片剂脆碎度检查操作规程Word格式.docx

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项目

剂型

细菌数（个/g）

霉菌、酵母菌数（个/g）

大肠杆菌

霉菌、酵母菌数

（个/g）

片剂

1000

100

不得检出

500

80

胶囊剂

药用辅料

内包材料

注：

活螨不得检出。

四、药品微生物限度检查法总则

1、抽样

1.1供试品一般按批号随机抽样。

1.2抽样量一般检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。

1.3抽样时，凡发现有异常可疑的样品，应缺陷选有疑问的样品，但因机械损伤明显破裂的包装不得作为样品，凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、长霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需要再抽样检验。

2、供试品保存

供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，以防供试品中的污染菌因保藏条件所引起致死、损伤或繁殖。

2.2供试品在检验之前，应该保持原有包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。

3、检验

3.1供试品检验项目按《中国药典2000年版二部》微生物限度标准（附录XIJ）确定。

3.2检验的全过程，均应严格遵守无菌操作，严防再污染。

3.3除另有规定外，供试品制备成供试液后，应在均匀状态取样。

3.4制成供试液后，应该在60分钟内注皿操作完毕。

4、培养

4.1除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30~35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25~28℃，控制菌培养温度为36℃±

1℃。

5、复检

5.1菌数测定不合格者应复检，控制菌检查以一次检出为准，不再复试，但应保留检出菌株一个月备查。

5.2复试项目以下不合格项目为准，作单项复试。

5.3复试需另取同批号样品，测定2次。

5.4复试报告，以3次测定结果的算术平均值报告。

6、检验报告

6.1检验报告以1g、1ml或10cm2为单位。

6.2测定菌数报告，以每次测定结果全部平均值报告。

6.3控制菌按检验结果报告，如未检出控制菌时，报告为“按规定抽样检验结果卡检出×

×

菌”，如抽样中任意一样品检出控制菌时，报告为“按规定抽样，检出×

菌，不符合药品微生物限度标准”。

五、培养基及其制备方法

1、营养琼脂培状态养基

取营养琼脂培养基34g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，116℃高压灭菌20分钟。

2、玫瑰红钠琼脂培养基（虎红琼脂培养基）。

取玫瑰红钠琼脂培养基30g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，116℃高压灭菌20分钟。

3、胆盐乳糖培养基（BL）

十二、检查法：

1、检查前的准备：

1.1用具的洗涤与灭菌。

1.1.1试管：

使用过的试管经消毒后，将培养基倒出，用清洁液洗刷，用水冲洗4-5次，倒立，晾干备用。

灭菌前，用棉塞塞上管口，牛皮纸包紧，扎紧。

1.1.2吸管：

使用过的吸管用清洁液浸泡数分钟后，用水冲洗4-5次，晾干，备用。

灭菌前，在吸管上端距0.5cm处塞入约2cm左右的适当疏松棉花，用牛皮纸裹紧。

1.1.3研钵：

使用过的研钵用清洁液洗刷后，用水冲洗数次，晾干备用。

灭菌前，用牛皮纸将钵体和锤包裹。

1.1.4培养皿：

使用过的培养皿经消毒后，将培养基倒出，用清洁液洗刷，用水冲洗4-5次，倒立、晾干备用。

灭菌前，根据消毒器内经大小用牛皮纸包数个培养皿，扎紧。

1.1.5将上述包好的用具，放在121的高压蒸汽消毒器中，灭菌30min后，放入微生物限度检查室定点位置，备用。

1.2将所有已灭菌的培养皿、三角瓶、吸管（1ml、10ml）、稀释剂及供试品等移至无菌室内。

每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。

将全部包装（牛皮纸）去掉，编号。

1.3开启无菌室紫外线杀菌灯和空气过滤装置并使用其工作30min。

1.4操作人员用肥皂洗手，关闭紫外线杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，再用0.1%新洁尔灭或用75%乙醇棉球擦手，待干后，穿戴无菌衣、帽、口罩。

1.5操作前先用75%乙醇棉球擦手，并擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口周围，待干后将供试品瓶、盒、袋启封，启封后先检查瓶盖内侧及瓶口周围有无生霉、长螨的迹象，对肉眼可见疑似者，若经证实为生霉、长螨即可判定为不合格，无须继续检验。

2、细菌、霉菌、酵母菌计数。

2.1检验程序：

干燥

2.2操作步骤：

2.2.1供试液制备：

经阴性对照取样后，按各类制剂制备供试液的方法（见10供试液的制备）制备。

2.2.2稀释及取样

稀释：

取1ml吸管1支，吸取混匀的1:

10供试液（或原液，1:

20供试液）1ml，在离稀释剂液面上约1cm处，测管壁注入装有9ml的稀释剂的的试管中，混匀成1:

100（或1:

10，1:

