《科研仪器学》总复习Word格式文档下载.docx
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蛋白质组（proteome）是指基因组表达的全部蛋白质及其存在方式。
13．双向电泳技术
第一向:
等电聚焦（IEF）：
等电聚焦是利用蛋白质分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线形pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。
第二向:
SDS-PAGE电泳：
SDS-PAGE电泳是根据SDS和还原试剂将蛋白质分子解聚后亚基的大小，在恒定的pH缓冲系统中的分离。
经过双向电泳能将蛋白质在一个二维平面分开。
14．生物质谱技术
质谱技术是蛋白质组学研究中最为广泛使用的蛋白质鉴定技术。
其基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比（M/Z）的差异来分离并确定分子质量。
质谱技术能从复杂的样本中定性、定量分析蛋白质，其灵敏度高，可达到fmol（10-15）乃至amol（10-18），速度快，现已经成为蛋白质组研究中主要的蛋白质鉴定技术。
15．肽质量指纹图谱
MALDI-TOF-MS常用于蛋白质的肽质量指纹图谱（peptidemassfingerprinting，PMF）鉴定。
PMF是指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。
由于每种蛋白质的氨基酸序列不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物质量数亦具特征性，所以称为指纹图谱（fingerprinting）。
16．基质辅助离子化技术
试样溶解或悬浮于基质中，激光束辐射到基质和试样分子上。
基质吸收激光束能量后汽化，部分试样分子伴随基质的汽化而解吸。
基质吸收大部分激光能量，减少了试样分子被激光能量破坏及过度电离成碎片离子。
17．超声空化
超声波清洗的基本原理是基于超声在液体中的空化作用，当声压或声强达到一定值时，清洗液中的气泡迅速增长，然后突然闭合。
在气泡闭合时，产生冲击波，在气泡周围产生1012～1013Pa的压力及局部高温，这种物理现象称为超声空化
18、基因枪法
又称生物弹法或微粒枪法、微粒轰击法，是依赖高速度的金属颗粒将外源基因引入活体细胞的一种转化技术。
19、Westernblot（蛋白质印迹技术）
将蛋白质用聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子大小分开，再将蛋白质转移到尼龙膜或其他膜上，用抗体作为探针与之杂交，反应之后用放射自显影或底物显色来检测是否与抗体特异性结合的抗原。
与DNA和RNA不同的是，蛋白质的转移只有靠电转移方可完成，反应时用碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶标记或同位素标记第二抗体，
二、填空
1、使用流式细胞仪检测细胞周期、细胞DNA、RNA含量、总蛋白质含量用（线性）放大器，检测细胞表面表面抗原、膜受体分布（对数）放大器。
2、影响DNA测序的因素：
模板的影响、循环测序反应条件、电泳的影响。
3、染色细胞核的染料：
Hoechst33258（蓝）、DAPI（蓝）、FITC（绿）、PropodiumIodide（红）、CY3（红）。
4、细胞融合的方法（电融合、聚乙二醇融合、病毒融合）。
5、激光共聚焦显微镜的原理是利用（一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光）的成像。
6、细胞穿孔的方法（电穿孔、磷酸钙沉淀法、激光钻孔法、微射弹法）。
7、酶标仪中的光学检测方法（光度测定、荧光、时间分辨荧光、荧光偏振、化学发光）。
8、DNA测序的主要方法（新生链的荧光标记、双脱氧末端终止法）。
9、用于提取纯化生物大分子理化性质的离心机（分析性离心机），用于实验的（制备型离心机）。
10、流式细胞术前向散射（FSC，小角散射），大小与细胞直径成正比，细胞越大，FSC越大；
侧向散射（SSC，90°
散射），与细胞内颗粒结构成正比，胞内颗粒结构越复杂质量越大，SSC越大。
11、Ca2+荧光指示剂包括：
Fura-2、indo-1、Quin-2。
12、全自动DNA测序仪主要包括电泳系统、激光器和荧光检测系统；
大致可分为自动进样器区、凝胶块区和检测区等结构功能区。
