PCR实验技术基础知识.docx

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PCR实验技术基础知识

PCR实验技术指南

一、引物设计设计软件有很多，既可以在线设计（如Primer3http:

//frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi），也可以用Primer5、Oligo6.65等等

1.引物设计的原则

细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。

理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。

设计糟糕的引物可能会同时扩增其他的非目的序列。

下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：

1）典型的引物18到24个核苷长。

引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。

但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。

较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

2）选择GC含量为40％到60％或GC含量与模板GC含量接近的引物。

3）设计5"端和中间区为G或C的引物。

这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。

4）避免引物对3"末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。

在用软件设计时大家常常会疑惑,究竟?

G不能低于多少?

这里有个数据:

?

G为0~-2时,PCR产率可达100%,?

G=-6时,为40%.

5）避免3"末端富含GC。

设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。

6）避免3"末端的错误配对。

3"端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。

3’最好以G或C结尾，防止AT的松散结合引起错配。

7）避免存在可能会产生内部二级结构如发夹结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。

8）引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。

这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。

两引物的Tm值相差不应大于5℃。

计算Tm有几种公式。

第一个公式（Wallace规则）:

Tm=4℃（g+C）+2℃（a+T）,这来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于15-20个碱基的引物,也适用于手工设计时的简单计算。

第二个公式（Baldino算法）适用于计算14-70个核苷酸在≤0.4mol\L的阳离子溶液中的Tm,也可用于扩增产物的Tm计算.Tm=81.5+16.6*lg[K+]+0.41（%[G+C]）-（675/n）。

以上两种算法都是基于碱基组成而不是碱基排列而计算的，事实上相同碱基组成的引物Tm可能差异不小：

GGGAA和GAGAG的Tm是不一样的，所以确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。

这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。

大部分计算机程序如Primer5等均使用近邻分析法。

9）当在引物5’端添加酶切位点时要考虑：

a）该目的序列内部不得含有相同的酶切位点，在引物发出后才发现错误的事情本人就干过，在论坛上也能看到这样的粗心人。

这样的错误会给将来的克隆造成麻烦。

b）如果打算PCR后直接酶切，不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基，不同的酶对于保护碱基的要求是不同的。

如果不设计保护碱基，则多半要用TA克隆的方式连接到质粒上，这时要注意Taq酶的选择，这一点在后面再聊。

若想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5"端而不影响特异性。

当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。

10）有时候，对于引物设计仅了解有限的序列信息。

比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计兼并引物。

兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。

为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少兼并性。

次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。

特别要注意的是：

不要在引物的3"端使用兼并碱基，因为3"端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。

使用较高的引物浓度（1µM到3µM），因为许多兼并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。

说了半天了,想起来还得提醒大家一句:

千万别搞错了引物的位置！

这句话似乎多余。

看了上面的图吧,如果要扩增目的序列为“ATG…………TGA”的片段，则引物分别为“ATG……”和“TCA……”仔细琢磨一下，特别是5’端再接上酶切位点可别搞错了！

合成错了一条可就是50块钱，到时候挨老板批的时候别怪我没提醒你哦：

）设计好了引物就要让公司合成，这时候别忘了谈价格：

）现在竞争很厉害，价格已经挺便宜了，注意两个参数：

一个是OD值，如果公司说1OD能比2OD优惠，那通常1OD足够了。

第二是纯度，是HPLC的还是OPC的，事先要说好，建议看看这里（唉，不是我给他们做广告，只是他们的说明书写得真不错）：

而不是酶连接起来、如果要设计引物表达蛋白时注意“N端规则”。

二、PCR成分

引用《分子克隆3》提供的PCR标准反应条件：

模板1pg-1μg

引物1μmol/L

DNA聚合酶1－5单位

Mg2＋1.5mmol/L

dNTPs200μmol/L

KCl50mmol/L

1.模板

模板可是PCR的关键，模板的质量是PCR成功的先决条件，P不出东西的时候不妨先考虑：

模板有没有问题？

（DNA样品中发现有多种污染物会抑制PCR。

一些在标准基因组DNA制备中使用的试剂，如SDS，在浓度低至0.01％时就会抑制扩增反应。

）所需的最佳模板量取决于基因组的大小。

你的目的片段在基因组中占多少？

至少要保证模板中含有一个单拷贝吧！

100ng到1µg的人类基因组DNA，相当于3×104到3×105个分子。

所以对于单拷贝基因,这需要0.1μg的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列.模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA中的杂质也会影响PCR的效率。