200）的稀释液。

吸样：

用上述吸管分别取1:

20供试液）1ml，注入2~3个平皿中，以另一支1ml吸管，按上述操作下一级的稀释与吸取。

2.2.3注皿与干燥

事先将培养融化，置45℃水浴中，备用，当供试液及各稀释液均注入平皿后，以上述培养基倾注入平皿，每平皿约15ml，转动平皿，使样液与培养基混匀后，置水平台上待凝。

培养基凝固后，在净化条件下开盖倒置或换灭菌的陶瓦盖，使平板干燥，减少平板表面的水分，防止菌落蔓延生长，干燥时间一般在3h左右，干燥时间计入培养时限。

2.2.4培养：

将上述平板倒置于适宜温度的培养箱中，培养。

细菌于30~35℃培养48±

2小时，霉菌于25~28℃培养72±

2小时。

2.3菌落计数：

2.3.1用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用5-10倍放大镜检查，是否遗漏。

2.3.2若平板上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时辨，仍以1个或2个以上菌落计数。

2.3.3平板上有片状菌落或花斑样菌落蔓延生长以及平板受到污染的情况，该平板计数无效。

2.3.4当同一稀释级使用2个平板时，应采用2个平板菌落数的均值为平均平板菌落数，若2个平板菌落数相差在1倍以上时，该稀释级不宜采用，但不包括2个平板菌数均在15个以下的情况（15个以下两平板菌落数允许幅度0-4，1-7，2-9，4-12，5-14，6-15，7-17，8-18，9-19，10-20）。

2.3.5当同一稀释级使用3个平板时，应采用3个平板菌落数的均值为平均平板菌落数，若其中1个平板菌落数不能参与平均，但不包括平板菌落数均在10个以下的情况（10个以下平板最大与最小菌落数的允许幅度0-3，1-5，2-7，3-9，4-10，6-13，7-14）。

2.4菌数报告规则

细菌一般宜选取平均平板菌落数在30~300间的稀释级，作为菌数计算的依据，霉菌宜选取平均菌数在30~100之间的稀释级作为菌数计算的依据。

2.4.1若有1个稀释级的平均平板菌落数处在30~300（30~100）之间时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数，为报告菌数。

2.4.2若有2个稀释级的平均平板菌落数处在30~300（30~100）之间时，按下式计算两级比值。

高稀释级的平均平板菌落数×

稀释倍数

比值=———————————————————

低稀释级的平均平板菌落数×

当比值<

2时，以两级的菌落数均值为报告菌数；

当比值>

2时，以低稀释级平均平板菌落数乘以稀释倍数为报告菌数。

2.4.3若有3个稀释级的平均平板菌数处在30~300（30~100）之间时，采用后2个稀释级计算级间比值。

2.4.4若各稀释级平均平板菌数均在300以上，按最高的稀释级的平均平板菌落数乘以稀释倍数为报告菌数，或适当增中稀释数，重作测定后报告结果。

2.4.5若各稀释级的平均平板菌落数均不在30~300间，其中稀释级的平均平板菌落数大于300，相邻稀释的平均平板菌落数又小于30时，以最接近30或300的稀释级平均平板菌落数乘以稀释倍数为报告菌数。

2.4.6若各稀释平均平板菌落数均小于30时，按最低稀释级的平均板菌落数乘以稀释倍数为报告菌数，但若应用原液为供试液，当1：

10稀释级与原液的平均平板菌落数相等或大于时，应以培养基稀释法测定。

2.5培养基稀释法：

取供试液（原液或1:

10，1：

100供试液）3份，每份各1ml，分别注入5个平皿内（每皿积压0.2ml），每个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混的菌落数，共得3组数据，以3份供试液菌数的平均值乘以稀释倍数报告。

若各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1时，则报告菌数为小于10个。

2.6报告数书写（细菌数报告规则举例）

规则

原液

供试品稀释倍数

级间比值

菌落数

报告数书写

10-110-210-3

4.1

——

136516420

—

16400

16×

103或16000

4.2

276029546

1.6

37750

38×

103或38000

289027160

2.2

27100

27×

103或27000

4.3

23920235

1.7

27600

28×

103或28000

23619642

19600

20×

103或20000

4.4

不可计4650513

51300

51×

104或51000

4.5

不可计30512

30500

30×

103或30000

4.6

241912

240

24×

103或240

22.3

277—

270

103或270

5

0600

6

<

10

2.6.1菌落数在100个以内时，按实测数书写报告。

2.6.2菌落数大于100时，取二位有效数字，第三位数按有关数字处理规格处理，为简便计，也可用10的指数报告。

2.7不得按计数规则报告的情况

2.7.1空白对照平板有菌生长，表明培养基已补污染；

2.7.2各稀释级平板上生产的菌落数不符合10倍递增稀释规律，菌数显示混乱；

2.7.3同一稀释级的两个平板上生长的菌落数均在15个以上，但菌数相关一倍以上；

2.7.4菌落蔓延生覆盖整个平板无法计数；

出现以上情况，该次实验数据不得计数报告。

3、大肠杆菌检查法；

3.1检验程序（见附页）

3.2操作步骤

3.2.1取胆盐乳糖培养基3份，每份100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌50~100个作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。