13、全自动DNA测序仪根据电泳方式的不同分为平板型电泳和毛细管电泳两种仪器类型
14、DNA测序过程包括：
分离纯化模板DNA、DNA模板定量分析、测序反应、测序反应后纯化、on-line变性、毛细管电泳和检测和数据分析。
15、DNA测序过程中，用荧光标记新生链时，分为多色标记法和单色标记法；
根据标记部位不同，又分为荧光标记引物法和荧光标记终止底物法。
16、激光共聚焦显微镜由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成。
17．常规PCR技术包括变性、退火、延伸三个基本反应步骤。
18．常规PCR反应体系由缓冲液、模板DNA、引物、4种脱氧核糖核苷三磷酸、TaqDNA聚合酶和Mg2+组成。
19．蛋白质的分离纯化方法中，透析、超过滤、分子筛层析、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等就是依据蛋白质分子大小进行分离纯化蛋白质的。
20．蛋白质的分离纯化方法中，等电点沉淀、离子交换层析、等电聚焦电泳等都是依据不同蛋白质带电性质不同来分离纯化蛋白质；
21．蛋白质细分级方法有分子筛层析、离子交换层析、亲和层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向电泳、毛细胞电泳、等电聚焦电泳等
22．蛋白质粗分级方法有硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀、超速离心、等电点沉淀、透析、超滤等。
23．蛋白质组研究核心技术包括蛋白质分离技术（如双向电泳和多维液相层析）、蛋白质鉴定方法（如氨基酸序列分析和质谱技术）和生物信息学技术。
24．质谱仪关键部件是离子源和质量分析器是两个关键的部件。
其中质量分析器决定着质谱的准确度、灵敏度和分辨率等。
25．核酸分子杂交探针标记有同位素和非同位素标记两种，其中，非同位素标记物主要有生物素、地高辛配体、荧光素等。
26.电磁力平衡式电子天平最有代表性，其基本结构由托盘、磁铁、线圈、横梁、防护罩等组成。
27．国家对分析实验室的用水规格进行了技术规定，将其分为三个级别。
其中一级水用于要求严格的分析实验，如液相色谱分析用水等；
二级水用于无机痕量分析，如原子吸收光谱分析用水等；
三级水用于一般化学分析实验。
28.超声波破碎仪由超声波发生器和换能器两部分组成。
29.CO2培养箱使用时影响实验结果的因素有：
二氧化碳浓度、湿度、温度。
30.冻干机按系统可分为制冷系统、真空系统、加热系统和控制系统四个主要部分。
31.高效液相色谱仪总体可分为4个部分，即进样系统、高压输液系统、分离系统和检测系统。
32.超净工作台按其工作性能分为两大类：
一类为正压型超净工作台，另一类生物安全超净工作台，又称为生物安全柜。
34.影响电子天平称量精度的因素有预热时间、预压、读数时间、样品本身自然物理特性和变化造成的影响。
35.水的纯化技术：
蒸馏、离子交换、反渗透、电渗析、电析去离子技术、微孔过滤、消毒灭菌。
36.影响移液器准确性的因素：
操作错误、移液器损坏、操作条件的影响。
三、简答
1PCR的原理
DNA在高温时也可以发生变性解链，当、温度降低后又可以复性成为双链。
通过温度变化控制DNA的变性和复性，设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP，可完成特定基因的体外复制。
高温变性，低温退火，适温延伸
2流式细胞术的特点。
1、实现对单列细胞的检测
2、实现高通量检测
3、多参数、多色荧光分析使对细胞识别技术更精确
4、可定性定量分析细胞
5、分选特定功能、性状的细胞
3电穿孔仪与细胞融合仪的基本原理。
电穿孔仪：
细胞膜基本上是一绝缘体，膜两侧浸在含离子的电解质溶液中，在外加电场时，膜两边的电解质离子极化，形成外加膜电位差。
高压电脉冲击穿细胞膜后，磷脂双分子层和细胞膜均可复原。
细胞膜的复原不但与脂肪分子的排列和相互间引力有关，还与其他重要因素有关，如胶体渗透作用、溶液离子作用和膜蛋白的影响等。
细胞融合仪：
通过非均匀电场的电介质电泳作用，建立细胞（原生质体）间的紧密接触，形成细胞串。
再利用高压脉冲的可逆击穿效应使接触区质膜上形成微孔，胞质通过微孔融合。
4流式细胞仪的构成模块。
流动室与液流系统、光源与光学系统、信号收集与信号转换系统、计算机与分析系统、分选系统。
5荧光检测酶标仪的主要模块。
1、一个激发光源（卤素灯氙灯、激光）
2、荧光色团（染料）
3、波长选择元件：
滤光片对或光栅（区分激发光和发射光）
