西南大学细胞工程重点.docx
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西南大学细胞工程重点
西南大学细胞工程重点
1.细胞工程：
是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的实验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法。
广义：
包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术。
狭义：
指细胞融合和细胞培养技术。
2.植物细胞工程在农业上的应用。
（1）在植物育种上的应用：
将常规植物育种技术与植物组织培养技术相结合，可以获得常规技术难以获得或无法获得的种质材料，缩短育种周期，提高育种效率。
①快速获得特殊倍性材料：
采用花药和花粉培养可以很快获得单倍体。
②克服远缘杂交不亲和：
采用原生质体融合技术可以获得亲缘关系相差很远的两亲本间的细胞杂种，不仅可以克服远缘杂交不亲和，而且有可能创造新物种。
③克服杂种胚早期夭折：
远缘杂种胚和某些果树的胚常常早期夭折，利用幼胚培养技术就可以加以克服。
④导入外源基因：
用细胞工程技术可以进行细胞器转移、基因转移、染色体转移等，从而实现外源基因的导入。
⑤突变体筛选：
在细胞培养和原生质体培养中，时常会发生各种自发的遗传突变，这是十分广泛的变异来源。
同时，在细胞和原生质体水平上的人工诱变，其变异频率将会大大提高，为突变体的筛选提供了更多的机会。
⑥种植资源保存：
采用组织培养技术保持植物种质，不仅可以节约人力、物力和耕地，同时亦可避免不可预测因素对种质资源造成的损失。
（2）种苗脱病毒与快速繁殖：
病毒在植物体内具有不均匀分布的特点，越靠近生长点，病毒含量越低，由此而发展了茎尖分生组织培养的脱毒技术。
（3）细胞培养产生有用次生产物：
植物几乎能生产人类所需的一切天然有机化合物，这些化合物的生物合成均是在细胞内进行的，因此，利用细胞的大规模培养，就有可能生产这些化合物。
第一章细胞全能性与形态发生
1.细胞全能性：
一个生活细胞所具有的产生完整生物个体的潜在能力。
2.细胞分化：
是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。
3.生长素感应：
指通过生长素受体和生长素分子相结合，使生长素受体被活化，从而植物细胞感受生长素的信号的过程。
4.极性：
是指植物的器官、组织，甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异，是植物细胞分化中的一个基本现象。
5.同源框基因：
是涉及到多细胞生物组织形态建立的一类同源异性基因，编码一保守的DNA结合同源异型域，这些同源异型域蛋白作为转录因子调控相关基因的表达。
6.体细胞胚：
指在离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。
7.激素对器官分化的调控。
（1）生长素（IAA）：
细胞分裂素（6-BA）决定根和芽的形成
比值高有利于根的形成比值低有利于芽的形成
（2）赤霉素（GA）：
有一定的调节作用，在适宜的浓度下有利于芽的伸长生长。
（3）植物多肽PSK：
不仅促进细胞分裂，而且参与器官分化调控
（4）激素需要以活化形式才能发挥作用。
细胞分裂素自由碱基形式是活化形式，而核苷形式是钝化形式。
生长素与氨基酸形成复合体是钝化形式，游离形式是活化形式。
植物激素对生长发育的调控是通过信号转导途径实现。
8.器官发生的基因调控。
器官发生是多种培养因子调控及表达的结果，与芽分生组织形成相关的基因已分离，并研究其调控作用。
同源框（homebox）基因是涉及到多细胞生物组织形态建立的一类同源异性基因，编码一保守的DNA结合同源异型域，这些同源异型域蛋白作为转录因子调控相关基因的表达。
例如，Kn1是从玉米中鉴定出来的第一个植物homebox基因，研究表明，它在植物发育过程中起到了重要的调节作用。
多细胞生物的器官分化伴随着细胞分裂和生长。
