液相色谱-串联质谱法测定氯吡格雷羧酸代谢物SR26334血药浓度的不确定度评价.docx

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中国新药与临床杂志（ChinJNewDrugsClinRem）,2013年8月，第32卷第8期 .665.

［文章编号］1007-7669（2013）08-0664-05

液相色谱-串联质谱法测定氯毗格雷蔑酸代谢物SR26334血药浓度的不确定度评价

杨杰，，谭洁\邹建军b

（南京医科大学附属南京市第一医院a.神经内科，b.临床药理实验室，江苏南京210006）

［关键词］不确定度评价；色谱法，高压液相；串联质谱法；氯毗格雷；血药浓度

［摘要］目的评价液相色谱-串联质谱法测定氯毗格雷斐酸代谢物SR26334血药浓度的不确定度，以找到影响其不确定度的因素，为评价检测报告提供科学依据。

方法根据《测量不确定度评定与表示》，并参考《化学分析中不确定度的评估指南》，计算各分量的相对标准不确定度和合成相对不确定度，并给出测定结果的扩展不确定度。

结果20|xg-L-'SR26334的标准不确定度为0.816 扩展不确定度为

1.63jig-L',浓度测定结果可表示为（18.62±1.63）瞄・1/。

结论建立的不确定度评估方法可用于液相色谱-串联质谱法测定血浆中SR26334浓度的不确定度评估。

样品前处理和标准曲线拟合是浓度测定结果的主要的不确定度来源。

［中图分类号］R917［文献标志码］A

EvaluationofmeasurementuncertaintyindeterminationofclopidogrelcarboxylicacidmetaboliteSR26334inhumanplasmabyLC-MS/MS

YANGJiea,TANJieb,ZOUJian-junb

（a.DepartmentofNeurology,b・DepartmentofClinicalPharmacology,theFirstHospitalofNanjingMedicalUniversity,NanjingJIANGSU210006,China）

［KEYWORDS］uncertaintyevaluation;chromatography,highpressureliquid;tandemmassspectrometry;clopidogrel；plasmaconcentration

:

ABSTRACT］AIMToevaluatetheuncertaintyinthedeterminationofclopidogrelcarboxylicacidmetaboliteSR26334inhumanplasmabyLC-MS/MSandfindouttheinfluencingfactorstoprovidescientificbasisforthetestreportevaluation.METHODSTheuncertaintyinthedeterminationofSR26334inhumanplasmabyLC-MS/MSwasanalyzedandevaluatedaccordingtothe"EvaluationandExpressionofUncertaintyMeasurementHandtheMManualofUncertaintyEvaluationinChemicalAnalysis".RESULTSThestandarduncertaintyofSR26334inhumanplasmawiththedosageof20|xg*L_,was0.816|ig,L-!

andtheexpanduncertaintywas1.63|ig-L-1.Theresultofthedeterminationcouldbeexpressedas（18.62±1.63）jig-L-1.

［收稿日期］2012-03-19［接受日期］2013-05-16

［基金项目］国家自然科学基金项目（81100859）,博士后基金（2012M511302）,南京市医学科技发展项目（QYK10137,

QYK10142,QYK11168）,2012南京市科委第8批科技发展计划项目（201208008）

［作者简介］杨杰，男，博士后，主要从事脑血管疾病的临床诊治和遗传学研究；邹建军，男，博士，从事基因多态性和临床个体化给药研究，E-mail:

zoujianjun100@

［责任作者］邹建军

CONCLUSIONTheestablisheduncertaintyassessmentmethodcanbeusedintheuncertaintyevaluationinthedeterminationofSR26334inhumanplasmabyLC-MS/MS.Theuncertaintyofthisexperimentwasmainlycausedbythesamplepretreatmentandthecalibrationcurve.

ISO/IEC17025：

2005明确要求，合格分析实验室的每个证书或报告都应该包含有关校准或测试结果不确定度评定的说明。

中国实验室国家认可委员会编写的《化学分析中不确定度的评估指南沪也要求：

化学检测实验室在实施认可准则时，要提供检测结果的不确定度，其大小决定了测定结果的实用价值。

不确定度对于控制实验质量和优化实验方法具有非常重要的意义。

本研究对液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法检测氯毗格雷段酸代谢物SR26334血药浓度进行不确定度评定，以找到影响其不确定度的因素，控制分析方法的关键步骤，减小方法的不确定度，为方法学研究提供有益的指导。

材料和方法

仪器与试药FinniganLC-MS/MS（TSQ）仪和Xcalibar1.2质谱工作站，METTLER电子天平，AllegraTM64RCentrifuge台式高速冷冻离心机（BECKMANCOULTERTM）。

