提取分离纯化苦参中氧化苦参碱的工艺研究Word格式.docx
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Macroporousresin;
Extractionandpurification
前言
1简介
氧化苦参碱又名苦参素。
植物来源：
本品系从豆科属植物苦参（SophoraflavescensAit.）或平科植物广豆根（SophorasubprostrataChunetT.Chen）中分离出来的生物碱。
英文名称：
Oxymatrine。
熔点及溶解度：
mp.162℃～163℃（水合物），207℃（无水物），溶于水，氯仿，乙醇，难溶于乙醚，甲醚，石油醚。
分子式及分子量：
分子式C15H24N2O2；
264.36。
有效成份：
Matridin-15-one,l-oxide.（1β）-;
C15H24N2O2。
2药理作用
氧化苦参碱有抗乙型肝炎病毒作用，可降低乙型肝炎病毒转基因小鼠肝脏内HBsAg和HBcAg的含量，且对两者作用一致，无选择性作用，氧化苦参碱是一种较强的免疫抑制剂，可以抑制多种炎性因子的释放，有明确的抗炎作用，对IL-2诱导的LAK细胞杀瘤活性亦有较强抑制作用，故氧化苦参碱通过IL-2等细胞因子发挥其抗乙型肝炎病毒作用的可能性不大。
苦参的西方用途：
苦豆子sophora植物的原植物和热水粗提物在西方应用历史已经有25年了。
最初含有20%氧化苦参碱和苦参碱的苦豆子生物碱提取物由窗同药物研究所引进西方市场，形式为氧化苦参碱片intabletformunderthenameOxymatrine，1998年上市。
其使用并无任何副作用。
在中国，苦参生物碱通常采用注射形式，但在西方不接受该方法，而是采用口服形式。
口服后，大部分的氧化苦参碱被转化成了苦参碱；
而如果需要氧化苦参碱的高血液浓度，则必须依靠注射。
但是临床试验中氧化苦参碱的疗效是否好于苦参碱不得而知。
中国的研究者们也使用片剂的苦参生物碱，效果似乎和注射差不多。
苦参也可以作为中药煎服。
苦参中含有大量的生物碱，其中含量最高的是苦参碱和氧化苦参碱，加总占苦参药材根干总重的2%（其中大部分以氧化苦参碱的形式存在），同时还有其他的相近的生物碱：
其中主要是槐果碱（Sophocarpine,C15H22N2O），还含有少量的槐醇sophoranol,槐胺sophoramine,槐啶碱（Sophoridine）allomatrine,异苦参碱（Iosmatrine）等其他生物碱成分。
实验仪器、药品和试剂
1仪器
岛津液相色谱系统：
检测器（SPD-10A）、泵（LC-10AT）
电热恒温水浴锅（XMTD-4000，上海科恒实业发展有限公司）
电热型恒温鼓风干燥箱（DHG-9030A），巩义市予华仪器有限公司
电热回流提取装置：
电热套（PTHW，巩义市予华仪器有限公司）、圆底烧瓶（G.G.-1，10000ml）
天平：
马头牌JYT-5架盘药物天平（上海医用激光仪器厂）
树脂柱（特制，直径5cm，高100cm）、蒸发皿（100mL）、量筒（1000mL）
2药品和试剂
甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）
盐酸、氢氧化钠（均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司）
95%乙醇（国药集团化学试剂有限公司，试验用各浓度乙醇均由该浓度乙醇配制）
A、B、C大孔吸附树脂（西安蓝晓科技有限公司，3种大孔吸附树脂因涉及到商业机密故用A、B、C代替）
氧化苦参碱标准（中国药品生物制品鉴定所）
苦参（安徽亳州药材市场购买）
第一章氧化苦参碱HPLC检验方法
根据2010版《中国药典》选择氧化苦参碱为指标成分，并根据参考文献和经验，摸索建立了适合该品种的氧化苦参碱含量测定方法。
具体检测方法如下：
对照品溶液的制备：
精密称取氧化苦参碱对照品适量，用甲醇配制成质量浓度为0.21mg/ml。
色谱条件：
cosmosilAR-π柱，流动相为乙腈-0.36%磷酸（10：
90），柱温为25℃，流速1.0mL/min，AuFs0.01，检测波长为220nm。
供试品溶液的制备：
精密吸取1mL工艺留样，以60%甲醇稀释10倍，离心10分钟，取上清液进样。
药材中氧化苦参碱的测定：
取苦参粉末1g，置锥形瓶中，加入80%甲醇100ml，超声提取10分钟，微孔滤膜过滤，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL进样。