研究显示，某些细胞分裂周期基因可能参与了发育调控。
植物编码的细胞周期依赖性激酶的基因cdc2，在离体培养中对调节细胞进入分裂状态的过程起着关键性作用。
同时，cdc2基因对分生组织的形成和维持分生组织状态均有重要作用。
9.脱分化的调控机理。
细胞脱分化调控的实质是G0期细胞回复到分裂周期的调控过程。
细胞通常在G1期通过某些机制来决定是否进入S期。
真核生物细胞中存在有复杂的调节细胞周期的关键分子，cyclin（细胞周期蛋白）和CDK（周期蛋白依赖激酶）是两类主要的调控分子。
细胞周期运行的动力主要来自CDK，其活性则主要通过cyclin调节。
同时，为了保证细胞在分裂时各环节的正确性，CDK的活性还受到另外一类蛋白质的负向调节。
10.影响体细胞胚发生的因素。
（1）外源激素对体细胞胚发生的调控：
生长素对体细胞胚发生具有重要的调控作用，较高浓度先形成胚性细胞,再降低浓度形成早期胚胎。
细胞分裂素在促进细胞分裂、维持细胞活跃生长中具有重要的生理功能。
体细胞胚诱导培养中，细胞分裂素是完成体细胞胚发育的基本前提，其使用浓度一般低于生长素的使用浓度。
（2）培养基及培养条件的影响：
需一定浓度的还原态氮（含低浓度的NH4Cl,才能形成体细胞胚,但只在诱导阶段,愈伤组织期间影响不明显）。
培养基中的氮源会显著影响离体条件下的胚胎发生，研究表明，NH4+的作用关键在诱导培养阶段。
加入水解酪蛋白、活性炭等附加成分，或改善气体交换利于体细胞胚胎的发生。
（3）基因型对胚形成能力的影响：
体细胞胚形成受基因控制，形成数量也受基因调控。
同类植物不同基因型，在体细胞诱导难易、形成时间以及单个外植体产生体细胞胚的数量上存在明显差异。
11.体细胞胚发生过程中的特异蛋白质变化。
胚性愈伤组织的水溶性蛋白和盐溶性蛋白高于非胚性愈伤组织，而醇溶性蛋白低于非胚性愈伤组织。
这些特异性的蛋白可作为标记蛋白，用于鉴定愈伤组织或胚性细胞。
12.体细胞胚形成的基因表达调控
体细胞胚发生的基因表达调控不仅涉及胚胎发育本身的相关基因的有序表达，同时涉及对培养条件作出反应的相关基因表达。
已鉴定的基因表达时序分析，有三类基因：
一、涉及胚性细胞转变，体细胞胚的早期形态建立的基因
二、体细胞胚发生发育的整个过程始终表达的基因，有的甚至持续到植株再生
三、与体细胞胚发育过程有关的基因
第二章离体培养下的遗传与异
1.体细胞无性系：
由于离体培养条件下并没有发生雌雄配子受精，因此，把由任何形式的细胞培养所产生的植株称为体细胞无性系。
2.嵌合性：
是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞,它是组织培养中常见的现象。
3.无性系变异：
植物体细胞在离体条件下，以及在离体培养之前，会发生各种遗传和不遗传的变异，把遗传的变异称为无性系变异。
4.外遗传变异：
非遗传变异的一种情况，其不涉及基因结构的变化，而只是在基因表达水平上的变异，它是细胞内原有遗传潜力在离体培养中诱导的表达结果，如最常见的生长素自养型变异。
5.生理适应性变异：
非遗传变异的另一种情况是生理适应性变异，与后遗传变异不同，它们通常是在某种外界条件存在时才表现出变异。
在这种外界条件不存在时，变异也随之消失。
最典型的是培养基中硝酸盐的存在所引起的培养物硝酸还原酶活性增强，而硝酸盐不存在时，硝酸还原酶活性又恢复正常水平。
6.影响这些变异的因素及其怎样影响的？
1）供体植物：
供体植株原有的倍性水平在培养细胞多倍化过程中起着重要作用，单倍体组织的二倍化现象比二倍体组织的四倍化现象明显。
而且，体细胞变异与供体植物的遗传基础有关。
不同生理状态的组织细胞的变异有很大差异。
2）培养基及培养方式：
激素浓度及不同激素配比对染色体倍性变化有影响，不同的激素浓度可以有选择地诱导不同倍性的细胞的分裂。
培养基的物理状态以及培养类型也会引起细胞的变异，一般来讲，悬浮培养细胞比半固体培养容易产生变异。
原生质体培养变异大于细胞培养，细胞培养变异大于组织器官培养，性细胞变异大于体细胞。
3）继代培养次数：
继代次数越多，细胞非整倍体变异的频率越高
