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2基于金纳米颗粒的生物小分子分析检测体系
2.1三磷酸腺（ATP）检测
三磷酸腺（ATP）是体内的储能载体，在许多生理和病理过程中起着重要的作用，如当细胞凋亡或坏死诱导的线粒体破坏时，细胞内的ATP含量会降低，因此快速检测体内的ATP含量是非常重要的[4]。
基于未修饰金纳米颗粒和ATP的适配体可构建高灵敏度的传感器用于检测ATP[5]o改进后的方法还可以用于检测[6]。
利用
ATP诱导的金纳米颗粒组装体分散的原理可以构建一种可视化检测ATP的通用新方法，这个传感器主要包含3部分，两种DNA修饰的金纳米颗粒和一个可以识别ATP并且可以与这两种DNA配对的DNA,它们由于可以相互配对而使金纳米颗粒聚集，金纳米颗粒溶液的颜色就会从红色变为紫色。
当加入ATP时，由于ATP与其适配体具有很强的作用，这样ATP就会使金纳米颗粒组装体解散而使金纳米颗粒分散，从而达到可视化检测ATP的目的［7］。
近期，利用适配体和包有SiO2的星形金纳米颗粒，结合表面增强拉曼技术（SERS）可以实现ATP的超灵敏的定量检测，检出限为12.4pmol/L［8］o以上基于金纳米颗粒的ATP可视化检测方法均可以达到高选择性检测ATP的目的，这些方法具有操作简便，价廉等优点，但是距实际应用还有一定的差距，这些方法还不能应用在复杂的实际样品中的ATP的检测，还需要深入研究以改善其实用性。
2.2多巴胺检测
多巴胺是一种最重要的神经递质，它在一些大脑功能上起了非常重要的作用。
多巴胺含量的异常可能与一些疾病有关，如帕金森症、精神异常等［9］。
因此快速简便的高灵敏度的检测多巴胺的方法是非常有应用前景的。
利用4疏基苯硼酸和二疏基丙酸马来酸酯修饰金纳米颗粒表而，由于多巴胺分子一端的胺基可以与马来酸酯反应，另一端的邻苯二酚与硼酸反应，多巴胺的加入使金纳米颗粒聚集，基于此原理，这种方法的检测限可以达到0.5—ol/L,并且
这种方法可以用在小鼠脑脊液中的多巴胺的检测（图1）［10］。
利用二铳基丙酸马来酸酯修饰的金纳米颗粒和Fe3+为交联剂发展了一种可视化检测多巴胺的方法，利用多巴胺通过胺基与修饰在金纳米颗粒表而的丙酸马来酸酯反应，使多巴胺就修饰在了金纳米颗粒的表面，Fe3+会与邻苯二酚结合而使金纳米颗粒聚集［11］。
研究发现，多巴胺可以增强牛血清蛋口质修饰的荧光金团簇的电致化学发光，利用这个性质可以选择性地检测多巴胺［12］。
由于多巴胺分子上的邻苯二酚与银纳米颗粒具有很强的相互作用，多巴胺加入会使银纳米颗粒聚集，根据这种现象可以构建一种可视化检测多巴胺的方法，这种方法具有很好的选择性，尿酸、抗坏血酸、葡萄糖等均不干扰多巴胺的检测。
此外，这种方法还具有很高的灵敏度，其检出限可以达到60—ol/L［13］o基于电化学的方法，利用金纳米颗粒和分子卬迹高分子也可实现对多巴胺的检测，检出限可达到7.8—ol/L［14］o这些多巴胺的检测结果具有较低的检出限，但仍不能满足对实际样品的检测需求，因此发展原位的、可靠性更高的多巴胺的可视化检测新方法仍然十分紧迫。
2.3葡萄糖检测
葡萄糖是生物体最基木的物质和生物过程中普遍存在的能量供给物，但是许多研究表明，肾性糖尿、囊性纤维化病、糖尿病等都与葡萄糖输送障碍有关［15］o因此葡萄糖的快速准确检测是非常重要的。