计算得药材中氧化苦参碱的质量分数为3.25%、4.16%、3.86%。
上述有关HPLC的部分均由相关人员完成，本人只负责HPLC测定后实验数据的处理。
第二章提取分离纯化苦参中氧化苦参碱的工艺研究
2.1提取工艺
1粉碎度的考察：
取苦参饮片（氧化苦参碱含量3.25%）3份每份300g，分为1、2、3组：
第1组饮片剪碎处理，将饮片剪至1-2cm的规格；
第2组饮片处理成粗颗粒，用锤子将饮片处理成约0.5cm的规格；
第3组打粉处理，将饮片用打粉机处理然后过筛，约50%的饮片被处理成粉末并且能过20目的筛网，剩余的饮片打粉后为纤维状无法过筛网，称取药材时按比例称取粉末和纤维。
上述3组药材按照不同的方法处理完后进行氧化苦参碱的提取，提取的方法相同：
处理后的药材用14倍量水（即4200ml水）煮沸提取1.5小时，倒出一煎液，再加入12倍量水（即3600ml水）煮沸提取1.5小时，倒出二煎液。
每组对应的一煎液二煎液量体积取样进行HPLC分析。
该次试验用的苦参，氧化苦参碱含量为3.25%，故300g药材中含有的氧化苦参碱的质量为9750mg。
表1：
不同粉碎度苦参饮片的氧化苦参碱的转移率
粉碎度
体积（ml）
氧化苦参碱质量（mg）
转移率（%）
一煎二煎总转移率（%）
碎片
4000
6249.94
64.10
77.95
3400
1350.16
13.85
粗颗粒
3600
6011.20
61.65
76.21
3800
1410.92
14.47
粉末
5484.87
56.26
70.88
1425.78
14.26
从试验的数据看出，第1组的氧化苦参碱的提取率略高于其他两组，且第1组的药材饮片的处理较其他两组都要简便，故选用第1组的处理方法即将药材饮片处理成1~2cm的片段作为饮片预处理的方法。
粉碎是中药前处理过程中的必要环节，通过粉碎可增加药物的表面积，促进药物溶解与吸收，加速药材中有效成分的浸出。
但粉碎过细，药粉比表面积太大，吸附作用增强，反而影响扩散，影响提取效率。
苦参是根类药材提取时粗颗粒为宜，实验结果也证明了药材处理的过细会影响氧化苦参碱的提取率，1~2cm的片段最适宜氧化苦参碱的提取。
2浸泡时间考察：
取苦参饮片（氧化苦参碱含量3.25%）3份每份300g，将饮片处理成1~2厘米的片段，3份饮片分别浸泡0小时、2小时、4小时[1]，提取的方法为回流提取法，加14倍量水和12倍量水煮沸1.5小时，药液放冷后滤过，每份的一煎液和二煎液的滤液分别取样进行HPLC的含量测定。
0小时、2小时、4小时浸泡后氧化苦参碱的转移率分别为69.89%、69.17%、67.35%，由此可得出，浸泡时间对氧化苦参碱的提取基本无影响。
表2：
不同浸泡时间苦参饮片的氧化苦参碱的转移率
浸泡时间
0小时
3500
5257.92
69.09
1526.39
2小时
5240.25
69.17
1503.42
4小时
3700
5424.03
67.36
1142.41
氧化苦参碱在热水中较高的溶解度和热稳定性，药材饮片浸泡的时间虽然不同但是在提取时加入的溶剂量和煮沸的时间是相同的，由于氧化苦参碱在热水中溶解度较高和热稳定性的性质可能是导致浸泡时间对氧化苦参碱的提取率影响较小的原因。
3苦参提取正交
根据极性的强弱和经验将溶剂的含醇量分为0%、40%、80%3种[2][3][4]。
一般中药提取的时间为1小时，故选取0.5、1.0、1.5这3个不同的提取时间来提取[5]。
溶剂量[7][8]一般以12倍量为准，二煎由于有效成分在一煎时已经被提取了大部分故减少了2倍量，选取的溶剂量为10+8、12+10、14+10这3个不同的溶剂量。
选取溶剂含醇量、溶剂量、提取时间为考察因素，以氧化苦参碱总转移率为指标，采用L9（34）正交表安排试验。
表3：
苦参提取正交因素水平表
水平\因素
溶剂含醇量（%）
溶剂量（倍数）
提取时间（h）
1
10+8
0.5+0.5
2
40
12+10
1.0+1.0
3
80
14+12
1.5+1.5
表4：
苦参提取正交表
组别\因素
4
5
6
7
8
9
称苦参饮片（氧化苦参碱含量4.16%）9份，每份300g，将饮片处理成小于1~2厘米的片段。
苦参提取的装置是电热套，方法是回流提取。
实验过程中，按照对应组别所示的条件进行试验。
100ml固体质量为蒸发皿和固体的总重减去蒸发皿重所得。
表5：
苦参提取正交中各组氧化苦参碱的转移率及除杂率
组别
含量（mg）