7.体细胞无性系变异的诱导与选择。
愈伤组织的变异比再生植株变异频率高，体细胞变异表现在再生植株的有性繁殖后代。
（1）考虑的问题:
其一，目标性状的可行性
其二，充分考虑试验植物的细胞培养技术水平
其三，适当的细胞类型是提高体细胞突变系筛选效率的重要条件，实践中原生质体（其培养技术有一定难度）和悬浮细胞系（其具有较大比例的单细胞或呈小细胞团，技术简单、易操作）常常被首先考虑为起始材料。
（2）离体培养细胞的自发变异
离体培养的变异比自然条件下变异频率高
长期营养繁殖的植物、培养时间较长或继代次数较多易出现较高变异率
原生质体、细胞和愈伤组织培养变异频率高于组织或器官培养
自发变异比较稳定，利于分离和选择
（3）离体培养细胞的诱变
物理诱变：
射线：
Ｘ射线、γ射线、快中子和紫外线等。
航天育种：
利用太空中的各种射线
化学诱变：
烷化剂、碱基类似物、移码诱变剂、抗菌素等，化学诱变通常产生碱基突变，也可能实现定点诱变。
复合因子诱变：
两种或两种以上诱变剂同时或交替使用、同一种诱变剂反复使用。
诱变剂剂量:
处理后培养细胞50%能够成活（半致死剂量）。
转座子插入诱变：
基因转化法，被转座子携带的基因遗传稳定并在连续5代中表达。
（4）体细胞无性系突变体的筛选
直接筛选法:
用一种含有特定物质的选择培养基上,只有突变细胞能生长，从而通过直接感官上的差异，来筛选突变体。
如抗除草剂、抗盐碱突变体的筛选。
间接筛选法:
缺乏直接选择表型指标或直接选择条件对细胞生长不利时,采用间接筛选法。
借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法
第三章植物细胞工程技术原理
1.培养基的配制及如何选择
培养基是组织培养中离体材料获取营养而赖以生存和发展的基质，是培养组织和细胞最重要的条件。
（1）植物培养基的组成：
1无机营养物（无机盐）2碳源和能源3维生素类（B族元素为主）4氨基酸及有机附加物5植物生长调节物质（生长素类，细胞分裂素）6琼脂7活性炭8最后调节PH值
不同植物材料常需要改变配方。
如维持生长和诱导细胞分裂分化的培养基配方就不同，因此配方的种类很多。
目前以MS培养基配方为最常用的一种基本培养基，其特点是有利于一般植物组织和细胞的快速生长。
（2）植物生长调节物质
生长素类
作用：
诱导愈伤组织、胚状体产生、生根、芽的产生等。
包括：
2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）NAAIAAIBA
使用量大小：
2，4-D>NAA>IBA>IAA（1-10mg/L）
2，4-D利于器官分化，抑制形态发生；低浓度利于胚状体分化。
NAA利于单子叶分化。
IBA诱导生根。
细胞分裂素类
作用：
促进细胞分裂，器官分化；延缓组织衰老。
增强蛋白质合成，抑制顶端优势，促进侧芽的生长及显著改变其它激素作用
包括：
KT,6-BA,ZT,2-IP（2-异戊烯腺嘌呤），TDZ（噻重氮苯基脲）
使用量大小：
TDZ>ZT>2-IP>6-BA>KT
琼脂、活性炭和PH值
琼脂作用：
使培养基在常温下凝固，作固体培养，支持培养物，也可吸附某些代谢有害物质。
用量多在0.6％－1.0％
活性炭作用：
利用其吸附能力，减少一些有害物质影响，防止组织褐化，对形态发生和器官形成有良好反应。
用量多在1－4％
（3）培养基的配制
1.水和药品：
最好用去矿质离子的蒸馏水，药品尽可能用分析纯或化学纯试剂，药品称量需仔细、准确。
2.母液配制与保存:
常用培养基母液配成10倍或100倍，甚至1000倍，用时按比例稀释。
配制成单一化合物母液
方法
配成几种不同化合物混合母液
3.大量、微量元素配制注意事项
⏹各化合物须充分溶解才能混合
⏹混合时，将Ca2+与SO42-、HPO42-错开，避免产生沉淀
⏹混合时要慢慢加入溶液，边搅拌边混合，配好后溶液澄清才好。
⏹Fe盐，植物生长调节剂须单独配成母液
⏹IAA、IBA、GA3溶于少量酒精；NAA溶于热水或少量酒精；2，4-D溶于NaOH；BA、KT溶于HCl;玉米素溶于少量酒精
4.配制程序
