提取高质量RNA的技巧.docx

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提取高质量RNA的技巧

提取高质量RNA的技巧

　　RNA提取过程中最重要的注意事项是防止RNA酶的污染导致实验失败，这一点可从RNA实验一章中得到详细的操作注意事项的参考。

除此之外，笔者总结以下技巧提供给各位参考，帮助大家提取更高质量的RNA。

（1）整个实验过程都要佩戴一次性手套。

因为皮肤经常带有的细菌、霉菌等微生物及人体自然脱落下来的皮屑，都可能成为RNA酶的来源，而影响RNA的抽提。

要培养良好的无菌操作习惯，预防微生物污染。

使用灭菌的一次性的塑料器皿抽提RNA，避免使用公共仪器，公共仪器或多或少都会含有RNA酶，特别是DNA操作时有时要加入RNA酶，消化DNA样品中所含的RNA。

用过RNA探针的实验室，可能用RNA酶来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的公共实验用具可能富含RNA酶。

（2）操作时勤换手套，冰上操作，戴手套口罩，动作要迅速。

最关键的一步也是决定RNA质量的一步是：

加氯仿离心后，出现分层，RNA在上清中，中间是DNA，下面是蛋白。

吸上清时一定要小心，防止将中间的DNA混入，以免影响RNA质量。

乙醇清洗后，一定要完全除去乙醇（至无乙醇味），否则会影响电泳时上样。

异丙醇–20ºC沉淀RNA30min以上。

在这过程中有一个小技巧，就是在加入氯仿离心后，一般上清液的量约占总体积的50%。

为了提高RNA的质量和产率，离心后并不马上吸取含有RNA的上清液，而是移取中层的DNA和下层的蛋白。

余下10%～15%的下层油相，经短暂高速离心之后再吸取上清含有RNA的水相。

因为当下层油相占很少体积时，上下层的界面所占的体积少，不会浪费太多的水相，吸入中间蛋白相和下层油相的可能性也小。

其实这一技巧可用于所有的分层液相的实验，如酚抽提DNA的实验，回收胶中DNA的实验。

　　（3）如果所要提取样品是细胞，不能在细胞离心后马上加入Trizol试剂。

因为成团的细胞，加入Trizol试剂后，外围细胞先期施放出的大分子DNA，聚积成团，干扰成团里层细胞的裂解，即使用加样枪或针头反复吸取，也无法彻底打断已经成团的DNA。

如果提取样品来自培养的贴壁细胞，吸取培养基后用PBS洗涤细胞两次，直接加人Trizol试剂；如果提取样品来自培养的悬浮细胞，连培养基一起吸取离心，用PBS洗涤细胞两次，最后加入5%～10%的PBS重悬细胞沉淀，等到重悬完全后再加入Trizol试剂。

如果所要提取的样品来自组织块，就得充分研磨组织，等组织块成为粉末后再加入Trizol试剂。

常用的研磨方法是液氮研磨法。

因为液氮变为气体时要吸收大量的热，使组织块瞬间冷冻。

但如果冷冻不透，液氮研磨材料时，会得到干渣并黏在研钵内壁，而不是干粉，无论是产量还是质量都次之。

因此，这一过程中有三个关键步骤：

第一，研磨器皿高压灭菌烘干水汽后，–80ºC放置过夜，预冷冻；其次，组织块的表面积尽可能大，切不可成球状，一用力研磨，球状的组织块极易飞出研钵；最后，加入足量的液氮让组织块完全冻透，一次将组织块研磨好。

在没有冻透之前千万不能研磨，如一次没有研磨好，下一次研磨的效果就差，且第二次加入的液氮会将前一次所产生的干粉带出研钵，使其飞溅在研钵的四周。

这一技巧同样可用于分离提取组织块的DNA或蛋白质。

　　（4）使用Trizol试剂时，其中的一种成分能抑制RNA酶，所有RNA样品泡在Trizol试剂中是不可能被RNA酶消化的。

但是，而后对样品的后续操作会要求用无RNA酶的玻璃器皿或塑料器皿。

玻璃器皿可以在150ºC的烘箱中烘烤4h。

塑料器皿可以在0.5mol/L的NaOH中浸泡10min，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。

　　（5）用0.01%的DEPC或Erasol水溶解RNA时，应根据沉淀的多少加入相应的体积，一开始没经验可少加，浓度大可以再稀释。

提完后跑电泳看看有无DNA污染和RNA降解，然后–80ºC保存，可保存数月。

实验后要注意：

超净台需用70%乙醇擦拭，再用DEPC或Erasol除去空气中的RNase，提RNA所需的Tip和EP管要提前用0.1%的DEPC或Erasol水处理以除去RNase，DEPC处理还需高压。