4、检测发射光的检测器（光电倍增管,PMT）
6超速离心机的主要使用注意事项。
1、离心前预冷转子
2、超速离心时，液体一定要加满离心管，避免离心管变形
3、离心后清洁离心机腔体和转头，并擦干腔内冷凝水，打开门，直至腔内恢复常温
7简述影响点穿孔仪和细胞融合仪的因素。
1、采用指数型衰减波优于使用方形波
2、达到临界电压，否则无法击穿细胞膜
3、对于细菌由于有外膜，临界电压需要加大1～2个数量级。
8分光光度计理想的光源条件是：
1、提供连续的辐射；
2、光强度足够大；
3、在整个光谱区内光谱强度不随波长有明显变化；
4、光谱范围宽；
5、使用寿命长，价格低。
9、双脱氧链末端终止法的原理：
其原理是利用DNA的体外合成过程，但与普通PCR不同的是，双脱氧链末端终止法测序反应中除有-脱氧核苷三磷酸（dNTP）外，还加入2’-双脱氧核苷三磷酸（2’-ddNTP），由于没有-OH，不能进行后续反应，使正在延伸的DNA链在此终止。
由于存在ddNTP与dNTP的竞争，生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段，通过电泳分离后可读出新生DNA链的序列
10．简述荧光定量PCR定量原理及计算方法
反应最初，虽然产物是指数增长,但是荧光处于背景水平，检测不到荧光增加.当累积
了足够的扩增产物，可以产生可检测的荧光信号时，这个循环数叫初始循环数，即CT。
由于CT值处于指数期内，这时的反应成份不会抑制扩增反应进行，因此荧光定量PCR结果是可靠的，可以准确地反应体系中模板的初始量。
如果产物在每一循环都加倍，荧光曲线之间的间距由等式“2n=稀释倍数“决定；
n为阈值线上扩增曲线之间的循环数（CT的差值）例如：
10倍稀释的DNA样品，2n=10因此n=3.32，即CT值相差3.32个循环。
11．荧光定量PCR的应用
（1）实时监测产物量，计算初始模板量
（2）基础研究的基因表达分析研究
（3）临床病原体检测：
病人体液中目标基因的检测：
病毒,寄生虫,细菌
（4）食品卫生检疫：
a.转基因食品的检疫：
根据转入基因的特异性区段设计探针b.食品中病原微生物的检测
12．蛋白质分离纯化与鉴定的主要步骤
（1）选择实验材料
（2）实验材料的预处理
（3）蛋白质的提取
（4）蛋白质粗分级
（5）蛋白质细分级
（6）蛋白质的鉴定
13．蛋白质鉴定的相关要素
（1）蛋白质分子质量
（2）等电点
（3）氨基酸组成及其顺序
（4）免疫特性
（5）结晶特性
（6）生物学功能
14．核酸分子杂交技术的原理
有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。
如把一段已知基因（DNA或RNA）核酸序列用合适标记物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，当作探针（probe）,与变性后的单链基因组DNA或RNA进行杂交。
再用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列是否存在、拷贝数及表达丰度等。
15．电子天平的工作原理
基于通电导线在磁场中受到安培力的作用。
当秤盘上放有被称量物体时，秤盘向下发生线性位移，触动电磁传感器，使原来处于平衡状态的两个光敏三极管在发光二极管的光量发生变化时产生电流，此电流经放大后反馈到磁铁内的线圈中，使受力增大，将秤盘托起，恢复至平衡位置。
此时流经线圈的电流通过取样电阻时，产生电压降，电压值与被称量物体的质量成正比。
电压信号经过放大、滤波等处理后，进行模／数转换。
电流模拟信号转变成数字信号后，再经芯片处理，最终在显示器上显示出质量值。
16.基因扩增的技术设备组成。
由三部分构成：
①模板DNA制备所需设备，主要为高速微量离心机或高速冷冻离心机；
②PCR基因扩增仪；
③DNA扩增结果判读和测定设备，主要有水平低压电泳仪、PCR核酸电泳槽以及紫外透射仪和DNA微量荧光计等。
17.使用电子天平的注意事项
1）在称量之前，特别是称量大量物质或连同容器一起称量时，一定要判断所称重总量是否在使用天平的称量范围之内，如超出称重范围，往往会引起天平故障。
2）精确度高的天平常会因环境空气流动而引起称量结果漂移，造成测定结果不稳定，有些型号的仪器带有调整功能，可缩短称量时间。
3）电子天平属精密仪器，应避免震动，减少移动。
4）称量结束后在取走称量物之前应先关闭电源。
5）天平周围及称量盘面应保持清洁。
18.使用高压灭菌锅的注意事项
1、易燃，易爆物品，禁用高压蒸气灭菌；
锐性器械，不宜用此法灭菌；