目前有许多基于金纳米颗粒可视化检测葡萄糖的方法。
采用碳化二亚胺，将葡萄糖氧化酶修饰在金纳米颗粒的表而，加入葡萄糖，使金纳米颗粒聚集，当葡萄糖的含量大于100mg/L时，金纳米颗粒溶液的颜色变为蓝色［16］。
利用金纳米颗粒的光学性质和串联反应，可以构建一种快速简便可视化检测脑脊液中葡萄糖的方法［17］。
基于过氧化氢引起的溶胶凝胶转变过程，可以构建一种可视化检测葡萄糖的新方法［18］。
基于传统的银镜反应和纳米材料优良的光学性质，发展了一种可视化检测还原性糖（葡萄糖）的方法（图2a）［19］o采用粒径13—的球形金纳米颗粒作为银镜反应的—放大介质，由于金纳米颗粒的存在，银镜反应所生成的单质银会沉积在纳米金上，形成一种类似金核银壳的结构。
反应后溶液颜色的变化与溶液中葡萄糖的浓度相关，可用于葡萄糖的定性及定量分析，其检测范围是40〜1000Umol/Lo在此工作基础上，木研究组利用表而带负电荷的棒状金纳米颗粒的富集作用和银纳米颗粒的特征表而等离子体共振吸收峰，发展了一种灵敏度较高的用于葡萄糖可视化检测方法（图2b）［20］。
在电荷相互作用下，表面带负电荷的金纳米棒会吸附大量银离子从而增加其局部浓度，当葡萄糖存在时会发生氧化还原反应，生成大量的银纳米颗粒。
我们还研究了材料表而的电荷性质对检测的影响，发现只有表而带有负电荷的纳米金材料才能通过电荷相互作用促使反应的发生。
值得注意的是，该体系中金纳米棒溶液浓度极低，不存在葡萄糖时溶液呈无色，加入葡
萄糖后溶液会呈现银纳米颗粒的亮黄色。
该方法的检测范围是
0.07〜4Umol/L,已成功用于人血浆中葡萄糖的测定。
这些葡萄糖的可视化检测方法大部分仍然停留在实验室研究阶段，检测结果的可靠性尤其在定量检测方而仍需要大量的实际样品来验证。
2.4尿酸检测
尿酸是人体内卩票吟核廿酸的代谢物，血清中高含量尿酸会引起痛风、关节炎等疾病，并且尿酸含量的异常会引起心血管、神经、肾等相关的疾病［21,22］。
因此人体内尿酸的检测是非常重要的。
由于目前许多临床上检测尿酸方法都采用酶和一些特殊的试剂，所以发展简便、价廉、快速检测尿酸的新方法是非常必要的。
Beg等［23］利用2硫尿喘噪修饰的金纳米颗粒可以构建一种可视化检测血清中尿酸的方法，该方法的检出限为0.5Umol/Lo多巴胺、抗坏血酸、葡萄糖等一些生物相关的物质对尿酸的检出无明显干扰。
此方法不依赖于复杂的仪器操作和昂贵的试剂，检测方法简便，有望应用在实际样品的检测。
结合包有Fe304的金纳米颗粒和石墨烯，利用电化学的方法，可同时实现对抗坏血酸、尿酸、醋氨酚和多巴胺的检测，显然该方法对尿酸的特异性检测能力不强［24］o
2.5生物硫醇分子检测
低分子量生物铳基化合物在生命过程中起着重要作用，简便快速检测生物疏基化合物是十分必要的。
谷胱甘肽由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，在复杂的环境中能够稳定金纳米颗粒。
谷胱甘肽可以使金纳米颗粒与一种水溶性共聚物组装体分散，根据这个现象可以发展一种可视化检测谷胱甘肽的方法［25］。
利用谷胱甘肽阻止金纳米颗粒聚集能够发展一种快速简便在线选择性检测谷胱甘肽的方法，而半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽二硫化物都不干扰谷胱甘肽的检测，该方法的线性范围是8〜250—ol/L［26］o利用含氟表而活性剂修饰的金纳米颗粒（Fluorosuctantcappedgold
