一种生物素改性聚乳酸生物材料的制备与性能研究文档格式.docx

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为了赋予PLA比较好的抗非特异性蛋白的吸附性能,研究者们通常选择的PEG分子量都>

2000,甚至大于5000[6]。

由于PEG分子在体内不易降解[7],本实验选用分子量为500的PEG,通过接枝的方式接到PLA上,制备了PEG接枝PLA。

研究结果显示,PEG接枝PLA有很好的抗非特异性蛋白吸附性能[8]。

为赋予PLA主动靶向性,研究者们将可与靶器官特异性结合的抗体或者配体接到PLA上。

目前常用的将抗体或者配体接到聚合物上的方式有两种:

（1直接共价结合抗体或者配体[9,10]。

这种方式有可能会破坏聚合物的主链结构,使得聚合物更易被降解;

也有可能破坏抗体或配体的化学结构,使得抗体或配体的生物活性降低或丧失,从而降低或丧失聚合物的靶向性;

（2通过生物识别将抗体或配体结合到聚合物上[9]。

这种方式的反应条件温和,可很大程度地保留抗体或配体的生物活性。

目前最常用到的生物识别系统是生物素和亲和素。

天然存在的生物素为d型,其分子结构见图1。

它依靠分子中的咪唑酮环能与亲和素进行特异性结合,而噻吩环侧链末端的羧基则可共价结合其它基团或分子。

亲和素是一种糖蛋白质,分子量为60kD。

一个亲和素分子能够和4个生物素分子高特异性结合（Kd=10-15[11,12],同时抗体或者蛋白质通过与生物素分子上的羧基结合被生物素化后仍保留了与亲和素的高亲和性,而这种生物素化的抗体或蛋白质比较容易合成[13],且已有很多商业化的产品

。

图1　生物素结构图

Fig　1The　structure　of　biotin

　　本研究在实验室前期工作基础上,采用N-羟基琥珀酰亚胺活化酯法,将生物素共价接枝到PPLA中,以制备生物素化的PLA,进而可能利用生物素与亲和素的高亲和性,将生物素化的抗体或者配体链接到PLA上,制备生物活性的聚乳酸。

研究采用茚三酮显色、核磁共振、差示扫描量热、水接触角、荧光标记技术证明了生物素化聚乳酸的成功合成,并显示出良好的抗非特异性蛋白吸附和与亲和素结合的性能。

9

3

严　好等:

*基金项目:

国家自然科学基金资助项目（10972243

收到初稿日期:

2010-07-08收到修改稿日期:

2010-08-09　　　　通讯作者:

潘　君作者简介:

严　好　（1985-,男,重庆人,硕士,师承潘君研究员,从事生物材料研究。

2　实　验

2.1　实验试剂

聚乳酸（D,L-PLA,平均分子量:

5万,Mw/Mn=1.4:

实验室自制;

马来酸酐（MA,四氢呋喃（THF,过氧化二苯甲酰（BPO,二甲基亚砜,二甲基甲酰胺（DMF,乙醚,乙醇,水合茚三酮,异丙醇:

市售分析纯;

氨基封端聚乙二醇（PEG,分子量500,FITC-BSA:

Sigma公司;

生物素,FITC-亲和素,N,N-二环己基碳二亚胺（DCC,N-羟基琥珀酰亚胺（NHS:

Pierce公司;

双蒸水:

Millipore。

2.2　PPLA材料的制备

参照文献[14]制备材料PPLA,现简述如下。

2.2.1　马来酸酐改性聚乳酸（MPLA的制备

取PLA、MA、BPO按一定比例用THF溶解后混合均匀,迅速放真空干燥箱中室温真空干燥至溶剂彻底挥发;

把干燥好的材料放真空干燥箱中,100℃真空反应10h,然后迅速降至室温,将制备的MPLA取出备用。

2.2.2　PEG改性MPLA（PPLA的制备

将制备好的MPLA用THF溶解,按照其中MA的量取H2N-PEG-NH2置于圆底烧瓶中,搅拌条件下把MPLA溶液逐滴滴加到圆底烧瓶中,滴加完后油浴50~55℃保温2h。

