNA含量的测定：

稀释对照调零测定计算,50倍,蒸馏水做对照,波长260nm处读数,

（一）理论上DNA扩增数目的计算,四、课题成果评价,1、一条DNA，复制n次，DNA为2n,2、a条DNA，复制n次，DNA为ax2n,

（二）实验中DNA含量的测定,1、原理,可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关,光吸收,波长nm,260,240,220,280,0.1,0.2,2、过程,稀释,2LPCR反应液，加入98L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释,对照调零,以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零,取DNA稀释液100L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值,测定并计算,DNA含量（g/mL）50（260nm的读数）稀释倍数,50：

在厚度为1cm比色杯中的吸光值为1,DNA的含量为50g/mL,紫外分光光度计,比色杯,体内DNA复制与PCR的技术区别：

课堂小结,练习巩固：

1.做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是A.反复洗涤B.不怕外源DNA污染C.高压灭菌D.在-20储存,2.PCR技术最突出的优点是A.原理简单B.原料易获得C.TaqDNA聚合酶有耐热性D.快速、高效、灵活、易于操作,PCR循环第一步：

高温变性,