nanoparticles,FSNAuNPs）可以实现半胱氨酸和同型半胱氨酸的可视化检测［27］。
研究发现，天冬氨酸以离子对的形式与半胱氨酸作用可以诱导金纳米颗粒聚集，这种原理可以用于检测半胱氨酸，并且其它氨基酸和小鼠脑中常见的乳酸、葡萄糖等都不干扰半胱氨酸的检测，半胱氨酸的浓度可以直接通过金纳米颗粒的颜色观测，其线性范围是0.166〜1.67Umol/L,检出限为100—ol/Lo这种方法己成功应用在小鼠脑中的半胱氨酸的检测［28］。
基于Hg2+可以淬灭荧光金纳米颗粒的荧光，同时Hg2+又与生物硫醇有较强的结合作用，能够使被淬灭的荧光恢复，可以实现对生物硫醇分子的检测［29］。
但该方法不能区分出半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽。
2.6氨基酸检测
金纳米颗粒还可以用于其它氨基酸的可视化检测，利用'
乙酰基半胱氨酸修饰的金纳米颗粒可以实现对手性酪氨酸的检测和分离手性酪氨酸。
L酪氨酸可以与金纳米颗粒表面的'
乙酰基半胱氨酸形成氢键而使金纳米颗粒聚集，但是，D酪氨酸不能与\乙酰基半胱氨酸形成氢键而不能使金纳米颗粒聚集，这样就可以选择性地检测L酪氨酸，通过离心可以从溶液中分离出两种手性氨基酸［30］。
由于赖氨酸在pH3.0时可以使柠檬酸根稳定的金纳米颗粒聚集，其它氨基酸却不能诱导金纳米颗粒聚集，根据该原理发展了一种基于金纳米颗粒的可视化检测赖氨酸的方法，其线性范围是1〜70Pmol/L,检出限是0.8Umol/L［31］。
结合金纳米颗粒、适配体,利用电化学的方法可以实现对组氨酸的超灵敏检测［32］。
这些方法在实际样品分析中的应用还需要进一步探讨。
3基于金纳米颗粒的生物大分子分析检测体系
生物大分子（如蛋白质、核酸等）的检测对疾病的诊断具有重要的指导作用。
检测这些物质的方法通常需要复杂的分离、纯化步骤，昂贵且大型的仪器及技术性人员操作，限制了这些方法的—使用。
金纳米颗粒可视化检测不依赖任何大型仪器的优点为生物大分子的检测分析带来了新策略。
核酸检测通常采用的聚合酶链式反应（PolymerasechainReaction,PCR）复朵耗时，对环境洁净度要求高，易出现假阳性的结果;
如果采用金纳米颗粒可视化检测所需时间较短、操作简单，可以用于现场检测，能够在一定程度上解决传统PCR方法存在的问题。
蛋口质检测中传统的免疫检测方法所需时间长、步骤多，利用金纳米颗粒溶液或者是金标试纸条的方法操作简单，能够实现快速现场检测。
3.1核酸检测
核酸分子的特异性检测是生物分析中的一个重要方而，在癌症的早期检测、遗传性基因疾病的临床诊断以及病原体准确鉴别等临床实践方而具有很高的应用价值［33］。
PCR是传统的核酸检测方法，但其所需的热扩增仪器和反应试剂昂贵，样品准备工作繁琐、反应所需时间长，且不适用于现场检测，这些亟待解决的问题恰恰给利用金纳米颗粒做核酸检测提供了契机。
1996年，Mirkin等［34］首次发现DNA分子可以影响金纳米颗粒的组装行为，随后他们将DNA通过铳基修饰到金纳米颗粒上构建了基于金纳米颗粒的核酸检测传感器［35］。
从此利用金纳米颗粒可视化检测核酸的研究就引起了广泛