反应产物通过THF-水体系纯化。

将产物在室温下真空干燥,得到产物PPLA。

2.3　生物素改性聚乳酸材料（BPLA的制备

由于PPLA中含有—COOH和—NH2两种活性基团,生物素中只含有一个—COOH活性基团,我们采用N-羟基琥珀酰亚胺活化酯法分两步将生物素与PPLA偶联:

首先将生物素,N-羟基琥珀酰亚胺与N,N-二环己基碳二亚胺混合,使之反应生成N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯（BNHS;

然后用BNHS与含氨基的PPLA反应制备出生物素改性的PPLA（BPLA,反应原理见图2

图2　BPLA反应原理图

Fig　2The　reaction　scheme　of　BPLA

　　反应先将生物素,NHS和DCC按物质的量之比为1∶3∶3溶于DMF,室温下磁力搅拌24h;

根据文献[15]所提供的提纯方法,离心除去沉淀（DCU;

将上清液用过量乙醚沉淀;

取出白色沉淀用异丙醇重结晶4次,真空干燥24h得到白色晶体BNHS。

然后按照PPLA中氨基与BNHS物质的量为1∶1的比例溶于DMF中,磁力搅拌下40℃反应72h,用DMF-水体系提纯,收集水面上的膜,真空干燥48h得到BPLA。

2.4　BPLA的表征与性能测试

2.4.1　茚三酮显色

称取一定量的PPLA和BPLA,分别加入适量混合溶剂（异丙醇和二甲亚砜体积比1∶1和茚三酮溶

00

42011年第3期（42卷

液（0.1mol/L的乙醇溶液,水浴85℃保温15min,用紫外/可见光分光光度计（PerkinElmer　Lambda　900检测在570nm的吸光值。

2.4.2　核磁共振

以氘代氯仿（CDCl3为溶剂,四甲基硅烷（TMS为内标,用核磁共振波谱仪（Bruker　AV　5000model测定PPLA,BPLA的1　H-NMR谱图。

2.4.3　差示扫描量热

用差示扫描量热计（Water　TA　Q200model测试PPLA、BPLA聚合物的热性能。

温度范围0~80℃,升温速率5℃/min,气氛为氩气。

2.4.4　静态水接触角

将PPLA和BPLA的乙酸乙酯溶液滴在盖玻片上,溶剂挥发48h成膜。

用接触角测量仪（台湾翰光高科技股份有限公司测定两种材料的静态水接触角。

2.4.5　非特异性吸附

为检测材料对蛋白的非特异性吸附作用,考虑到血清白蛋白为体内主要的非特异性蛋白,我们以牛血清白蛋白（BSA为模型蛋白,测试了材料对BSA的吸附,操作如下:

（1铺膜:

取8个直径为35mm的培养皿,其中4个每个加入6mg　PPLA,另外4个每个加入6mg　BPLA,然后分别加2mL乙酸乙酯溶解。

为了同时测试湿度对结果的影响,将含PPLA的2个培养皿和含BPLA的2个培养皿在室温干燥条件下挥发96h成膜,其余的置于室温（20℃潮湿条件（相对湿度100%下成膜。

（2孵育:

分别取浓度为0.02mg/mL的FITC-BSA溶液3mL置于8个培养皿中,在37℃条

件下静态孵育30min。

移走上清液,用双蒸水清洗掉未结合到材料上的FITC-BSA,直至清洗液中不含FITC-BSA（通过荧光分光光度计检测。

（3检测:

用3mL　THF将聚合物及表面的FITC-BSA溶解,用荧光分光光度计（PerkinElmer　LS-50B以490nm的光激发,测试样品在510nm处的发射光强度。