培养18~24小时（必要可延至48小时）。

阴性对照应无菌生长。

取上述3份的培养物各0.2ml，分别接种至5mlMUG培养基管

内培养，分别于5小时与24小时时，取未接种的MUG培养基管作本底对照，将各管置365nm紫外光下观察。

阳性对照管呈现荧光，MUG阳性。

供试液的MUG管呈现荧光，MUG阳性；

无荧光，MUG阴性。

然后加数滴靛基质试液于MUG管内，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。

当阴性对呈阴性，阳性对照正常生长，供试液胆盐乳糖培养基培养液澄明，并证明无菌生产，判未检出大肠杆菌。

供试液MUG阳性，靛基质阳性，判检出在肠杆菌；

MUG阴性，靛基质阴性，判未检出大肠杆菌。

3.2.2如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，均应取从试液胆盐乳糖培养基培养物划线于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板，培养18~24小时，如上述供试液培养物的分离平板无菌落生长，判未检出大肠杆菌。

或有菌落生长，应挑选2~3可疑菌落作靛基质试验

（1）、甲基红试验（M）、乙酰甲基甲醇生成试（V-P）、枸橼酸盐利用试验（C）及革兰染色、镜检，按（12，2，3）规定判断结果。

3.2.3靛基质试验

（1），取可疑菌落或斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基中，培养24小时，沿管壁加入靛基质试液数滴，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。

3.2.4甲基红试验（M），取可疑菌数或斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄胨水培基中，培养48小时±

2小时，于管内加入甲基红指示液数滴，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。

3.2.5乙酰甲基甲醇生成试验（V-P），取可疑菌落或斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖礴水培养基中，培养48小时±

2小时，于每2ml培养液中加入

-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40%氢氧化钾溶液0.4ml，充分振摇，在4小时内出现红色为阳性，无红色反应为阴性。

3.2.6枸橼酸盐利用试验（C），取可疑菌落或斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基的斜面上，一般培养48~72小时，培养基斜面有菌落生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变为阴性。

3.2.7革兰氏染色法、镜检

试剂；

结晶紫染液：

取结晶紫1.0g溶于95%乙醇20ml，与1%草酸铵溶液80ml混匀，静置48h备用。

革兰氏碘液，先用3~5ml蒸馏水溶解2.0g碘化钾，再加入磺片1.0g，待全溶后，加蒸馏水稀释至300ml，备用。

沙黄（蕃红）染液：

将沙黄0.25g溶于95%乙醇10ml中，待全溶解后再加蒸馏水至100ml，即可。

染色法：

用接种环沾取无菌水，置于洁净载玻片上，再挑取少许菌苔，轻轻研开，使均匀。

涂片自然风干或微热烤干，而后通过火焰2~3次以固定涂片。

滴加结晶紫梁液，染色1分钟，水洗，滴加磺液媒染1分钟，水洗，甩干余水，滴加95%乙醇脱色，约20~30秒，水洗，吸干，滴加沙黄复染液，染1分钟，水洗，待干，镜检。