利用单链DNA,未修饰金纳米颗粒和带正电的水溶性好的共觇聚
合物可以实现对DNA、蛋白质、小分子和离子的检测［36］。
设计该
DNA传感器主要基于—观察到的实验现象：
（1）在较低的盐浓度
下，无论单链DNA,还是双链DNA,都能较好地保护金纳米颗粒,
使其维持分散状态不聚沉；
（2）共轨聚合物的加入能够导致上述的金纳米颗粒聚沉；
（3）在一定的环境条件下，相比于双链DNA和折叠DNA,共觇聚合物更容易与单链D\A结合。
因此当体系中只有单链DNA保护金纳米颗粒时，加入共辘聚合物会使原本保护在金纳米颗粒表而的单链DNA脱离，从而导致金纳米颗粒的聚沉，溶液颜色由红变蓝;
而当体系中存在被检测DXA,它与金纳米颗粒表而的探针DNA互补配对，配对后的DNA双链与共觇聚合物作用较弱，不会导致金纳米颗粒没有保护物而聚沉，溶液颜色不发生变化（图3）。
该方法的创新之处在于应用简单的DNA互补配对原理，同时利用共觇聚合物对不同状态的DNA的结合力不同，通过对金纳米颗粒聚集状态的调控，实现了对DNA的特异性检测。
应用金纳米颗粒能够实
现核酸链中单碱基错配的检测。
单核苛酸多态性是遗传变异中最普遍的类型，许多单核营酸多态性被发现与一些药物反应和各种疾病有着直接关系。
因此单核球酸多态性检测方法的发展对于疾病的诊断和治疗有着重要意义。
单碱基错配的检测是所有利用碱基互补配对检测单核苛酸多态性的基础。
随着近些年纳米技术的发展，利用金纳米颗粒能够实现对单碱基错配的检测。
1997年，Mirkin等[35]报道的工作中除了对单链DNA的检测，同时也实现了对单碱基错配的检测。
近几年利用金纳米颗粒实现单碱基错配检测的研究多集中在如何提高检测体系的灵敏度和特异性，其中最常用的手段是结合酶促反应。
将滚环扩增技术、限制性内切酶酶解作用和金纳米颗粒聚集导致颜色变化的性质结合在一起，可以发展一种可视化的单核苜酸多态性基因分型的方法［37］。
该方法由于聚合酶Phi29高效的扩增效率，体系的检测灵敏度很高。
但反应体系中需要使用3种不同的酶，较为复杂，成本也相对较高。
利用滚环扩增技术和金纳米颗粒也可以直接实现DNA的检测［38］o—核酸酶和无标记的金纳米颗粒也可以构建一种检测核酸链中单碱基错配的方法［39］。
该体系利用在相同的碱基组成和浓度下，单磷酸盐比单链DNA和双链DNA能够更好地稳定未修饰的金纳米颗粒的性质，选择应用的核酸酶具有优越的碱基错配识别能力，当加入的目标物与探针完全匹配时，核酸酶不发生作用;
但当加入的目标物与探针即使有一个碱基错配，核酸酶也能将其识别并水解产生单磷酸根。
当体系中有单磷酸根存在，加入的未修饰的金纳米颗粒在较高的盐浓度下能够稳定存在，溶液颜色保持红色。
若体系中未能产生单磷酸根，加入未修饰的金纳米颗粒后在较高的盐浓度下金纳米颗粒会发生聚沉，溶液颜色发生变化。
此方法应用于乙型肝炎病毒（HBV）基因单碱基错配的检测，但由于该检测体系中未涉及被检测物的扩增反应，在实际样品的检测中需要做传统的PCR和一些分离纯化步骤，所以整个检测分析过程仍较为复杂。
通过巧妙设计发卡形DNA结合胶体金试纸条技术可以实现可视化单碱基错配的检测，并在一个试纸条上实现两个碱基错配点的检测［40］。
由于试纸条便携易操作的优点使得该方法为即时诊断提供可能，但这种方法的灵敏度还有待进一步提高。
