DNA提取及测定含量的高级分子生物学实验方案Word文档格式.docx

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白，从而破坏细胞膜。

b解聚细胞中的核蛋白。

c能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。

SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便下一步试验的更好进行。

3、溶液Ⅲ：

pH4.8乙酸钾溶液（60ml5mol/LKAc，11.5ml冰醋酸，28.5mlH2O）；

该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L.pH4.8的乙酸钾溶液是为了把抽提液的pH调至中性，从而使变性的质粒DNA复性，且稳定存在。

溶液III加入后的沉淀实际上是K+置换了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚，使得沉淀更完全。

前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的盐形式复合物。

4、无水乙醇：

乙醇可以以任意比和水相混溶，而DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，同时乙醇与核酸不起化学反应，因此是理想的沉淀剂。

加入的乙醇后，乙醇会夺去DNA周围的水分子，DNA失水聚合。

一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。

也可改用95％乙醇来替代无水乙醇。

但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。

折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。

也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。

一般在室温下放置15－30min即可。

但因为使用异丙醇时常把盐沉淀下来，所以较多的还是使用乙醇。

5、pH8.0TE缓冲液：

10mmol/LTris－HCl，1mmol/LEDTA，其中含RNA酶20ug/ml。

在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分干扰作用。

磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围（pH），可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3（PO4）2沉淀；

在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。

酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。

用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。

在中性或碱性条件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。

6、70％乙醇

试验步骤:

1.将2ml菌液装在2ml离管心中，13000rpm，离心30S，弃上清液，收集菌体。

2．加入150μlSolⅠ重悬菌体，可用枪头剧烈振荡。

3．加入150μlSolⅡ（0.4MNaOH、2%SDS，各75ul），小心轻混，缓慢上下颠倒2-3次，冰浴5min，此时溶液呈粘稠状。

4．加入150μlSolⅢ，小心轻混，缓慢上下颠倒2-3次，冰浴5min，有白色絮状沉淀。

5．13000rpm,离心5min，取上清液。

6．加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25:

24:

1）混合物，小心轻混。

13000rpm，离心2min，取上清液。

7．加2倍体积无水乙醇（约1ml），置于-20℃,醇沉30-60min。

（醇沉时间可加长，增加提取质粒浓度，可醇沉过夜）。

8．将混合液在4℃，13000rpm，离心5min，弃乙醇。

9．加入1ml70%乙醇洗沉淀，4℃，13000rpm，离心5min，弃乙醇，倒置于滤纸上，自然干燥约5-8min。

10．加入20μlTE缓冲液和1μlRNase待质粒溶解后于4℃保存。

注意事项：

提取过程应尽量在低温环境中进行，蛋白质的去除以酚/氯仿混合效果最好，可以采取多次抽提尽量将蛋白质除干净，在沉淀DNA时通常使用冰乙醇，在低温条件下放置可使DNA沉淀完全。

同时反应中加入的盐浓度一定要控制好，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钾盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的钾溶液浓度太高时，其效果也不好。