5.常用植物培养基的配方及特点
MS培养基，特点：
硝酸盐、钾和铵含量比其它培养基高，无机盐养分数量和比例较合适。
适用于：
愈伤组织、细胞、胚、茎尖、茎段、叶、花及花药等培养和形态建成、
LS培养基，特点：
大量元素、微量元素同MS,有机成分不含甘氨酸、VB6和烟酸
ER培养基，特点：
与MS相比，降低了铵的含量，提高了P的含量，微量元素中的锌盐改用鳌合锌适用于：
豆科作物培养
B5培养基，特点：
含较低铵态氮，较高VB1
适用于：
双子叶植物特别是木本植物
N6培养基，特点：
KNO3和（NH4）2SO4含量高且不含钼，适用于：
小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养和组织培养
White培养基，特点：
无机盐成分简单且含量低（仅及MS的1/3）。
适用于：
生根培养、胚胎培养和一般组织培养
改良VW培养基，特点：
总的离子强度稍低，磷以磷酸钙形式供给，须用HCl溶解后加入混合液中，适用于：
气生兰的组织培养
马铃薯简化培养基，特点：
铁盐与MS相同，绵白糖代替蔗糖，食用淀粉做凝固剂，马铃薯做培养基。
适用于：
小麦花药培养，其它组织培养
（4）培养基的选择
单因子试验
多因子实验：
完全实验法、正交实验法
逐步添加和逐步排除的试验方法
广谱实验法
2.外植体接种培养的条件控制。
（条件变化对外植体的影响）
（1）光照：
培养初期，一般只需散射光或弱光照，因为光照过强往往抑制培养初期外植体的增值。
当外植体细胞启动分裂后或进入分化培养阶段，则需根据植物类型增强光照。
实验证明，愈伤组织只有在光照条件下才能变绿并进而分化器官。
光质对细胞分裂的影响似乎受到一些培养基成分的控制。
（2）温度：
温度不仅影响细胞的增值与分化，同时在一些特殊培养中常常还需要采用不同的温度处理。
一般范围在20-30℃，低于15℃或高于35℃都会影响生长。
在适宜的温度下有利于细胞分裂，既可提高分裂速度；适当提高温度，有利于细胞伸长。
一定范围内降低温度，细胞分裂和生长速度减缓，细胞质量增加。
但温度过低，则会生长停止，或导致愈伤组织褐化。
在忍耐的温度范围内，高温比低温的影响严重得多。
（3）培养基pH：
一般植物组织生长的最适宜pH为5～6．5。
在培养过程中pH可发生变化，加进磷酸氢盐或二氢盐，可起稳定作用。
pH在4.0以下或7.0以上培养物就不能正常生长。
大多数植物以调整为5.8比较适中，并且要求pH有较好的稳定性。
（4）气体调节：
培养室的透气程度和培养容器的封闭程度均会影响气体的交换，进而影响培养物的生长。
培养物生长需要氧气。
第四章植物组织和器官培养
1.植物脱毒原理及脱毒过程中的变化（如褐变、玻璃化）
植物脱毒：
就是利用植物组织培养技术，脱除植物细胞中侵染的病毒，生产健康的繁殖材料。
原理：
病毒在植株中的分布是不均匀的，越靠近根尖区病毒含量越低，在根尖的顶端（生长点）不含病毒。
学者们对病毒分布不均匀这现象提出了以下假说：
能量竞争：
细胞分裂和病毒复制对能量进行竞争；传导抑制：
病毒传导通过维管束传播，分生组织中维管束和胞间连丝不健全；激素抑制：
高浓度生长素和细胞分裂素（分生组织中水平高）抑制病毒活性；酶缺乏：
分生组织中缺乏病毒复制所需的酶系统；抑制因子：
分生组织中含病毒抑制因子
玻璃化：
指组织培养过程中的特有的一种生理失调或生理病变，试管苗呈半透明状，外观形态异常的现象。
褐化：
植物被切开的伤口，由于其应激性，会分泌大量的次生代谢产物，这些物质为导致其褐化。
3.花药培养中，花粉细胞发育适宜的培养时期是单核中晚期到双核早期。
花粉和小孢子培养的取材适宜时期大多为四分体到单核早期的材料。
4.单倍体的应用。
迅速获得纯合型材料：
代替自交系，可用于杂种优势的利用；获得育种的中间材料：
各种显、隐性状得以表达；突变体选育：
一旦突变便可在当代花粉上表现出来
；体细胞融合：
容易融合成正常二倍体，可形成新的植物育种途径和方法；获得染色体异附加系和代换系：
还可以得到多倍体、非整倍体、混倍体和染色体结构变异的植株，可以选育优良性状和具独特遗传特性的新类型；遗传研究：
