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阿维菌素生产用抑菌剂的选择
阿维菌素生产用抑菌剂的选择
摘要
阿维菌素是一种高效、广谱的抗生素类杀虫杀螨剂。
它是由一组大环内酯类化合物组成，活性物质为AVERMECTIN，对螨类和昆虫具有胃毒和触杀作用。
在我国，上海农药研究所、北京农业大学等单位对阿维菌素进行了大量研究。
阿维菌素发酵要求纯种培养，不仅斜面、种子、培养基以及发酵罐、管道等须经严格消毒除去各种杂菌，而且通入的空气也需经过无菌处理；并需保持机械搅拌系统、发酵废气排放系统、补料和取样系统的无菌操作[3-4]。
只有这样，才能确保生产不受杂菌污染，从而保证生产菌的旺盛生长。
发酵染菌能给生产带来严重危害，轻者影响产量或产品质量，重者导致倒罐，甚至停产，解决杂菌污染是阿维菌素发酵工厂的一项重要工作内容。
为了研究采用哪种抑菌剂以抑制阿维菌素生产过程中的细菌污染。
因为其生产菌种为放线菌，所以我在牛肉膏蛋白胨培养基上培养金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，在高氏一号培养基上培养放线菌，对这三种菌进行研究实验。
将菌种制成适合浓度的菌液，分别加入抑制剂，并且分为20ppm，10ppm，5ppm三个浓度，涂布培养，与未加入抑菌剂的平板进行对比，选择出最适抑菌剂浓度和种类，保证其能够很好的抑制细菌，但对放线菌没有影响。
关键词：
阿维菌素，生产，抑菌剂，选择
Avermectinproductionwithbacteriostaticagentselection
Abstract
Abamectinisahighlyefficient,broad-spectrumantibioticinsecticideandacaricide.Itconsistsofasetofmacrolidecompounds,activematerialforAVERMECTIN,themitesandinsecthasthestomachtoxicityandcontacttoxicity.Inourcountry,ShanghaiPesticideResearchInstitute,BeijingKasetsartUniversityandotherunitsofavermectinwasstudied.
AvermectinFermentationforpureculture,notonlytheslope,seed,culturemediumandfermentationtank,pipingshallbedisinfectedstrictlytoremovevariousbacteria,andtheairisalsorequiredafterasepticprocessing;andtomaintainthemechanicalmixingsystem,exhaustsystem,fed-batchfermentationandsamplingsystemofasepticoperation[3-4].Onlyinthisway,inordertoensurethattheproductionisnotaffectedbythecontaminationofbacteria,thusensuringtheproductionofbacteriagrowingin.Fermentationbacteriacanbeharmfultotheproduction,influencingtheyieldorqualityoftheproduct,ortoinvertedcans,evenstopproduction,solvethebacteriapollutionofabamectinfermentedplantisanimportantcontentofthework.
Inordertostudytheantibacterialagenttoinhibitavermectinproductionduringbacterialpollution.Becauseofitsproductionstrainsofactinomycete,soIinbeefextractpeptonemediumofStaphylococcusaureusandEscherichiacoli,inGaoonthemediumofactinomycetes,ofthesethreekindsofbacteriawerestudiedexperiment.Willspawnismadesuitableforconcentrationofbacterialiquid,addinginhibitor,anddividedinto20ppm,10ppm,5ppmthreeconcentration,coatingculture,anddidnotjointhebacteriostaticagentplatecomparison,thechoiceofthemostsuitableantimicrobialagentconcentrationandtype,canensurethegoodbacteria,buthadnoeffectonactinomycetes.