在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

一般情况下都是加入的最终浓度达0.1～0.25mol/L为宜。

实验二、PCR基本原理与操作流程

聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。

典型的PCR由

（1）高温变性模板；

（2）引物与模板退火；

（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。

其主要步骤是：

将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；

人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；

耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。

PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。

因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。

它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。

通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：

（1）生成双链DNA中的特异序列作为探针；

（2） 

由少量mRNA生成cDNA文库；

（3）从cDNA中克隆某些基因；

（4）生成大量DNA以进行序列测定；

（5）突变的分析；

（6）染色体步移；

（7）RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。

一、试剂准备

1.DNA模版

2．对应目的基因的特异引物

3．10×

PCRBuffer

4．2mMdNTPmix：

含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步骤

1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

10×

PCRbuffer 

5μl

dNTPmix（2mM） 

4μl

引物1（10pM） 

2μl

引物2（10pM） 

Taq酶（2U/μl） 

1μl

DNA模板（50ng-1μg/μl）　 

1μl

加ddH2O至 

50μl

视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

2．调整好反应程序。

将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。

一般：

在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：

93℃40s→58℃30s→72℃60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。

3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

4．PCR的电泳检测：

如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；

否则，直接取5-10μl电泳检测。

三、PCR反应体系的组成与反应条件的优化

　PCR反应体系由反应缓冲液（10×

PCRBuffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分组成。

各个组份都能影响PCR结果的好坏。

1．反应缓冲液：

一般随TaqDNA聚合酶供应。

标准缓冲液含：

50mMKCl，10mMTris-HCl（pH8.3室温），1.5mMMgCl2。

Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。

浓度过高，使反应特异性降低；

浓度过低，使产物减少。

在各种单核苷酸浓度为200μM时，Mg2+为1.5mM较合适。

若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。

在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。

据经验，一般以1.5-2mM（终浓度）较好。

2．dNTP：

高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增；

但浓度过低，将降低反应产物的产量。

PCR中常用终浓度为50-400μM的dNTP。

四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。

此外，dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。

3．TaqDNA聚合酶酶：

在100μl反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每min延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。

酶量过多将导致产生非特异性产物。

但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。

当降低反应体积时（如20μl或50μl），一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。

4．引物：

引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。

要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：

1）引物的长度以15-30bp为宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55℃［Tm=4（G+C）+2（A+T）］。

应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。

2）引物的3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。

3’端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。

两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。

3）人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换HPLC进行纯化。

4） 

引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：

一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。

一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。

一般用0.25-0.5pM/μl较好。

5）引物一般用TE配制成较高浓度的母液（约100μM），保存于-20℃。

使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。

5．模板：

PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。

虽然PCR可以用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的DNA）作为摸板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用μg水平的基因组DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。

原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。

6．PCR循环加快，即相对减少变性、复性、延伸的时间，可增加产物的特异性。

四、注意事项

１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。

最好设立一个专用的PCR实验室。

２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。

一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。

３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。

操作过程中均应戴手套。

４．PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。

５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。

６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。

７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。

实验三、双酶切反应操作过程

本实验学习用限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）EcoRI和BamHI切割质粒pBR322DNA，琼脂糖凝胶电泳后观察酶切结果。

　　【原理】

　　EcoRI酶可识别DNA中G↓AATTC核苷酸序列，并在箭头处将其切开。

pBR322DNA为人工构建的质粒DNA,分子大小为4.3kb，含有1个EcoRI和BamHI酶切点，切割后由环状DNA变为线形DNA。

　　【材料】

　　1．质粒pBR322DNA（0.25ug/ul）

　　2．限制性内切酶EcoRI

　　3．EcoRI和BamHI酶切缓冲液（Buffersolution10×

）

　　4．去离子水

　　5．电泳及染色用材料

　　【方法】

　　1．取洁净EP管2只，按表-1加入各成分。

　　2．混匀，放37℃水浴1-2h。

65℃水浴10min，再放4℃冰箱8min终止反应。

部分酶切DNA片段用于DNA连接实验，另一部分放4℃冰箱，待琼脂糖凝胶电泳检测。

　　表1酶切反应体系

成分

用量

10×

Kbuffer

2μl

BamHⅠ

EcoRⅠ

pBR322DNA

ddH2O

4μl

Totalvolume

10μl

一、建立一个标准的酶切反应

目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。

通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1XNEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。

如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；

如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。

二、选择正确的酶

不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。

识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。

假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；

而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。

内切酶的产物可以是粘端的（3'

或5'

突出端），也可以是平端的片段。

粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。

相关信息参见目录的CompatibleCohesiveEndsAndRecleavableBluntEnds一文。

三、酶

内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。

酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。

酶的用量视在底物上的切割频率而定。

例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。

参见目录第244和264之"

切割质粒DNA"

和"

包埋法切割DNA"