结合电化学方法和金纳米颗粒，一些超灵敏的核酸检测的方法逐步被发展，一些方法的检测灵敏度能够达到飞摩尔级别甚至更低［41〜43］。
利用DNA修饰的金纳米颗粒构建的传感器首先需要实现DNA对金纳米颗粒的修饰，这个步骤所需时间较长，需要1〜2d,如果这个过程简化，将更有利于该传感器的构建。
Liu等［44,45］在一定程度上缩短了修饰时间。
在DNA检测过程中省去PCR过程，实现金纳米颗粒实现高度灵敏可视化检测DNA还需要进一步的探索研究工作。
3.2蛋白质检测
蛋口质检测在临床疾病诊断中具有重要意义，例如血清口蛋口测定能够反应肝脏的损伤程度，尿微量口蛋口的测定能够反应肾脏是否健康，甲胎蛋口的检测是诊断原发性肝癌的重要手段等。
人们最为熟悉的应用胶体金法检测蛋口质的方法如早早孕试纸条，通过胶体金试纸条可视化检测尿中绒毛膜—（HCG）是否存在，实现快速判断是否怀孕。
利用胶体金技术，市场上还有检测血吸虫的试纸条，检测风疹的试纸条等。
由于很多蛋口质的检测还不能够简单灵敏地实现，近几年人们仍不断探索利用纳米材料（如金纳米颗粒）实现对蛋口质检测。
利用金纳米颗粒的光电性质，可以实现对蛋白质的检测分析。
结合金纳米颗粒能够淬灭荧光分子的荧光这一性质可以设计一种新型的蛋口质检测传感器[46]。
首先，利用荧光标记的抗原在体系中形成金纳米颗粒抗原结合片段荧光标记抗原的检测体系，此时荧光处于淬灭状态；
当溶液中存在游离的未被荧光标记的抗原时，其会与抗原结合片段上结合的荧光标记抗原发生竞争取代作用，部分荧光标记抗原从金纳米颗粒表而脱离下来回到溶液中，使溶液荧光—增强，通过检测溶液中荧光—的变化实现对目标抗原的检测。
本研究组通过制备罗丹明B功能化金纳米颗粒，建立了高灵敏度，荧光、颜色双读出—的生物传感器，用于检测转基因小鼠脑脊液中乙酰胆碱酯酶的活性（图4）[47]o乙酰胆碱酯酶能水解其底物硫代乙酰胆碱，生成硫代胆碱。
硫代胆碱通过其铳基与纳米金结合，将金纳米颗粒表而的罗丹明B取代下来，罗丹明B的荧光恢复。
同时，硫代胆碱末端的季镀盐基团与金纳米颗粒表而残留罗丹明B的竣基通过静电相互作用，导致金纳米颗粒聚集，使溶液颜色由红色变为蓝色（或紫色）。
通过罗丹明B的荧光恢复和溶液颜色变化，便可测量溶液中乙酰胆碱酯酶的水平。
为了验证这种检测方法在复杂样品中的可适用性，检测了不同转基因小鼠脑脊液中乙酰胆碱酯酶的水平，该方法在复杂样品中依然保持较高的灵敏度和特异性。
图4基于罗丹明B金纳米颗粒检测（通过颜色变化和荧光）乙酰胆碱酯酶的设计策略[47]
Fig.4Designofthedetection（colorimetrieand
fluorometric）ofatylcholinesterase（AChE）basedon
rhodamineBgoldnanoparticles[47]
此外，本研究组还发展了一种通过检测Cu2+间接检测样品中蛋白质的方法［48］。
将二抗进行氧化铜纳米颗粒标记，在免疫反应结束后使用稀酸将氧化铜纳米颗粒溶解，释放岀Cu2+,Cu2+经抗坏血酸欠还原后作为Click反应的催化剂，促进烘基和叠氮基团功能化的金纳米颗粒直接的化学反应，导致纳米颗粒由稳定的分散状态到聚集状态，溶液颜色由红变蓝（图5）。
此方法成功检测了HIV病毒感染病人血清中的HIV抗体。
这种方法提供了一种新的—扩增方式，通过高灵敏度的检测金属离子间接检测生物大分子。