2、敷料包包扎及体积的影响：
包裹不应过大、过紧；
捆扎不宜过紧；
包装使用的容器宜小而浅，并应带有通气孔。
瓶装液体灭菌时，要用玻璃纸和纱布包扎瓶口；
如有橡皮塞时，应插入针头排气；
3、物品排列疏密的影响：
消毒物品的体积不应超过灭菌室容积的85％。
4、降温时待温度自然降至60℃以下再打开箱门取出物品，以免因温度过高而骤然降温导致玻璃器皿炸裂。
5、在灭菌过程中，应注意排净锅内冷空气，锅内冷空气如排放不净，会影响灭菌效果，达不到彻底灭菌的目的。
因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。
6、在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。
其原因有三：
一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；
三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ的热量。
这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
7、由于高压蒸汽灭菌时，要使用温度高达120℃、两个大气压的过热蒸汽，操作时，应有专人负责，每次灭菌前，应检查安全阀的性能，严格按照操作规程操作，以防压力过高发生爆炸，保证安全使用。
8、一般认为按常规操作消毒物品就能无菌，这实际是一种错误观念。
按常规操作只是一种正常消毒过程，并不能证明消毒物品已全部无菌，因此还要对灭菌效果进行测定。
最普通的检验方法是将灭菌培养基放在37℃温箱培养24小时若无杂菌生长说明灭菌效果良好。
19.超低温冰箱警报器启动报警的原因
检查电源是否有问题或插头是否被拉出插座；
检查内部温度计是否超出合适的范围；
检查是否一次性置人物品过多。
20.冻干过程中有两个放热过程和两个吸收过程。
液体制品放出热量凝固成固体制品；
固体制品在真空下吸收热量升华成水蒸气；
水蒸气在冷凝器中放出热量凝华成冰霜；
冻干结束后冰霜在冷凝器中吸收热量熔化成水。
21.水蒸气的流动阻力来自以下几个方面：
1）产品内部的阻力。
水分子通过已经干燥的产品产生的阻力，这个阻力的大小与干燥层的结构和产品的种类、成分、浓度、保护剂等有关。
2）容器阻力。
容器的阻力主要来自瓶口，因为瓶口处截面积较小，瓶口处可能还有某些其他物品如带槽的橡皮塞、纱布等造成阻力。
总之，瓶口截面积越大则阻力越小。
3）机器本身的阻力。
主要是冻干箱与冷凝器之间管道的阻力，管道粗、短、直则阻力小。
另外阻力还与冻干箱和冷凝器的结构和几何形状有关
22.基因枪的基本原理
经适当处理后，使DNA液均匀地吸附在或包裹于微小的钨粉或金粉颗粒表面，利用基因枪的火药爆炸、高压放电或高压气体作驱动力，发射出微弹与DNA的复合体，击中并高速穿透真空室中受体细胞的细胞壁及细胞膜，进入细胞内，从而达到将吸附于微弹上的外源DNA导人细胞或原生质体，获得整合与表达的目的。
微弹复合体对受体细胞造成的损伤可以修复。
23.激光共聚焦显微镜的工作原理？
在它的光收集通道上包括两个光学系统：
一是传统的光学组件，二是共聚集光圈。
所谓Confocal共聚焦是指检测聚集光斑与检测点完全重合。
这种光学结构保证了在聚集外部的光线不能达到信号探测器中。
在共聚焦图像系统中的基本原则是：
“只有聚集点是亮的，其余都是暗的”。
由于这种简单明了的原理使得它的应用中有极大的灵活性。
通过改变聚焦光圈，可以改变扫描光束的密度从而优化所选用的光源。
通过光级NA透镜最小可形成大约0.5微米的扫描光斑。
自由变换聚焦尺寸在检测较弱荧光时极为重要，它可以在图形质量及荧光亮度之间相互协调。
四、问答
1、激光共聚焦显微镜相较于普通显微镜的优势在哪里；
此外，请简述激光共聚焦显微镜的应用。
激光共聚焦显微镜能够形成完全聚集的3D样本图形。
定位不同的荧光染料在3D样本图形中的着色位置。
精确测量二维、三维平面及空间结构。
具有识别空间位置的能力从而进行三维坐标定位。
节省标本处理时间很少需要进行样本包埋用显微切片。
应用：
1、检测被一种或多荧光染料标记的样本
2、检测样本荧光着色位置或其他特征
3、完整观察新鲜或固定样本内部结构
4、在活细胞或组织中描绘标记离子的荧光染料
5、全程监控GFP转染后的细胞或组织
2、冷冻干燥机的工作原理及对冻干制品的质量要求。
冷冻干燥机的工作原理是将被干燥的物品先冻结到三相点温度以下，然后在真空条件下使物品中的固态水份（冰）直接升华成水蒸气，从物品中排除，使物品干燥。