DH（双单倍体）群体是理想的作图群体，在单倍体水平上对于基因剂量效应的研究更加方便；遗传工程受体：
转基因技术中，作为转化受体，经加倍后两条染色体上均有目的基因，大大提高转化效率
5.胚胎培养：
植物胚胎培养是指对植物的胚（种胚）及胚器官（如子房，胚珠）进行人工离体无菌培养，使其发育成幼苗的技术。
6.胚培养的实际应用：
远缘杂交中克服杂种不育；种子发育不全的植物通过胚胎培养得到大量后代；克服种子休眠，缩短育种周期；柑橘类合子胚培养；种子生活力测定；种质的超低温保存；理论研究
意义：
（1）克服杂交育种中杂种胚的早期夭折
（2）克服珠心胚干扰，提高育种效率（3）理论研究领域的应用
7.胚乳培养的应用
（1）胚乳培养可得到三倍体植株，产生无籽果实。
或加倍形成六倍体植株进行育种。
（2）胚乳培养可得到倍性不同的愈伤组织，可分离和筛选各种类型的非整倍体植株。
第五章植物细胞培养及次生代谢产物生产
1.悬浮培养：
是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。
2.细胞同步化：
指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。
3.单细胞培养的方法：
（1）细胞平板培养：
指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。
（2）看护培养：
方法：
固体培养基上置入一块活跃生长的愈伤组织，再在愈伤组织上放一小片滤纸，待滤纸湿润后，将细胞接种于滤纸上。
当培养细胞长出微小细胞团后，将其直接转至琼脂培养基上让其迅速生长。
（3）微室培养：
方法：
先在载玻片左右两侧各加一滴石蜡油，将盖玻片置于其上作为微室的支柱，再在两端各加一滴石蜡油即构成完整微室。
在微室中间接种一滴含单细胞的培养基，然后将第三张盖玻片架在微室两支柱间。
4.规模培养中的生物反应器类型。
（看PPT）
5.规模培养中有关的工程技术问题。
（PPT）
6.次生代谢产物：
是一类小分子有机化合物，由次生代谢产生的一类细胞生命活动或植物生长发育正常运行的非必需的小分子有机化合物，其分布具有种、属、器官、组织，以及发育阶段的特异性。
第六章原生质体培养
1.植物原生质体：
指除去了细胞壁后的裸露的球形细胞。
2.原生质体纯化：
（1）沉降法：
在酶解处理中用相对分子质量较小的甘露醇作渗透压调节剂时，将收集的滤纸低速离心，使原生质体沉降于管底。
（2）漂浮法：
在酶解处理中用相对分子质量较大的蔗糖作渗透压调节剂时，离心后，原生质体漂浮于溶液的表面。
（3）梯度离心法：
利用比重不同的溶液，经离心后使完整无损的原生质体处在两液相的界面之间，这方法可获得更为纯净的原生质体。
3.原生质体的活力测定：
（1）目测法：
在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。
（2）荧光素双醋酸酯（FDA）染色法：
是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶分解成有荧光的荧光素，由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。
紫外光下产生绿色荧光。
（3）酚藏红花染色法：
无活力的被染成红色，有活力的则不能染色。
（4）荧光增白剂（CFW）染色法：
可通过检测细胞壁的形成而确定原生质体的活力。
在培养过程中，有活力的原生质体随着细胞壁的再生产生绿色荧光。
（5）伊凡蓝法：
伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。
因此，凡不能染色的都为有活力的。
4.植板密度：
一般为104/ml-105/ml,饲养层培养法密度可降低
5.性细胞原生质体培养（用了哪些性细胞原生质体）
花粉原生质体和配子原生质体
花粉原生质体具有单倍体和原生质体的双重优点，可有孢子体发育途径和配子体发育途径。
孢子体发育途径：
离体培养下，偏离体内原有的发育途径，转向脱分化。
首先启动细胞分裂，形成多细胞团，进而再生植株。