同时，提出了可视化方法，无需大型复杂仪器，为便携快速的现场检测提供新策略。
蛋口质在碱性环境下可将Cu2+还原为Cu+,利用Click配体修饰的金纳米颗粒检测Cu+能够实现对蛋口质的间接检测［49］。
利用该方法检测牛血清口蛋口（BSA）,线性范围为30〜2500mg/Lo图5基于CuO纳米颗粒标记的抗体和Click反应的免疫检测方法示意图［48］
Fig.5ImmunoassaybasedonCuOlabeledantibodyandclick
Chemistry[48]
通过调节金纳米颗粒的尺寸也可以使溶液呈现不同的颜色。
利用过氧化氢酶标记的二抗，结合免疫检测的方法可以实现对蛋口质的超灵敏检测［50］。
该体系的原理是过氧化氢还原Au3+生成金纳米颗粒，当有被检测蛋白质存在时，就会结合过氧化氢酶标记的二抗，过氧化氢酶消耗过氧化氢，过氧化氢浓度降低导致金纳米颗粒的生成动力学减慢，生成的金纳米颗粒聚集，溶液颜色为紫色;
反之生成分散较好的金纳米颗粒，溶液颜色为红色。
该方法检出限可达到10
Symbolm@@18g/mL,并且肉眼可见溶液颜色的变化。
该方法基于免疫检测中抗原抗体的识别作用，对被检测蛋口具有较好的选择性。
利用凝血酶和纤维蛋口原之间特殊的识别作用和金纳米颗粒尺寸变化会引起溶液颜色变化的现象可以构建超灵敏的凝血酶可视化检测体系［51］。
首先将微孔板和金纳米颗粒表面用纤维蛋白原修饰，然后向修饰的微孔板里加入修饰的金纳米颗粒和凝血酶，通过凝血酶与纤维蛋口的相互作用，将金纳米颗粒固定在微孔板表面，再加入氯金酸（HAuC14）轻胺（NH20H）溶液，金纳米颗粒能够催化NH20H还原Au3+形成更大的金纳米颗粒，使溶液呈现不同的颜色。
该体系的检出限为3.2fmol/L,其它蛋白对凝血酶的可视化检测无干扰。
这两个方法灵敏度高，选择性好，在实际样品分析中具有应用潜力。
4结论与展望
利用金纳米颗粒进行生物分子的检测研究开展了十几年，取得了突出的进展和成果。
由于金纳米颗粒具有独特的物理化学性质，其构建的体系对生物分子的检测，尤其是可视化检测，可以减少传统方法中对仪器的依赖，简便快捷，灵敏度高，成本低廉。
但将这类方法真正应用于实际检测中，还需要做出更多的努力。
首先需要解决金纳米颗粒的稳定性问题，包括金纳米颗粒合成及形貌控制的稳定性，分析检测中结果的稳定性及重复性，在进行实际样品检测分析过程中的稳定性问题等;
其次，有些检测方法的灵敏度仍然不能达到实际要求，需要传统方法的辅助，存在进一步优化的空间;
此外，将金纳米颗粒体系用于实际样品的检测中，还需要保证检测体系能够在复杂样品中依然表现优异，使其具有更好的抗干扰能力，实现对目标分析物的特异性检测。
对于金纳米材料的稳定性问题，胶体金试纸条的应用给我们提供了一种解决思路。
将液相存在的物质转移到固相上，如引入层析试纸条或者试纸，可以提高其抵抗外界环境变化引起的稳定性问题。
对于检测分析过程的稳定性问题，可以考虑与微流控芯片等密闭操作结合，大大降低检测过程中外部条件对其产生的干扰。
在提高检测灵敏度方面，引入一些放大反应（如催化）实现—的放大，也许是一种解决途径。
随着纳米科技的发展，金纳米颗粒的可视化检测体系必将会有更好的应用前景。
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