染色结果：

革兰氏阳性菌呈蓝紫色，阴性菌呈红色。

3.3结果判断见下表：

MUG-1

革兰氏镜检

麦康凯琼脂或EM

琼脂

IMVic

结果

++

检出大肠杆菌

--

未检出大肠杆菌

+-

无菌生长

G杆菌

有菌生长

-+--

（1）

-+

++--

（2）

3.3.1对与MUG-1反应不符合可疑菌株。

如表中

（1）出现++--或

（2）出现-+--，均应重新分离菌株，再作MUG-1和IMVic试验。

4、活螨检查法：

4.1设备和材料

显微镜、双筒实体显微镜

放大镜

解剖针、发丝针、小毛笔

载玻片、盖玻片

酒精灯

培养皿或小搪瓷盘（内衬黑色）

30%甘油水

4.2螨的形态特征

螨的体形微小，多在1mm以下，一般呈卵圆形或椭圆形、无头胸、腹界限。

幼螨足三对，若螨足四对，成螨足多数为四对。

足通常由六节组成。

口器向前突出，螯肢常呈螯钳状，由2-3节组成。

须肢节数因种类而异，

由1-2节到5节组成，一般呈爪或钳状，偶尔为长形。

有些种类在躯体前端或两侧有1-2对眼。

躯体两侧对称，表面有被有坚硬的几丁质的板，保护其内部器官和支持肌肉固定。

体表有刚毛，它的形状、数目及彼此长短比例和排列位置因种类而异。

螨类与蜘蛛、昆虫（书虱），外形比较的近似，因此，必须注意它们之间的主要区别，见下表：

螨与蜘蝗、昆虫主要形态鉴别

特征

成螨（如腐食醋螨）

蜘蛛

昆虫（如书虱）

分类

蛛形纲，蜱螨目

蛛形纲，蜘蛛目

昆虫纲，啮虫目

足

4对

3对

触角

无

1对

体段

头、胸、腥无界限

分头、胸部和腹部

分头、胸、腹三部

4.3检查方法：

4.3.1直检法：

取供试品先用肉眼观察，有无疑似活螨的白点或其它颜色的点状物，再用5-10倍放大镜或双筒实体显微镜检视，有螨者，用解剖针或发丝针或小毛笔挑取活螨放在滴一滴甘油水的载玻片上，置显微镜下观察。

4.3.2漂浮法：

将供试品放在盛大有饱和食盐水的扁形称量瓶或适宜的容器内，加饱和食盐水至容器的三分之二处，搅拌均匀，置10倍放大镜或双筒实体显微镜下检查，或继续加饱和食盐水至瓶口处（为防止盐水和样品溢出污染桌面，宜将上述容器放在装有适量甘油水的培养皿中），用洁净的载玻片盖在瓶口上，使玻片与液面接触，沾取液面上的漂浮物，置显微镜下检查。

4.3.3分离法：

也称烤螨法。

将供试品放在特制的分离器或附有孔径大小适宜的筛网的普法玻璃漏斗里，利用活螨避铫、怕热的习性，在漏斗的广口上面放一个60~100W的灯泡，距离药品约6cm处，照射1-2小时。

活螨可沿着漏斗内的底部细颈内壁向下爬，用小烧杯装半杯甘油水，放在漏斗的下口处，收集爬出来的活螨。

4.4活螨卵的检验方法：

螨卵极小，一般在0.1mm以正是，呈乳白色，椭圆形或卵圆形。

须用10-20倍放大镜或显微镜方可查见。

螨卵常见于活螨的周围，但在未检出活螨的样品中，亦有检出螨卵者。

一般在供试品中已经检出活螨的，不再进行螨卵的检查。

对可疑供试品，未检出活螨时，可注意检查活螨卵。

检验方法：

可采用检验活螨项下的直检法或漂浮法检查。

凡用上述由1-2节到5节组成，一般呈爪或钳状，偶尔为长形。

*MUG管紫外观察，显荧光为阳性，MUG+；

无荧光为阴性，MUG-。

*MUG管靛基质显色，MUG管内，液面呈玫瑰红为阳性，I+；

液面呈试剂本色为阴性，I-。

凡用上述

取胆盐乳糖培养基36g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，116℃高压灭菌20分钟。

4、麦康凯琼脂培养基（MacC）

取麦康凯琼脂培养基54g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，116℃高压灭菌20分钟。

5、磷酸盐葡萄胨水培养基15.8g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，116℃高压灭菌20分钟。

6、蛋白胨水培养基

取蛋白胨水培养基15g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，116℃高压灭菌20分钟。

7、枸橼酸盐培养基

取枸橼酸盐培养基22g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，116℃高压灭菌20分钟。

8、4-甲基伞形酮葡萄苷酸培养基（MUG）

取4-甲基伞形酮葡萄苷酸培养g，加1000ml蒸馏水，分装，115℃高压灭菌20分钟。

培养基（生物试剂）中国药品生物制品检定所生产。

六、试液

1、0.1%2，3，5-氯化三苯基四氮性（TTC）溶液。

1.1配制：

取2，3，5-氯化三苯基四氮唑0.1g溶于100ml蒸馏水，灭菌，备用。

1.2用途：

供制备培养基用。

2、无菌对氨基苯甲酸试液

2.1配制：

取对氨基苯甲酸0.1g，加入含10ml水的具塞试管中，121℃灭菌20分钟。

2.2用途：

供磺胺类药物检验用。

3、氢氧化钾试液

3.1配制：

取氢氧化钾40g，加水溶解使成100ml。

3.2用途：

供作V-P反应试剂。

4、

-萘酚乙醇溶液

4.1配制：

取

-萘酚6.0g，加无水乙醇溶解使成100ml。

4.2用途：

5、靛基质试液

七、稀释剂

1、0.9%无菌氯化钠溶液

取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，121℃灭菌20分钟。

2、无菌磷酸盐缓冲液（PH7.2）

取磷酸氢二钠25.8g与磷酸二氢钠4.4g，加水稀释至1000ml，121℃灭菌20分钟。

八、指示液

1、甲基红指示液

取甲基红0.1g，加95%乙醇30