Keywords:
abamectin,production,bacteriostaticagent,selection
目录
1绪论4
1.1阿维菌素4
1.1.1阿维菌素的概述4
1.1.2阿维菌素的有关理化性质5
1.2.3阿维菌素生产中解决杂菌污染的重要性5
1.2抑菌剂6
1．2.1抑菌剂种类6
1.3抑菌剂现状8
1.3.1防腐抑菌剂现状8
1.3.2农杆菌介导的植物转基因研究中抑菌剂的应用现状9
2实验材料和实验方法11
2.1实验材料11
2.1.1菌种11
2.1.2培养基11
2.1.3抑菌剂11
2.1.4实验器材：
11
2.2实验方法11
2.2.1培养基配制12
2.2.2灭菌12
2.2.3抑制剂的配制（此操作在无菌台上进行）12
2.2.4倒平板12
2.2.5悬液制备12
2.2.6抑菌剂的添加12
2.2.7涂布13
2.2.8菌种的培养13
2.2.9观察记录13
3实验结果及分析14
3.1试验结果14
3.1.1A8抑制剂的实验结果14
3.1.2A3抑制剂的实验结果14
3.2实验分析15
3.2.1A8抑制剂的实验分析15
3.2.2A3抑制剂的实验分析15
4结论17
参考文献18
致谢19
1绪论
1.1阿维菌素
1.1.1阿维菌素的概述
维菌素（Avermeetins，AVM），是1976年美国Merek公司的研究者从一株来源于日本的阿维菌素链霉菌的发酵液中发现的一簇结构相似的化合物。
经结构鉴定该化合物为16元环大环内酷类抗生素，是C5，C22-C23和C25三个位上结构不同的8种同系物，具体结构见图1和表1所示。
从图1和表1中可知:
在C5位上是甲氧基则称为A组分，如果是轻基则称为B组分;在C22与C23之间以双键连接则称为A1，或B1，以单键连接并在C23位含有一个轻基则称为A2或B2;在C25上连接的是叔T基时则分为Ala，A2a，Bla和B2a。
，是异丙基时则分为Alb，A2b，B1b和B2b。
在通常情况下，菌株的发酵产物中A1a，A2a，Bla和B2a组分之和的比例在80%以上，而A1b，A2b，B1b和B2b组分之和的比例在20%以下。
该簇化合物被统称为阿维菌素，或称阿弗菌素或埃维菌素。
1.1.2阿维菌素的有关理化性质
性状:
白色或黄色粉末;无味。
溶解性:
在乙酸乙醋、丙酮、氯仿中易溶;在甲醇、乙醇中略溶;在正己烷、石油醚中微溶;在水中几乎不溶。
熔点:
157-162℃
紫外吸收:
在243-247nm和236-240nm的波长处有最大吸收。
化学稳定性:
阿维菌素对酸和碱都较敏感，其化学稳定性情况如图2所示。
阿维菌素B1组分因光照或暴露在空气中均容易被降解。
1.2.3阿维菌素生产中解决杂菌污染的重要性
阿维菌素发酵要求纯种培养，不仅斜面、种子、培养基以及发酵罐、管道等须经严格消毒除去各种杂菌，而且通入的空气也需经过无菌处理；并需保持机械搅拌系统、发酵废气排放系统、补料和取样系统的无菌操作[3-4]。
只有这样，才能确保生产不受杂菌污染，从而保证生产菌的旺盛生长。
发酵染菌能给生产带来严重危害，轻者影响产量或产品质量，重者导致倒罐，甚至停产，解决杂菌污染是阿维菌素发酵工厂的一项重要工作内容。
1.2抑菌剂
抑菌剂就是能抑制细菌生长的物质。
抑菌剂可能无法杀死细菌，但它可以抑制细菌的生长，阻止细菌滋生过多、危害健康。
所有的精油，或多或少都有抑制细菌生长的能力。