其实RNA贮存在70%的乙醇中，远比贮存于DEPC水中稳定，在–80ºC可保存数年，甚至10多年后还可以用。

有两种操作方式：

第一种方式是乙醇或异丙醇沉淀后如不马上要用，直接换成70%乙醇，–80ºC保存，用时再来分析RNA的质量和数量；另一种方式是常规的处理后，知道RNA的质和量，再加入3倍体积的无水乙醇，再–80ºC保存。

当然，这两种贮存方式都要在RNA不是马上要用的前提下进行。

如果提取的RNA比较多，可以先留取一部分样品进行下一步马上的实验，另一部分贮存于70%乙醇，以备后用。

　　（6）有关实验器皿。

Trizol试剂提取RNA所用到的一次性试管，要事先检验以确保该试管可以耐受加入Trizol和氯仿，及以后12000g的离心力。

不可使用有裂缝或者破损的试管。

实验用的水也是很关键的，必须用DEPC处理过的无RNase水。

具体做法是将去离子水中加入0.1%DEPC，摇过夜，之后再高压。

高压这步是不能省的，因为必须用高压把残留的DEPC分解掉，不然会影响后续的反应。

在提取时，所有接触到Trizol试剂的器皿都要泡存水中，吸取出来的Trizol试剂也要直接加入含有大量水的玻璃杯中。

其次就是要注意Trizol试剂中的酚。

　　（7）Trizol试剂含有酚等有机溶剂，所以Trizol抽提RNA时要戴手套和护眼罩，避免接触皮肤和衣服。

要在化学通风橱完成操作，避免呼吸道吸入。

所有的操作应该在15～30ºC的条件下完成。

一、餐饮服务单位应配备专职或兼职食品安全管理人员；提供餐饮服务的学校（含托幼机构）、中央厨房、集体用餐配送单位、连锁餐饮企业总部、网络餐饮服务第三方平台提供者等应设立食品安全管理机构，应配备专职食品安全管理人员。

食品安全管理人员的任命，应有正式文件或其他证明材料。

食品安全管理人员应当在食品安全管理、评价考核和奖惩等方面获得充分授权。

食品安全管理人员应按规定参加食品安全培训。

原则上每年应接受不少于40小时的餐饮服务食品安全培训。

餐饮企业的食品管理人员应当接受考核，合格后方可上岗。

二、食品安全管理人员主要承担以下管理职责：

（一）负责拟订并组织实施本单位食品安全管理制度，明确各岗位的食品安全责任，强化过程管理。

（二）组织开展食品安全教育培训和考核，普及食品安全知识。

（三）食品、食品添加剂、食品相关产品采购索证索票、进货查验和采购记录管理；

（四）场所环境卫生管理；

（五）食品加工制作设施设备清洗消毒、养护管理；

（六）人员健康状况管理；

（七）加工制作食品管理；

（八）食品添加剂贮存、使用管理；

（九）餐厨废弃物处理管理；

（十）有关法律、法规、规章、规范性文件确定的其他餐饮服务食品安全管理。

三、食品安全管理人员应根据《餐饮服务预防食物中毒注意事项》（相关内容见《餐饮服务食品安全操作规范》附件，下同）和经营实际，确定高风险的食品品种和加工制作环节，实施食品安全风险重点防控。

四、开展定期自查。

根据《食品安全法》《餐饮服务食品安全操作规范》等相关要求，定期开展食品安全自查，对检查中发现不符合食品安全要求的，应制订并落实有关整改措施，及时消除食品安全隐患，促进餐饮单位落实食品安全主体责任。