2.4.6　特异性吸附

为检测材料对生物素的配体亲和素的特异性吸附作用,我们测试了材料对亲和素的吸附。

操作步骤见2.4.5,只是将其中的FITC-BSA换成FITC-亲和素。

3实验结果

3.1　茚三酮显色结果及分析

由于氨基与茚三酮共热可生成蓝紫色的化合物,该化合物的颜色深浅与氨基的含量成正比,可根据570nm处的吸光值,测定氨基的含量。

本实验中,BP-LA的吸光值为0,而PPLA的吸光值为正,定性地说明了PPLA中的氨基全部与BNHS反应。

证明生物素已经接枝到PPLA链上。

3.2　核磁共振测定结果及分析

图3是核磁共振氢谱图。

a处是聚乳酸主链上的次甲基峰,b和c处是生物素分子上与NH相连的次甲基峰,f处是生物素分子上与S相连的次甲基峰,e,h是聚乙二醇分子上的亚甲基峰,i是主链上的甲基峰,g是生物素分子上与S相连的亚甲基峰,d是聚乙二醇上的次甲基峰。

通过峰的积分数据我们计算,生物素的接枝率大约为0.99%

图3　核磁共振氢谱图

Fig　3　1　H-NMR　Spectra　of　PPLA　and　BPLA

104

3.3　差示扫描量热结果与分析

图4是差示扫描量热图谱。

PPLA的玻璃化转变温度为25.3℃,而BPLA的玻璃化转变温度为30.7℃,生物素的引入增加了材料的刚性,故BPLA的玻璃化转变温度较PPLA高。

由于BPLA和PPLA都只有一个玻璃化转变温度,因此我们认为提纯方法是有效的,得到的是纯净的产物

图4　差示扫描量热图谱

Fig　

4DSC　Spectra　of　PPLA　and　BPLA3.4　水接触角结果分析

生物素的结构决定了它的亲水性比氨基差,如果在PPLA材料中引入了生物素,BPLA的疏水性将提高,

表现为水接触角的增大。

图5是水滴在PPLA表面和BPLA表面的照片

图5　接触角图像

5Contact　angel　spectrum　of　samples　　水在P

PLA表面迅速铺展开,接触角小到仪器的检测限外,BPLA表面的水形成小液珠,BPLA接触角

明显大于PPLA。

经测定,BPLA的平均接触角为

66°

肉眼观察PPLA的接触角不到10°

接触角的显著差别体现了两种材料表面性质的差异,进一步证明了本实验条件下,生物素已经被成功引入到PPLA中。

3.5　吸附结果与分析

根据所测数据和标准曲线计算得到BSA和亲和素在材料表面的结合量,见表1。

表1　BSA、

亲和素在材料表面的结合量Table　1The　amount　of　FITC-BSA　and　FITC-

avidina

bsorbed　on　PPLA　and

BPLA吸附量

（mg/m2

BSA

亲和素

BPLA　PPLA　BPLA　PPLA干燥1.54　3.08　1.25　0.742潮湿1.51　2.68　1.19　0.

668　　根据表1的结果,

可以看出,（1BPLA吸附BSA的量约是PPLA的1/2。

由于前期研究已经证明PP-

LA具有抗非特异性蛋白吸附能力[8]

因此,BPLA具有比PPLA更强的抗非特异性吸附能力;

（2BPLA吸

附亲和素的量是PPLA的约2倍,证明生物素分子已被引入材料中,且生物素可以与亲和素结合,整个实验

过程没有破坏生物素的活性;

（3对比BPLA和PPLA

对亲和素和BSA的吸附,说明了BPLA对亲和素具有

特异性的吸附能力,有望成为制备生物活性聚乳酸材料的前体,通过生物素-亲和素系统引入生物活性物质。

4　讨　论

本实验将生物素共价接枝到聚乳酸上,制备了

BPLA材料,与PPLA相比,

它具有更明显的抗非特异性吸附性能,

同时能与生物素的配体亲和素结合,显示出特异性的吸附性能。

本研究所描述的向PPLA中共价引入生物素的技术不同于已报道的表面化学改性技术。

材料的表面改性有时会随着材料的降解使得改性获得的性质随之消失[

14]