。

四、DNA

待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。

DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。

关于甲基化的内容，参见第252页至253页之甲基化相关内容。

五、缓冲液

对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。

使用时的缓冲液浓度应为1X。

有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。

在这种情况下，我们也相应提供100X的BSA（10mg/ml）。

不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。

关于缓冲液更详细的信息参见第234页。

六、反应体积

内切酶活力单位的定义是：

1小时内，50μl反应体积中，降解1μg的底物DNA所需的酶为一个活力单位。

因此酶：

DNA的反应比例可以由此确定。

较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。

为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%（一般酶都贮存于50%的甘油中）。

七、混合

这是非常重要然而常常被忽略的一步。

想要反应完全，必须使反应液充分混合。

我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。

注意：

不可振荡！

八、反应温度

大部分酶的反应温度为37℃；

从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。

一般为50-65℃不等。

参看第244页Activityofthermophilesat37℃。

（请参看商品目录！

！

）

九、反应时间

酶活单位的定义时间为1小时。

如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间；

反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全。

参见第241页酶在反应中的存活时间。

十、终止反应

如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。

在NEB我们使用如下反应终止液：

50%的甘油，50mMEDTA（pH8.0），和0.05%溴酚蓝（10μl/50μl反应液）。

如果要进行下一步酶切反应，可用热失活法终止反应（65℃或85℃，20分钟）。

热失活并不能适用于所有的酶，详情参见第240页热失活表。

此外，酚/氯仿抽提也可以用于终止反应。

十一、贮存

大部分酶应贮存于-20℃。

少部分酶则须在-70℃长期保存。

详情请参见相关酶的DATASHEET或目录相关部分。

10XBUFFER和100XBSA于-20℃保存。

BSA不能与NEBuffer混合后保存，否则将会出现BSA沉淀。

十二、稳定性

每隔1-2个月都会对所有的酶有一个活性检测；

最近的一次检测结果将被贴在售出的每一管酶上。

通过三十多年来的经验，我们发现大部分酶在推荐的保存缓冲液里在-20℃条件下十分稳定。

高于-20℃条件下稳定性将有所降低。

十三、对照反应

如果发现您的DNA底物不能被成功切开，可以进行对照实验以查明原因。

具体方法如下：

将不加内切酶的底物DNA（待切底物）与加入了内切酶的对照DNA（有多个已知酶切位点）同时进行反应。

若实验结果表明底物DNA降解，则说明DNA在纯化过程中或反应液里引入了核酸酶污染；

若实验结果发现底物DNA保持完整，而对照DNA被成功切开，则可以排除酶质量的原因，此时可以将对照DNA和待切底物DNA混合起来再次进行反应，以确定样品中是否有抑制剂。

如果有抑制剂存在（通常是盐、EDTA或酚），则混合物里的对照DNA也无法被切开。

实验四、质粒、PCR及双酶切产物电泳及结果观察

实验原理：

琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片断的典型方法，其特点为简便、快速。

DNA片断琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同，DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构想有关。

对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。

在凝胶中加入少量溴化乙锭（有毒！

），其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种光络合物，在254~365nm波长紫外光照射下，呈现桔红色的荧光，因此可对分离的DNA进行检测。

电泳时以溴酚蓝及二甲苯氰（蓝）作为双色电泳指示剂。

其目的有：

①增大样品密度，确保DNA均匀进入样品孔内；

②使样品呈现颜色，了解样品泳动情况，使操作更为便利；

③以0.5×

TBE做电泳液时溴酚蓝的泳动率约与长300bp的双链DNA相同，二甲苯氰（蓝）则与4bp的DNA相同。

线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系

琼脂糖凝胶的百分浓度（%）

分离线状DNA分子的有效范围（kb）

0.3

60~5

0.6

20~1

0.7

10~0.8

0.9

7~0.5

1.2

6~0.4

1.5

4~0.2

2.0

3~0.1

操作方法

（1）琼脂糖溶液的制备：

配0.7%琼脂糖，在沸水浴中煮沸直到完全溶解；

将溶液冷却到约50~60℃，加入溴化乙锭到终浓度为0.5ug/ml。

（2）将琼脂糖溶液倒入电泳支架上，放上梳子，梳子须离开电泳支架底部1mm左右。

待凝胶凝聚后，小心拔去梳子，将支架放入装有电极缓冲液的电泳槽中，电极缓冲液应淹没过胶。

（3）电泳

取薄膜，滴加上样缓冲液和DNA样品5~10ul，混匀，用微量移液器加入样品槽中。

点样端朝负极，通电。

电压为10v/cm。

至溴酚蓝移到距边1cm处，取出凝胶，紫外灯下检测。

试剂配制：

5ⅹTBE溶液：

54gTris，27.5g硼酸，4.6gEDTANa2溶于去离子水中，定容至1L。

电泳时10倍稀释使用。

5ⅹ上样缓冲液：

用5×

TBE溶液配制0.5%溴酚蓝，再加等体积甘油混匀。

溴化乙锭溶液：

5mg/m