有些精油只抑制某些特殊病菌的生长，而有些精油，抑制病菌的种类很多。
同时，重要非常少量的精油，就可以产生很好的抑菌效果，如丁香、薰衣草、迷迭香、鼠尾草和百里香等精油，抑菌的效果都很好。
1．2.1抑菌剂种类
（1）新型杀菌消毒剂森可洛
日本坷柯阿公司于1998年开发了一种粉状的含氯杀菌消毒剂，称森可洛。
每10L自来水溶人39森可洛，该杀菌液可在5秒内将0一巧7杀灭。
水中残氯量约80mg/kg，水的pH二5左右，氧化还原电位（ORP）在+500mV以上。
是一种具有强杀菌能力的弱酸性电解质水。
除0一157之外，亦能杀灭沙门氏菌等食物中毒菌。
可用于固体原料及半成品等。
与一般所用的次氯酸钠相比，含氯浓度低而杀菌效果强，杀菌后无残留性，对环境无副作用。
（2）乳铁蛋白肤
乳铁蛋白（Lactofe币n;LF）是存在于母乳、牛乳等中的一种多功能因子，可由干酪乳清或脱脂乳经分离提纯而得。
具有抗菌、提高免疫能力、抑制肿瘤、调节无机盐吸收等作用。
乳铁蛋白经胃蛋白酶等酸性蛋白酶酶解后，可获得乳铁蛋白肤（Lactofe州ncin;LFein），其抑菌能力（包括O一157）比乳铁蛋白高400倍，分子量约3100，是由25或26个氨基酸残基所组成的碱性多肤。
乳铁蛋白肤对O一157的最低抑制浓度为8一10林g/mL，用10协g/mL浓度的乳铁蛋白肤水溶液对平板计数为ro“/mL的O一157处理，经3小时后全部消灭。
从透过型电子显微境观察，经乳铁蛋白肤处理过的细胞形态无论是细胞膜或细胞质均有被消化的作用。
因此，其用于各种乳及乳制品之类，可预防致命O一157作祟。
最近（2000年6月）日本又暴发出儿童饮用日本雪印乳业公司所生产的脱脂乳后，因受到金黄色葡萄球菌所产生的A型肠毒素的危害而导致大量食物中毒，中毒人数已达1.4万人。
使日本全国8500家食品超市停售该公司乳制品，公司被迫于7月n日宣布所属21家工厂停业整顿。
可见其危害之广。
乳铁蛋白肤对金黄色葡萄球菌也有很好的抑菌作用，其最低有效浓度为3林g/。
L（或mg/L）。
乳铁蛋白和乳铁蛋白肤的最低抑菌浓度见表1。
（3）乙醇制剂
乙醇具有强烈的杀菌作用是早己知道的事实，日本自八十年开始即已广泛在鱼糜和肉糜类制品的真空斩拌过程中使用，此外作为食品加工机械和设备表面消毒的需用量也不少。
日本自19%年0-157等食物中毒事件暴发后，作为对策之一，食品用乙醇消毒制剂耗用量大幅度上升，19%年比1995年猛增24.5%，1997年增长7.2%。
增加乙醇用量可提高抑菌效果，但会有乙醇臭。
按日本消防法，若浓度大于60%，对保存场所和保存量等均有很大制约，因此一般所用的乙醇浓度均不超过60%。
但低浓度有挥发度低，与食品的接触时间长、食品表面干燥缓慢、易使设备生锈等缺点。
因此作为商品的乙醇消毒杀菌剂，也常与其他抑菌剂配合使用以减少用量。
如菜肴（半成品菜和熟菜）用的一般与中碳链脂肪酸甘油醋或聚赖氨酸合
（4）ASAP抑菌剂
近年来，随着消费者对妇科消毒产品品质要求的不断提高，各级卫生行政部门逐渐加强对妇科洗液的抽检监督。
然而，抽检结果往往不尽人意。
各种不合格产品的曝光报道，屡见报端。
行业的声誉也屡受影响，对当事企业而言，更是左右命运、关乎前途。
如今，A.SAP很受青睐。
全国各地众多知名企业，已使用A.SAP升级配方——确保抗菌效果。
A．SAP属全球首创天然有机抗菌除臭剂，以大豆萃取液为主成份。