SR26334对照品（批号：

20101207）纯度为99.2%,由深圳信立泰制药有限公司提供。

毗格列酮（内标），批号：

20101207,纯度：

99.8%,由江苏德源药业有限公司提供。

甲醇（色谱纯，美国TEDIA公司，MS1922-001,L0T610697）,甲酸（分析纯，上海久臆化学试剂有限公司，批号：

20030110）,乙醍（分析纯，南京化学试剂一厂，批号：

050710684）,正己烷（分析纯，海陆都化学试剂厂，批号：

20031216）,实验用水均为去离子水。

色谱和质谱条件色谱柱为Teknokroma如（2.1mmx100mm,5|jLm）,甲醇：

水（含0.1%甲酸）=80:

20（W）,流速：

0.20mL-rnin-1,柱温：

35乞。

离子检测方式：

多反应离子监测（MRM）,离子化方式：

气动辅助电喷雾离子化（ESP）。

SR26334检测离子：

泌308.1—198.1,内标毗格列酮检测离子：

以357.2一134.2。

血浆样品预处理精密吸取血浆样品0.50mL置离心管中，精密加入l.Omg-L-11*1标溶液lOjxL和甲酸10jiL,涡旋混匀，加入乙醍-正己烷（4:

1,V/V）提取液4mL,涡旋3min,895xg离心10min,吸取上层有机相于另一离心管中，40V水浴中用氮气吹干，残渣用流动相200白L溶解，进样量为10讪。

标准溶液的配制精密称取SR26334对照品约5mg,置于10mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，涡旋混匀，即得0.50g-L-'的SR26334储备液。

精密吸取储备液2mL置于10mL量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，涡旋混匀，即得100mg-L-'的SR26334I作溶液，依次稀释配成10mg-L'1,1mg-L-1和100|ig-L-'的SR26334系列工作溶液，-20龙冰箱保存备用。

标准曲线建立取离心管数支，分别精密加入10mg•L"11mg,L-1和100|ig•L"1SR26334适量，用氮气吹干，分别加入空白血浆0.50mL,涡旋1min,配成SR26334浓度分别为20、50、100、250、600、1200、2500ixg-L'1的系列血样，每个浓度制备四份，分别加入1.0mg-L-'内标溶液10p_L和甲酸IOjjiL,涡旋混匀，按“血浆样品预处理”项下处理，进样分析，进样量为10卬L。

用最小二乘法对浓度-峰面积比值进行曲线拟合，得到标准曲线回归方程，按照下述数学模型计算待测样品中SR26334浓度。

建立数学模型根据标准曲线回归方程得出待测样品中SR26334浓度的数学模型为：

c样品=（f-a）/boc样品：

待测样品中SR26334浓度，£待测样品中SR26334与内标的峰面积比值，a：

标准曲线回归方程的截距，b：

标准曲线回归方程的斜率。

不确定度评估根据文献［2,3］方法，按照以下四个步骤进行：

（1）规定被测量；

（2）识别不确定度来源；（3）不确定度分量的量化，包括对照品纯度、对照品称量、对照品溶液稀释、样品前处理和标准曲线拟合；（4）计算合成不确定度，对浓度为20|xg-L-＞的血样，进行不确定度评估。

其中，对照品纯度引入的不确定度符合均匀分布倒，标准曲线拟合的不确定度采用加权方法来计算叫

结果

不确定度的量化分析

1对照品纯度引入的相对标准不确定度必，（S）

属B类不确定度％,SR26334纯度为99.2%,由于目前没有给出不确定度的其他说明，故暂假定问其分散区间的半宽度a=0.25%,按均匀分布换算：

u（S）=0.25%∕31/2=0.14%,其相对标准不确定度为：

⅛（S）=u（S）/S=0.00141,ιz表示标准不确定度。

2对照品称量引人的相对标准不确定度i⅛（m）天平称量灵敏度不确定度、天平称量重复性不确定度和天平示值不确定度是该不确定度的来源。

天平称量灵敏度不确定度u（W0）≡根据检定证书可知天平精度为0.01mg,按矩形分布，取包含因子K=3吃其称量的不确定度u（W0）=0.01∕3lfl=5.77×IO"3mgo天平称量重复性不确定度u（W1）:

所用的电子天平的鉴定证书给出的重复性误差为±0.03mg,按矩形分布,u（W1）=0.03/3u2=1.73×10-2mg。

天平示值不确定度u（W2）:

所用电子天平的鉴定证书给出的最大允差为±0.1mg,按矩形分布，u（W2）=0.1/3S=5.77×10-2mgo对照品称量引入的标准不确定度u（m）由天平称量灵敏度不确定度、天平称量重复性不确定度和天平示值不确定度合成得到，即口（m）=[u2（W0）+u2（W1）+u1（W2）]lβ=6.05x10-2mgo对照品称量引入的相对标准不确定度urel（m）由对照品称量引入的标准不确定度u（m）除以对照品称样量获得，即uld（m）=a（m）∕m=0.0121,其中SR26334对照品称样量（m）为5.00mg。

3对照品稀释引入的相对标准不确定度加（fo）玻璃仪器的校准允差、对照品稀释时温度和玻璃仪器的校准温度的差异是该不确定度的来源。

校准：

实验中所用玻璃仪器有A级10mL量瓶、A级1mL和2mL单标移液管，由文献[7]得容量允差分别为±0.02mL、±0.002mL和±0.004mLo由于标定值比极限值出现的可能性更高，按三角分布，10mL量瓶、ImL和2mL单标移液管由允差引起的标准不确定度分别为：

u（10）a=0.02∕6w=8.16xIO'3mL,u（l）a=0.002∕6ιz2=8.16×10^4mL,u

（2）a=0.004∕6lβ=1.63×103mLo温度:

玻璃仪器的校准温度为20°C,而实验温度为18°C,因为甲醇的膨胀系数明显大于玻璃的膨胀系数，忽略后者，只考虑甲醇的膨胀系数2.1x10%按矩形分布，10mL量瓶、ImL和2mL单标移液管由温度引起的标准不确定度分别为：

u（10）b=

2.1x10j,×10×3∕3y2=3.64×10^3mL,u（l）b=

2.1×10^4×1×3/31/2=3.64×10^mL,u

（2）b=

2.1×10^,×2×3/31/2=7.28×10。

mL0由玻璃仪器引起的标准不确定度：

由上述玻璃仪器的校准允差、对照品稀释时温度和玻璃仪器的校准温度的差异引起不确定度合成得到，即以（10）=[u2（10）a+u2（10）b]lβ=8.93xIO-3mL,u

（1）=[u2

（1）,+温（l）b]υ2=8.93x10也mL,u

（2）=[u2

（2）a+u2

（2）b]lβ=1.646×IO"3mLo由玻璃仪器引起的相对标准不确定度：

由标准不确定度和稀释的体积的比值得到，即如（10）=u（10）/V=8.93x10%⅛

（1）=u

（1）/V=8.93×10%urel

（2）=u

（2）/V=8.23×10气如（10）、⅛

（1）和uιeι

（2）分别表7510mL量瓶、1mL和2mL单标移液管引起的相对标准不确定度。

对照品稀释相对标准不确定度如（f0）由上述10mL量瓶、1mL和2mL单标移液管的不确定度合成得到，对照品稀释过程中共用四个A级10mL量瓶，两个A级1mL和一个A级2mL单标移液管,故稀释引起的相对标准不确定度⅛（f0）=[4l⅛2（10）+2⅛2

（1）+1⅛2

（2）]1z2=0.00234。

4样品前处理过程中引入的相对标准不确定度临!

（R）采用绝对回收率的相关数据计算样品前处理过程中产生的不确定度。

20μg∙L-,绝对回收率数据分别为77.2%、77.9%、83.5%、70.6%和88.1%,均值为79.5%,标准平均偏差Sr=6.7%,n=5o因此，标准不确定度ιz（R）和相对标准不确定度⅛（R）分另∣J为：

u（R）=$如切=6.7%/5坦=2.99%,z⅛（R）=u（R）∕R=2.99%∕79.5%=0.037705标准曲线拟合引入的相对标准不确定度加（B）采用最小二乘法拟合得到标准曲线的回归方程为y=0.0535+0.0134xc（权重系数w=1/c,r2=0.9975,c表示样品测定的浓度）；并由标准曲线反推20μg∙L-1的计算浓度为18.46、17.92、18.52和19.58μg∙L-"（n=4）,均值为18.62μg∙L-1,标准平均偏差Sr=0.695μg∙L-10因此，标准不确定度儿（B）和相对标准不确定度z⅛（B）分别为：

u（B）=SR/n1/2=0.695∕4lβ=0.347μg∙L-',%（B）=u（B）∕B=0.347/18.62=0.0186o测定不确定度报告

1不确定度的主要分量确定对影响SR26334浓度测定的不确定度分量作图可见，在影响血浆中SR26334浓度测定结果的四个因素中，贡献最大的不确定度分量是样品前处理，其次是标准曲线拟合过程，如图1所示。