本研究的目的不仅是制备一种新型的含生物素的生物活性材料,更重要的是探索一种能够在降低非特异性蛋白吸附的条件下,向生物材料本体（而不仅是表面共价引入蛋白质、多肽等生物活性分子的制备技术。

这为根据需要向PPLA中引入其它蛋白质、多肽等药物,形成具有全面生理功能的药物缓释材料奠定了基础。

文献报道中采用偶联方式将生物素接到聚乳酸末端[9,16]

先将生物素接枝到PE

G的末端,然后通过PLA与生物素化的PEG反应使生物素接在材料主链

末端。

本实验中采用接枝的方法,将生物素共价接枝

到改性PLA的PEG侧链上。

通过优化反应条件,提高PEG的接枝率,从而可以提高生物素在PLA上的

接枝率,使一条主链不只接上一个生物素分子。

同时

也有报道先将亲和素接在聚合物上[4]

通过生物素-亲

2

042011年第3期（42

卷

和素系统,将生物素化的靶向识别分子接到材料上,赋予其主动靶向性。

本实验中选用将生物素接到材料上,是考虑到生物素比亲和素分子结构简单,并且活化之后能与氨基比较容易地反应,反应部位能很好地控制,且反应后能维持与亲和素的结合性能。

核磁共振和吸附实验的结果说明生物素的接枝率不高,这可能是PPLA链上的—COOH与—NH2形成内盐影响了生物素的接枝率,因此有待我们继续改进反应条件;

但我们应该注意到,生物体内的某些活性物质在量很少的时候,也能够通过生物的逐级放大过程而引起大的生物响应,因此从这方面考虑,也不需要很大的接枝率。

我们分别测试了不同湿度下蛋白的吸附。

发现:

（1

潮湿环境中成膜的吸附量略小于干燥环境下的。

这很可能是因为潮湿环境下成膜时亲水的PEG分子在材料表面的伸展程度更好。

（2BPLA和PPLA吸附BSA的量均大于吸附亲和素的量,

分析原因可能是由于实验条件的影响。

本实验使用的双蒸水室温时p

H值为6.5,FITC-亲和素的等电点为6,FITC-BSA的等电点为4.8。

在蒸馏水中,FITC-亲和素几乎不带电荷,而FITC-BSA则带有部分负电荷。

由于PP-LA中含有的氨基带部分正电荷,通过电荷相互作用,可以吸附更多的BSA,使得BSA吸附性能更好。

由于一个亲和素分子能够与4个生物素分子进行特异性的结合,生物素又是某些细胞中存在的物

质[17,18

],我们预计,BPLA通过与亲和素结合,

可与某些细胞进行特异性的结合,以期望到达特定的目标。

因

此,BPLA有望在靶向药物缓释系统领域得到应用。

5　结　论

通过N-羟基琥珀酰亚胺活化酯法,

将生物素接枝到PEG接枝聚乳酸（PPLA上,对PPLA进行本体改性。

茚三酮显色、核磁共振,差示扫描量热,静态水接

触角以及荧光蛋白吸附实验结果证明,与PPLA相比,

BPLA能抗非特异性蛋白吸附,且可与生物素的配体—亲和素结合。

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138.The　preparation　and　property　

of　a　poly（lactic　acidbiomaterial　modified　by　

biotinYAN　Hao,PAN　Jun,JIANG　Wei-min,ZHANG　Xiao-xi,WANG　Yuan-liang

（The　Key　Laboratory　of　Biorheology　Science　and　Technology　under　Ministry　

of　Education,Biomaterialsand　Inspired　Engineering　Center,College　of　Biological　Engineering,Chongqing　University,Chongqing　

400030,ChinaAbstract:

The　aim　of　this　research　is　to　o