它正广泛应用于妇科洗液、卫生巾、湿巾、漱口水、净水、生食蔬菜消毒液、洗手液、环境消毒等各领域。
藉由其安全、高效、性价比高等特点，正广受关注，逐步取代醋酸洗必泰等传统抗菌剂，在国际同类产品中属于领先水平。
（5）新型抑菌剂Tallofin（太乐芬）
工业循环水系统在水质处理过程中有机物与无机物的浓度逐渐升高,绝大部分有机物是可生物降解的,是微生物的营养源。
适宜的生存环境和充足的营养物使得微生物在循环水系统大量繁殖,形成生物粘泥。
生物粘泥会给系统运行造成许多障碍。
传统上用于工业循环水系统中的杀菌剂,其作用机理是通过直接破坏微生物生命过程和细胞核物质来控制微生物的繁殖。
这些杀菌剂在杀死细菌的同时对人体及环境也容易造成极大的危害。
而Tallofin（太乐芬） 通过与微生物之间的分散、包覆、剥离多重物理作用达到控制细菌的目的,并且对人体及环境不会造成危害。
因此,我们在第三循环水场进行了现场应用试验,通过对水质指标的跟踪分析,确定该药剂的使用效果及最佳投加方法。
（6）ECL-1501高效抑菌剂
高效抑菌剂是一种含有广谱杀菌剂的液态产品，适用于食品厂、啤酒厂巴氏线、巴氏杀菌及中水的微生物控制。
当用于整个水处理程序时，ECL-105高效抑菌剂既可用作系统运作过程中的动态杀菌和抑菌处理，又可用作系统关闭过程中的静态杀菌和抑菌处理。
安全，在使用效抑制各种容器中的微生物，可防止粘状污垢的形成。
使用简便，可作为动态杀菌。
它也适合静态杀菌。
产品优点相容性好，与其他清洗剂等相容。
降低杀菌剂清洗难度，节约大量人工。
高效长效，能有降低水耗。
减少杀菌剂换水频次，浓度下对各种材料的容器，工具等无腐蚀性。
1.3抑菌剂现状
1.3.1防腐抑菌剂现状
随着近代盒饭、半成品菜和熟菜的大量增加，传统的干制、盐渍、糖渍类产品大幅下降，而低糖、低盐、高水分柔软食品的大量开发，使防腐保鲜向较短时间（如3一7日而不是半年左右）方向发展，要求用量低，不影响原有风味，使用方便，不要求灭菌，只要求抑制微生物的活性静菌，使之不能繁殖而导致变质。
这种趋势在日本尤为明显，日本在超市、大卖场中冷藏出售的半成品菜、熟菜（非速冻蔬菜）、湿熟面条、拌凉皮等即食制品，1988年为24，563亿日元，至1995年上升至39，559亿日元。
如包括大型的小卖店等在内，1995年估计达到45，544亿日元。
已在食品加工业中占有重要地位。
在日本，凡进人超市、大卖场等大型商场的食品（包括半成品菜、熟菜等歹，其杂菌数不得过ro6个/roog。
因此，防腐保鲜剂的使用已成为不可或缺的保证。
为此，在日本属于天然防腐剂的聚赖氨酸（主要用于方便米饭、熟面条等高淀粉制品）、鱼精蛋白（主要用于奶油类制品如奶油糕点）、溶菌酶（以肉食制品为主）的用量大幅增长，发展很快。
由于苯甲酸钠、山梨酸钾等传统的化学合成防腐剂，在标签法中需加以标示，而消费者则更倾向于接受天然和安全性高的各种天然制剂，故各种.pH调节剂（利用偏酸性以抑菌）、甘氨酸制剂和中碳链脂肪酸甘油醋等也得以日益增长，以取代传统的防腐剂和抗氧化剂。
为提高效果、降低用量、确保安全起见，大多不单独使用，而是由生产添加剂的工厂进行适当复配（很多配合使用有增效效果）后销售，在日本将它们分成主剂和辅剂两大类。
1.3.2农杆菌介导的植物转基因研究中抑菌剂的应用现状
自1983年第一个转基因植物问世以来，植物转基因研究发展迅速，转基因作物已成为普及应用速度最快的农作物改良手段。