2合成相对标准不确定度“&、合•成标准不确定度

图1血浆中氯毗格雷段酸代谢物SR26334浓度的相对不确定度分量

uc（Y）和扩展不确定度U（Y）财由前述对照品纯度引入的相对标准不确定度％（S）、对照品称量引入的相对标准不确定度如（m）、对照品稀释引入的相对标准不确定度如（f。

）、样品前处理过程中引入的相对标准不确定度始（R）和标准曲线拟合引入的相对标准不确定度如（B）组成，即Urel=[Urd2（S）+ （m）+妃（ffl）+、（R）+

如2（B）]S=O.O438。

Uc（Y）由合成相对标准不确定度与浓度的测定值的乘积得到，即uc（Y）=0.0438x18.62u,g-L-'=0.816|xg-L-'o扩展不

定度评定［J］.中国药业，2009,12（9）：

1318-1320.

［7］ 国家质量技术监督局.JJG196-2006常用玻璃量器检定规程［S］.北京：

中国计量出版社，2007：

10.

［8］ 李金海.误差理论与测量不确定度评定［M］.北京：

中国计量出版社，2003：

148.



［9］SAARIE,PERAMAK1P,JALONENJ.Evaluatingtheimpactofextractionandcleanupparameterontheyieldoftotalpetroleumhydrocarbonsinsoil［J］.AnalBioanalChem,2008»392（6）；1231-1240.

［文章编号］1007-7669（2013）08-0668-04

可溶性细胞间粘咐分子-1检测试剂盒诊断胎膜早破的临床试验

董晓静I胡丽娜二常青2,李力3,罗丹\李佳平5,杨业洲6

（1.重庆医科大学附属第二医院妇产科，重庆400010；2.中国人民解放军第三军医大学第一附属医院妇产科，重庆400038；3.中国人民解放军第三军医大学第三附属医院妇产科，重庆400042；4.成都市妇女儿童中心医院妇产科，四川成都610091；5.川北医学院附属医院妇产科，四川南充637000；6.四川省人民医院妇产科，四川成都610072）

［关键词］胎膜早破；细胞间粘附分子-1；妊娠并发症；临床试验

［摘要］目的评价可溶性细胞间粘附分子-1（sICAM-1）检测试剂盒用于诊断胎膜早破的敏感度及特异性。

方法选择妊娠15至42周到医院就诊的妊娠妇女，进行阴道液pH值测定、阴道后穹窿积液检查、阴道液涂片羊齿状结晶检查，其中两项阳性者诊断为胎膜早破，两项阴性者诊断为胎膜未破。

所有妊娠妇女均进行sICAM-1试剂盒检测。

运用kappa统计量评估检测结果的一致性和相关性。

结果1047例妊娠妇女进入该临床试验研究，经阴道液pH值、阴道后穹窿积液和阴道液涂片羊齿状结晶三项检查，诊断胎膜早破423例，胎膜未破624例；sICAM-1检测试剂盒检测出胎膜早破446例，胎膜未破601例。

sICAM-1检测试剂盒诊断胎膜早破的敏感度为99.53%,特异性为95.99%,假阳性率为4.01%,假阴性率为0.47%,阳性预测值为94.39%,阴性预测值为99.67%,准确度为97.42%。

sICAM-1检测试剂盒诊断胎膜早破与阴道液pH值测定、阴道后穹窿积液检查具有极强一致性（kappa=0.9193、0.9192）,与阴道液涂片羊齿状结晶检查具有中度一致性（kappa=0.4931）。

整个试验无不良事件发生。

结论sICAM-1检测试剂盒在诊断胎膜早破中具有较高的敏感度、特异性、准确度和安全性。

［中图分类号］R711.3；R978.1 ［文献标志码］A

Clinicaltrialofsolubleintercellularadhesionmolecule-1detectionkitindiagnosisofprematureruptureofmembrane

DONGXiao-jing1,HULi-na1,CHANGQing2,LILi3,LUODan4,LIJia-ping5,YANGYe-zhou6

（1.DepartmentofObstetricsandGynecologytheSecondAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,CHONGQING400010,China；2.DepartmentofObstetricsandGynecology,theFirstAffiliatedHospital,theThirdMilitaryMedicalUniversityofPLA,CHONGQING400038,China；3.DepartmentofObstetricsandGynecology,theThirdAffiliatedHospital,theThirdMilitaryMedicalUniversityofPLA,CHONGQING

［收稿日期］2012-02-21［接受日期］2013-03-14

［作者简介］董晓静，女，副教授，主要从事妇产科学及新药临床研究，Phn：

86-13648437247,E-mail：

xffdoctor@