五、积极配合市场监督管理部门开展监督检查。

发生疑似食品安全事故，依法报告、处置食品安全事故。

六、建立健全食品安全管理档案。

做好单位资质证件、人员管理信息、管理记录、监管信息等资料的整理归档。

七、做好食品安全法律、法规、规章、规范性文件和食品安全标准规定的其他要求。

2、餐饮从业人员培训、考核制度

一、餐饮服务单位应每年对其从业人员进行不少于一次食品安全培训、考核。

特定餐饮服务提供者应至少每半年对其从业人员进行一次食品安全培训、考核。

二、培训考核内容为有关餐饮食品安全的法律法规知识、基础知识及本单位的食品安全管理制度、加工制作规程、食品安全管理技能、食品安全事故应急处置知识等。

三、培训可采用专题讲座、实际操作、现场演示等方式。

考核可采用询问、观察实际操作、答题等方式。

四、食品安全管理人员在从事相关食品安全管理工作前，应取得餐饮服务食品安全培训合格证明。

食品安全管理人员完成培训后，应参加市场监督管理部门组织的考核。

五、食品安全管理人员原则上每年应接受不少于40小时的餐饮服务食品安全集中培训。

六、其他从业人员原则上每年应接受不少于12小时的餐饮服务食品安全培训。

使用卫生杀虫剂和杀鼠剂的人员应经过有害生物防制专业培训。

七、其他从业人员应在食品安全培训考核合格后方可上岗。

八、餐饮服务单位应对食品安全知识培训、考核情况等资料进行整理归档。

3、餐饮从业人员健康管理制度

一、从事接触直接入口食品工作的从业人员（包括新参加和临时参加工作的从业人员）应取得健康证明后方可上岗，并每年进行健康检查取得健康证明，必要时应进行临时健康检查。

学校食堂从业人员的健康证明应在学校食堂显著位置进行统一公示。

二、患有霍乱、细菌性和阿米巴性痢疾、伤寒和副伤寒、病毒性肝炎（甲型、戊型）、活动性肺结核、化脓性或者渗出性皮肤病等国务院卫生行政（卫生健康）部门规定的有碍食品安全疾病的人员，不得从事接触直接入口食品的工作。

三、应实行每日晨检，食品安全管理人员每天对从业人员上岗前的健康状况进行检查。

发现患有发热、腹泻、咽部炎症等病症及皮肤有伤口或感染等可能影响食品安全疾病的从业人员，应暂停从事接触直接入口食品的工作，必要时进行临时健康检查，待查明原因并将有碍食品安全的疾病治愈后方可重新上岗。

手部有伤口的，使用的创可贴宜颜色鲜明，并及时更换。

佩戴一次性手套后，可从事非接触直接入口食品的工作。

四、应建立健康管理档案，对从业人员的健康体检情况、晨检情况等资料进行整理归档。

4、餐饮从业人员个人卫生管理制度

一、从业人员应当养成良好的个人卫生习惯。

进入工作岗位前应当穿戴清洁的工作衣帽。

进入食品处理区的非加工制作人员，应符合从业人员卫生要求。

二、从业人员不得留长指甲、涂指甲油及在加工场所内吸烟等行为。

工作时，工作帽应能将头发全部遮盖住，不得披散头发，佩戴的手表、手镯、手链、手串、戒指、耳环等饰物不得外露。

三、专间的从业人员应佩戴清洁的口罩。

四、专用操作区内从事下列活动的从业人员应佩戴清洁的口罩：

现榨果蔬汁加工制作；果蔬拼盘加工制作；加工制作植物性冷食类食品（不含非发酵豆制品）；对预包装食品进行拆封、装盘、调味等简单加工制作后即供应的；调制供消费者直接食用的调味料；备餐。

其他接触直接入口食品的从业人员，宜佩戴清洁的口罩。

五、从业人员在加工制作食品前，应洗净手部，手部清洗符合《餐饮服务从业人员洗手消毒方法》。

六、从事接触直接入口食品工作的从业人员，加工制作食品前应洗净手部并进行手部消毒。

七、加工制作过程中，应保持手部清洁。

出现下列情形时，应重新洗净手部：

加工制作不同存在形式的食品前；清理环境卫生、接触化学物品或不洁物品（落地的食品、受到污染的工具容器和设备、餐厨废弃物、钱币、手机等）后；咳嗽、打喷嚏及擤鼻涕后；使用卫生间、用餐、饮水、吸烟等可能会污染手部的

，佩戴前应对手部进行清洗消毒。

手套应清洁、无破损，符合食品安全要求。

手套使用过程中，应定时更换手套，出现需要重新洗手消毒的情形时，应在重新洗手消毒后更换手套。

手套应存放在清洁卫生的位置，避免受到污染。

九、工作服宜为白色或浅色，应定点存放，定期清洗更换。

从事接触直接入口食品工作的从业人员，其工作服应及时清洗更换。

食品处理区内加工制作食品的从业人员使用卫生间前，应更换工作服。

工作服受到污染后，应及时更换。

待清洗的工作服不得存放在食品处理区。

清洁操作区与其他操作区从业人员的工作服应有明显的颜色或标识区分。

专间内从业人员离开专间时，应脱去专间专用工作服。