这一途径与花药和花粉培养中的雄核发育的途径相似，也是体细胞原生质体培养中常见的途径。
一般处于单核中后期和双核早期的幼嫩花粉原生质体具有孢子体发育的潜能。
（小孢子培养是指把处在单核晚期的小孢子从花药中分离出来,以单个小孢子作为外植体进行培养,促进细胞分裂,然后形成单倍体胚）
配子体发育途径：
离体培养条件下，并不脱分化，而是萌发出花粉管，其中的生殖细胞分裂形成精细胞，表现出体内的配子体发育途径。
这是花粉原生质体区别于体细胞原生质体的独特的发育途径。
一般成熟的花粉原生质体在培养中多为这种发育途径。
人工分离的生殖细胞、精细胞和卵细胞一般均呈原生质体状态，概括称为配子原生质体。
第七章植物体细胞杂交
1.体细胞杂交：
又称为原生质体融合，是指将来自不同科、属、种植物的原生质体融合成一个杂种细胞，且把杂种细胞培育成新的植物体的方法。
2.原生质体融合的方法：
有自发融合和诱导融合。
（1）PEG（聚乙二醇）诱导融合法：
PEG是一种高效融合剂，优点是融合成本低，不需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。
缺点是过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害作用。
作用机理：
原生质体表面带负电荷，以为带电性质相同，所以相邻原生质体很难发生融合。
原生质体融合，质膜之间的距离要小于10Å，由于PEG分子带有负电荷的醚键，具有轻微的负极性，可以正极性基团形成氢键，在原生质体形成分子桥，使原生质体发生黏连。
当用高Ca+和高pH溶液清洗后，打破了电荷平衡，使原生质体的某些正电荷与另一些原生质体的负电荷连接，促使融合。
（2）电融合法：
优点：
对细胞无毒害；效率高；技术操作简便。
基本程序：
①细胞膜的接触②膜的击穿
4.细胞质杂种：
两个不同亲本的原生质体融合后，细胞质发生融合，其中的一个细胞核完全消失而形成的融合产物。
即只含有亲本一方的核基因组，而含有亲本双方的细胞质基因（叶绿体和线粒体基因）。
第八章人工种子
1.人工种子：
狭义：
将植物组织培养中所产生的体细胞胚胎或珠芽包埋在“人工胚乳”和“人工种皮”里，具有播种功能的类似天然种子的颗粒体．广义：
任何一种繁殖体，无论是在涂膜胶囊中包裹的、裸露的或经过干燥的，只要能够发育成完整的植株，均可称之为人工种子。
第九章植物种质资源离体超低温保存
1.超低温保存：
在-80℃以下的超低温下使细胞代谢和生长处于基本停止的状态，在适宜的条件下可迅速繁殖，再生出新的植株，并保持原来的遗传特性。
2.超低温保存的方法：
（1）传统降温冰冻的方法；快速冰冻法:
直接投入液氮（高度脱水以及抗寒性强或经低温锻炼的植物材料）；慢速冰冻法:
先用冰冻保护剂处理，再用慢速冰冻法：
0.1-10℃/min降至-70℃，再浸入液氮（含大液泡或大量水分的成熟材料）以减少胞内水分，避免胞内结冰。
；两步法:
先用冰冻保护剂处理，用可控速率的降温设备（程序降温仪）以速率0.1-0.5℃/min降至转移温度-40～-70℃,再直接投入液氮；逐级冰冻法:
逐级降低温度，-10℃、-15℃、-23℃、-40℃，每级停留5min,投入液氮
（2）玻璃化保存方法
使溶液玻璃化的途径:
提高冷却速率、增加抗冻溶液浓度（40-60%）；玻璃化：
指液体转化为非晶体（玻璃态）的固化过程；用于细胞悬浮系、顶端分生组织、胚状体和原生质体等；玻璃化液对材料具有一定毒害作用，玻璃化法比冻结固化法引起的结构变化要小。
包埋玻璃化法:
包埋-脱水和玻璃化结合；用于顶端分生组织
（3）其他超低温冻存方法
干燥法：
利用无菌空气流、干燥硅胶饱和溶液表面的气相进行脱水，迅速投入液氮；应用于植物的合子胚或胚轴；预培养法：
在含冰冻保护剂的培养基上培养一段时间，诱导脱水，再浸入液氮；用于合子胚和顶端分生组织；预培养-干燥法：
两者结合，用于胚状体；包埋脱水法：
先将材料用藻酸钙包埋，然后将包埋后含有保存材料的
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