迄今为止，全世界已获得转基因植物近200种，其中大部分为农杆菌转化成功的的植物。
在农杆菌介导转化中，植物外植体与农杆菌共培养后需要使用抑菌剂脱菌，以抑制农杆菌的进一步生长，目前较常使用的抑菌剂是头抱菌素类和青霉素类抗生素。
但不同植物或同一种植物不同品种间甚至基因型间对抗生素的敏感性或毒害忍受程度也存在着较大差异。
有些植物材料对头抱菌素类和青霉素类极其敏感，既使低微浓度即会对外植体产生毒害作用，因此大环内醋类抗生素的作用也是不容忽视的。
总之，在进行农杆菌介导植物转基因之前，对受体材料进行抗生素敏感性测定是十分必要的。
研究确定适用抗生素种类及其浓度，以保证抑菌剂既能有效地清除农杆菌或抑制农杆菌的生长，又能使转化细胞不受或少受影响，从而获得较高的转化效率。
随着抗生素研究与应用的不断发展，新型抗生素不断问世，相信研究者们能发现更适用于农杆菌介导的植物转基因研究的抑菌剂类型。
2实验材料和实验方法
2.1实验材料
2.1.1菌种
大肠杆菌；金黄色葡萄球菌；放线菌
2.1.2培养基
牛肉膏蛋白胨培养基：
牛肉膏：
5g/L；蛋白胨：
10g/L；氯化钠：
5g/L；琼脂：
2%；蒸馏水；pH7.0-7.2
高氏一号培养基：
可溶性淀粉：
20g/L；KNO3：
1g/L；K2HPO4：
0.5g/LMgSO4·7H2O：
0.5g/L,
NaCl：
0.5g/L;FeSO4·7H2O:
0.01g/L琼脂:
2%；蒸馏水;pH7.2～7.4
2.1.3抑菌剂
A3;A8
2.1.4实验器材：
三角瓶，量筒（1000ml，100ml），烧杯（1L），移液枪（包含枪头），EP管，无菌水，蒸馏水，棕色瓶，试管（3支10ml蒸馏水，6支9.9ml蒸馏水），容量瓶（50ml），玻璃棒，棉塞，报纸，镊子，超净台，酒精灯，接种针，涂布器，培养皿，锥形瓶（一个瓶装200ml培养基）
2.2实验方法
2.2.1培养基配制
依据培养及配方配制即可。
2.2.2灭菌
把包好的仪器、培养基等放入灭菌锅内进行灭菌。
温度：
121℃时间：
20min
2.2.3抑制剂的配制（此操作在无菌台上进行）
A3浓溶液的配制
A3：
取A8药品0.4g,放在小烧杯中用无菌水溶解，搅拌待完全溶解后，用50ml的小容量瓶定容到50ml。
配制好以后放在棕色小瓶中待用。
用移液枪取0.1ml上述试剂,在用无菌水定容到10ml。
配置后浓度为40ppm。
A8浓溶液的配制
浓度6.4mg/ml配制方法取A8药品0.32g,放在小烧杯中用无菌水溶解，搅拌待完全溶解后，用50ml的小容量瓶定容到50ml。
配制好以后放在棕色小瓶中待用。
配置后浓度为64ppm。
2.2.4倒平板
在已经经过15min灭菌的超净台上，把热的培养基按要求在酒精火焰的保护下倒入灭好菌的平皿中，至凝固。
2.2.5悬液制备
将接种针在酒精火焰上灼烧，稍凉片刻。
用针在单菌落上取一环金黄色葡萄球菌，接种到装有10ml无菌水的试管中，震荡、摇匀。
用移液枪取0.1ml菌悬液置装有9.9ml无菌水的试管中，震荡、摇匀，得到浓度为10-2的菌悬液。
继续用移液枪从浓度为10-2的菌悬液中取0.1ml菌悬液置装有9.9ml无菌水的试管中，震荡、摇匀，得到浓度为10-4的菌悬液。
同样的方法得到浓度为10-4的大肠杆菌和浓度为100的放线菌的菌悬液。
2.2.6抑菌剂的添加