物料经前处理后，被送入速冻仓冻结，再送入干燥仓升华脱水，之后在后处理车间包装。
真空系统为升华干燥仓建立低气压条件，加热系统向物料提供升华潜热，制冷系统向冷阱和干燥室提供所需的冷量。
本设备采用高效辐射加热，物料受热均匀；
采用高效捕水冷阱，并可实现快速化霜；
采用高效真空机组，并可实现油水分离；
采用并联集中制冷系统，多路按需供冷，工况稳定，有利节能；
采用人工智能控制，控制精度高，操作方便。
对冻干制品的质量要求是：
生物活性不变、外观色泽均匀、形态饱满、结构牢固、溶解速度快，残余水分低。
要获得高质量的制品，对冻干的理论和工艺应有一个比较全面的了解。
冻干工艺包括预冻、升华和再冻干三个分阶段。
合理而有效地缩短冻干的周期在工业生产上具有明显的经济价值。
3、分光光度计吸收池的使用注意事项：
①要彻底清洗，尤其是盛过蛋白质等溶液，干后形成一层膜，不易洗去，通常杯子不用时可放在1％洗洁净液中浸泡，去污效果好，使用时用水冲洗干净，要求杯壁不挂水珠，还可以用绸布丝线或软塑料制作一个小刷子清洗杯子。
②严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。
严禁用硬纸和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和绸布。
③严禁加热烘烤。
急用干的杯子时，可用酒精荡洗后用冷风吹干。
决不可用超声波清洗器清洗。
④吸收池的校正：
要固定参比杯和样品杯，可在杯的毛玻璃面上写上记号。
用盛有参比液的参比杯和样品杯测定吸光度“A0”，样品杯换上样品液后测定的吸光度为“A1”，则校正后的实际吸光度A为：
A=A1-A0
高档的分光光度计有自动置零系统，可将二个杯子的偏差置零。
其他重要附件：
高档分光光度计的样品室还可以更换各种重要附件，用于各种特殊量测。
如换上“积分球”，可用来检测微弱透光和不透光的样品。
换上“凝胶扫描装置”，可用于电泳凝胶胶条上样品带的扫描测量。
4、如何使用荧光检测技术对细胞凋亡进行检测：
Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。
Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。
但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
设计出荧光物质偶联的短肽Z-DEVD-AMC。
在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。
根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。
5、如何使用分光光度计对核酸进行定量。
核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。
可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。
核酸的最高吸收峰的吸收波长260nm。
每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。
定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。
如：
1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。
测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。
测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。
然而，实验并非一帆风顺。
读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。
灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
6、荧光标记引物法和荧光标记终止底物法的异同点。
1、都确定了4种荧光染料与4种ddNTP所终止的DNA片段之间的专一对应关系
2、荧光标记引物法使荧光有色基团标记在长短不同的DNA片段的端，可理解为荧光染料标记过程和延伸反应终止分别发生在同一DNA片段的两端，且标记发生在引物与模板的退火过程中，而终止是发生在片段延伸过程中，两者在时间上有一定间隔
3、荧光标记终止底物法使标记和终止过程
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