100ml含固体量（g）
固体总量
除杂率（%）
4530
6365.21
65.10
1.59
72.027
91.16
5705
7978.36
70.75
1.25
71.312
88.81
7180
8671.59
67.94
0.91
65.338
86.72
6750
7660.75
76.66
1.09
73.575
89.58
4495
7148.84
67.30
1.69
75.966
90.58
5920
8190.18
65.68
1.14
67.488
87.86
5720
7190.76
74.42
1.47
84.084
91.44
6785
9753.76
82.53
1.13
76.671
87.27
4840
7385.14
65.85
71.148
89.62
K1
203.79
216.12
198.25
K2
209.58
220.58
210.85
K3
222.80
199.47
227.07
R
6.33
5.55
9.60
除杂率=100%-氧化苦参碱质量/总固体质量，除杂率仅作参考以下的除杂率均相同
表6：
氧化苦参碱提取正交方差分析
方差来源
平方和
自由度
均方
F值
溶剂含醇量
63.198
31.600
21.639
溶剂量
82.691
41.350
28.310
提取时间
139.761
69.88
47.850
误差
2.9206
1.460
由表6可以看出，溶剂含醇量、溶剂量、提取时间这3个变量的F值均大于18，由此得出该3个变量对氧化苦参碱的提取都有较高的影响，实验结果表示第8组即14+12倍量的40%乙醇提取1.5+1.5小时，氧化苦参碱的转移率最高，有82.53%，因此第8组的提取条件最优，该组的除杂率91.18%也很高。
2.2分离纯化工艺
1苦参纯化树脂类型的考察：
苦参药材3份每份300g（氧化苦参碱含量3.25%）提取，抽取上清液，用2%NaOH调滤液的pH为7-8，调完pH后的滤液共有2.07L，留样，均分为3份每份约为6.9L，分别过A、B、C大孔树脂柱，树脂量为600ml，上柱速度为3BV/h，水洗速度为2BV/h，洗脱液为90%乙醇共4BV，洗脱速度为1BV/h。
A、B、C柱的流出液分别为6300ml、6500ml、6400ml，分别留样进行HPLC测定。
A、B、C柱的洗脱液分别为950ml、1055ml、1225ml，分别留样进行HPLC含量测定。
表7：
3种树脂用90%乙醇对氧化苦参碱的洗脱效果
名称
柱前液
6900
6264.76
100.00
A流出液
6300
1665.56
26.59
B流出液
6500
204.32
3.26
C流出液
6400
1858.96
29.67
A洗脱液
950
3401.56
54.29
B洗脱液
1055
5493.24
87.68
C洗脱液
1225
4178.74
66.70
注：
柱前液中氧化苦参碱的含量记为100%
B大孔吸附树脂对氧化苦参碱有较强的吸附效果，并被90%乙醇洗脱，转移量为5493.24mg，转移率高达87.68%。
选择树脂量为600ml由树脂柱的大小决定，600ml树脂约占柱高的1/3,
A大孔吸附树脂是中极性树脂，属于中药专用树脂，适用范围是三七皂苷、绿原酸、原花青素、花色苷、广枣黄酮、沙棘黄酮等化合物，B大孔吸附树脂是极性树脂，适用于生物碱类化合物。
C大孔吸附树脂是极性树脂，属于中药专用树脂，适用范围是甜叶菊、茶多酚、蒽醌类、酚类、咖啡因、有机酸、黄酮类等化合物。
氧化苦参碱、苦参碱是高极性的化合物，根据相似相容原理，在选用树脂时选择了中极性和极性的树脂，而没有选用极性较弱的大孔吸附树脂。
因为还没做有关洗脱浓度的考察，选择极性高的90%乙醇洗脱，根据相似相容原理氧化苦参碱易溶于极性高的溶液，90%乙醇极性高易于把氧化苦参碱洗脱下来。
2苦参树脂正交
所有的组别树脂量均为600ml，树脂为B大孔吸附树脂
选取上柱量、上柱pH、乙醇洗脱浓度为考察因素，以氧化苦参碱总转移率为指标，采用L9（34）正交表安排试验。
表8：
苦参树脂正交因素水平表
上柱量（g）
上柱pH
乙醇洗脱浓度（%）
300
70
400
500
90
称取苦参饮片（氧化苦参碱含量3.25%）6份每份600g，将饮片处理成1~2厘米的片段，用3个电热套分2次提取，提取时加水量为14+12倍量，提取时间为1+1小时。
将6份的提取液合并，放凉沉淀后抽取上清液，上清液共52.4L。
柱前液取样用HPLC法测定其氧化苦参碱的量。
根据上柱量的不同将分为：