用移液枪取0.1ml浓度为10-4的金黄色葡萄球菌的菌液放入EP管中，加入0.1ml抑制剂，得到抑制剂浓度为20ppm的菌液;用移液枪取0.3ml浓度为10-4的金黄色葡萄球菌的菌液放入EP管中，加入0.1ml抑制剂，得到抑制剂浓度为10ppm的菌液;用移液枪取0.7ml浓度为10-4的金黄色葡萄球菌的菌液放入EP管中，加入0.1ml抑制剂，得到抑制剂浓度为,5ppm的菌液。
盖好EP管盖，等待十分钟。
同理对浓度为10-4的大肠杆菌添加抑制剂；浓度为100的放线菌添加抑制剂。
2.2.7涂布
用移液枪取0.1ml浓度为10-4的金黄色葡萄球菌的菌液滴入装有牛肉膏蛋白胨培养基的平皿中进行涂布。
用移液枪取0.1ml已经加入抑制剂十分钟的菌液进行涂布，并依次标号菌种名称、时间、制作人、所加抑制剂浓度。
同理将大肠杆菌的原液和加入抑制剂的菌液涂布到牛肉膏蛋白胨培养基的平皿中；将放线菌的原液和加入抑制剂的菌液涂布到高氏1号培养基的平皿中。
2.2.8菌种的培养
将涂布好的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌放入温度为37℃的培养箱中培养1-2天，放线菌放入温度为28℃的培养箱中培养2-4天。
2.2.9观察记录
对培养好的平板中的菌落进行计数。
3实验结果及分析
3.1试验结果
3.1.1A8抑制剂的实验结果
菌种名称
金黄色葡萄球菌
大肠杆菌
放线菌
-2
-4
加-2
加-4
-2
-4
加-2
加-4
-2
-4
加-2
加-4
11.22
206
98
129
51
176
41
11.23
92
57
50
50
219
57
315
24
0
0
11.25
175
64
245
135
120
19
296
16
3
0
3.1.2A3抑制剂的实验结果
菌种名称
金黄色葡萄球菌
大肠杆菌
放线菌
20
10
5
0
20
10
5
0
20
10
5
0
12.2
12
17
21
100
346
487
684
723
321
抑菌剂浓度减少菌落个数增多
12.5
0
0
0
21
58
189
317
432
44
186
412
536
12.7
0
0
0
213
0
0
0
608
32
142
220
168
12.9
60
191
217
528
78
100
176
139
55
107
144
150
12.13
35
66
57
167
328
456
536
648
77
372
502
616
12.15
12
14
22
25
177
207
280
322
100
121
160
202
3.2实验分析
3.2.1A8抑制剂的实验分析
金黄色葡萄球菌：
有图表可知，进行数据进行分析。
计算每个日期的抑制率，并计算平均数可知菌液浓度为10-2的抑制率平均数为58.48％。
菌液浓度为10-4的抑制率平均数为58.78％。
大肠杆菌：
有图表可知菌液浓度为10-2的实验结果无效，由剩下的数据进行分析。
计算每个日期的抑制率，并计算平均数可知菌液浓度为10-4的抑制率平均数为21.13％。
放线菌：
有图表可知菌液浓度为10-2的实验结果无效，但可以看出A8抑制剂对放线菌的抑制效果太强。
以至于加抑制剂的平皿几乎没有长出放线菌。
有上述数据分析：
A8抑制剂对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、放线
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