6L（300g）、6.8L（400g）、8.7Lml（500g）。
根据每组不同的pH用5%HCl或者2%NaOH调pH至所规定的值。
上柱速度为3BV/h，洗脱也按照规定的乙醇浓度来洗脱，洗脱量为2BV，洗脱速度为1BV/h。
洗脱液用HPLC法测定其氧化苦参碱量，并计算各组的氧化苦参碱转移率。
各组别均按下表所示。
表9：
苦参树脂正交表
氧化苦参碱转移率（%）
78.58
75.36
91.15
76.95
67.24
79.47
54.96
79.91
68.40
81.26
47.37
82.29
45.74
81.78
49.03
83.00
33.63
83.76
236.97
179.28
180.61
170.73
208.58
184.26
128.4
148.24
171.23
36.19
60.34
4.34
氧化苦参碱转移率是相对于柱前液的转移率
表10：
苦参树脂正交方差分析
上柱量
1996
998
270.9
607
303.5
82.3
乙醇洗脱浓度
30
15
4.1
3.5
由表10看出，上柱量和上柱pH的F值均大于18成高显著性，可以得出这两个变量对氧化苦参碱的转移率都有很大的影响，第2组即300g药材量、pH7的上柱液、80%乙醇洗脱氧化苦参碱的转移率最高，且该条件下的除杂率也很高有83.00%。
第三章最佳工艺重现
在上述试验中确定了最佳的树提取分离氧化苦参碱的工艺，现对其进行3次重现。
称取2400g苦参（氧化苦参碱含量3.86%），14+12倍量的40%乙醇回流提取1.5+1.5小时，提取液放冷抽取上清液，调pH至7，回收其中乙醇加水至上清液的原体积，上柱，上柱速度2BV/h，水洗2BV速度为2BV/h，2BV80%乙醇洗脱速度为1BV/h。
表11：
最佳树脂工艺重现
（1）
体积（L）
水煎液
58.0
78790.16
85.05（相对药材）
55.0
74891.88
100（相对柱前）
上柱流出液
53.0
2133.82
2.84（相对柱前）
水洗液
6.0
3085.98
4.12（相对柱前）
80%乙醇洗脱液
10.5
63889.51
85.30（相对柱前）
表12：
最佳树脂工艺重现
（2）
样品名
53.5
81472.77
87.95（相对药材）
52.4
76131.74
51.5
2375.22
3.11（相对柱前）
6.3
3248.43
4.26（相对柱前）
11.3
64541.57
84.77（相对柱前）
表13：
最佳树脂工艺重现（3）
54.2
80994.87
87.43（相对药材）
51.4
76386.25
2435.35
3.19（相对柱前）
5.5
3096.56
4.05（相对柱前）
11.0
66014.26
86.42（相对柱前）
试验结果表明该工艺有良好的重现性和可行性，提取率85%左右，树脂柱的转移率在80%以上，能够重现最佳提取和树脂纯化工艺正交筛选结果。
结论
氧化苦参碱的提取是一系列实验的基础，在这个基础上一步步的往下做实验。
在提取时为了保证前后实验的统一，沸腾的程度要保持基本相同。
开始沸腾的时间要准确记录。
因苦参原药材中含有少量的泥沙，在提取时会溶在药液中，如果不除去泥沙在上柱时会影响上柱速度。
抽取上清液时用，100目滤网加棉花加300目滤网过滤，尽可能多的除去泥沙和较大颗粒的杂质。
上柱时因溶液中仍含有少量泥沙和小颗粒的杂质，会缓慢的降低上柱的速度，树脂的表层会有树脂和杂质生成的饼装物生成，需要用玻璃棒捣碎。
洗脱时要控制好流速，过快洗脱不完全，影响转移率，洗脱液浓度变大会使速度变慢，也要控制流速一面过慢导致试验时间过长。
树脂的再生是试验中比较关键的一步，每一次的再生都为下一次实验打下基础。
洗脱得到的溶液中氧化苦参碱的含量不是100%仍有一些能被B树脂吸附洗脱的物质为进一步提高氧化苦参碱的纯度可用其他树脂出去。
本实验室为工业大规模生产做铺垫的，为了降低成本只进行了一种树脂对氧化苦参碱的分离纯化。
根据苦参提取实验的数据所示14+12倍量的40%乙醇回流提取1.5+1.5小时，为苦参的最适宜的提取方法，300g药材量上柱（对应600ml树脂）、pH7、80%乙醇洗脱氧化苦参碱的转移率最高、除杂率也很高，适合氧化苦参碱的分离纯化。
实验结果证明：
采用大孔树脂法分离纯化苦参中生物碱类成分（氧化苦参碱为主）的方法是可行的，该工艺可靠稳定，有效
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