2.引物

引物以干粉形式运输。

最好用TE重溶引物，使其最终浓度为100µM。

TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。

当然，如果担心TE对于PCR的影响，不妨用ddH2O。

引物的稳定性依赖于储存条件。

应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。

以大于10µM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。

干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。

注意：

溶解之前先离心一下，防止一开盖就飞了。

引物的浓度会影响特异性。

最佳的引物浓度一般在0.1到0.5µM。

较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。

通常跟着引物来的说明书会告诉你，关于寡核苷酸的计算可以看看这里：

3.聚合酶的选择

这可是有讲究，咱论坛里有个专题讨论这个问题。

主要考虑两个方面：

用途——对保真度的要求高不高？

成本——高保真的酶总是会贵一些的。

综合考虑一下找个平衡点吧，当然啦，该花钱的时候可不能省。

TaqDNA聚合酶被看做是低保真度的聚合酶，因为其缺少3"到5"外切核酸酶（校正）活性。

使用带有3"到5"外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高保真度。

但是这些聚合酶的产量比TaqDNA聚合酶低。

在很多公司的手册中有对各种酶特性的描述，大家不妨比较一下。

提醒一点：

高保真酶除了我所知的Merck的Easy-A以外，都不会在3’端加A尾巴（因为其3’-5’外切酶活性），所以做TA克隆的时候需要一点小诀窍——扩增完了再加普通Taq去加个A。

另外还有个方法：

将TaqDNA聚合酶同带有3"到5"外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独TaqDNA聚合酶高的保真度，并可以得到高产量及扩增长模板。

4.Mg2＋浓度

镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。

dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。

最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200µMdNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM（注意：

对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液）。

在多数情况下，较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性（当然，也有相反的报道）。

为了确定最佳浓度,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。

在PCR反应混合物中,应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团,例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质,以保证最适Mg2+浓度。

5.dNTPs

高浓度的dNTPs会对扩增反应起抑制作用。

将每种dNTP的浓度从200µM降低到25-50µM可以使扩增产物获得满意的产率。

6.KCl

标准浓度为50mmol/L,对于较短片段可将其提高到70-100mmol/L.

三、PCR反应参数

1.变性：

在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解链,然后加入TaqDNA聚合酶（hotstart）,这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。

变性不完全,往往使PCR失败,因为未变性完全的DNA双链会很快复性,减少DNA产量.一般变性温度与时间为94℃1min。

在变性温度下,双链DNA解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。

对于富含GC的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。

2.退火：

这是PCR的一个关键参数。

在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。

合理的退火温度从55℃到70℃。

退火温度一般设定比引物的Tm低5℃,当产物中包含有影响实验的非可异性扩增带时,以2℃为增量，逐步提高退火温度。

较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。

如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。

或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。

这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

退火温度越高,所得产物的特异性越高。

有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度（例如用60℃和94℃）完成整个扩增循环,既省时间又提高了特异性。

退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。

3.延伸：

延伸反应通常为72℃,接近于TaqDNA聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为TaqDNA聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,TaqDNA聚合酶每分钟约可合成1kb长的DNA。

延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列,则可适当增加延伸反应的时间。

一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间（10-30min）的延伸反应,以获得尽可能完整的产物,这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。

3.聚合酶的选择

这可是有讲究，咱论坛里有个专题讨论这个问题。

主要考虑两个方面：

用途——对保真度的要求高不高？

成本——高保真的酶总是会贵一些的。

综合考虑一下找个平衡点吧，当然啦，该花钱的时候可不能省。

TaqDNA聚合酶被看做是低保真度的聚合酶，因为其缺少3"到5"外切核酸酶（校正）活性。

使用带有3"到5"外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高保真度。

但是这些聚合酶的产量比TaqDNA聚合酶低。

在很多公司的手册中有对各种酶特性的描述，大家不妨比较一下。

提醒一点：

高保真酶除了我所知的Merck的Easy-A以外，都不会在3’端加A尾巴（因为其3’-5’外切酶活性），所以做TA克隆的时候需要一点小诀窍——扩增完了再加普通Taq去加个A。

另外还有个方法：

将TaqDNA聚合酶同带有3"到5"外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独TaqDNA聚合酶高的保真度，并可以得到高产量及扩增长模板。

4.Mg2＋浓度

镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。

dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。

最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200µMdNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM（注意：

对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液）。

在多数情况下，较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性（当然，也有相反的报道）。

为了确定最佳浓度,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。

在PCR反应混合物中,应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团,例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质,以保证最适Mg2+浓度。

5.dNTPs

高浓度的dNTPs会对扩增反应起抑制作用。

将每种dNTP的浓度从200µM降低到25-50µM可以使扩增产物获得满意的产率。

6.KCl

标准浓度为50mmol/L,对于较短片段可将其提高到70-100mmol/L.

三、PCR反应参数

1.变性：

在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解链,然后加入TaqDNA聚合酶（hotstart）,这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。

变性不完全,往往使PCR失败,因为未变性完全的DNA双链会很快复性,减少DNA产量.一般变性温度与时间为94℃1min。

在变性温度下,双链DNA解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。

对于富含GC的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。

2.退火：

这是PCR的一个关键参数。

在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。

合理的退火温度从55℃到70℃。

退火温度一般设定比引物的Tm低5℃,当产物中包含有影响实验的非可异性扩增带时,以2℃为增量，逐步提高退火温度。

较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。

如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。

或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。

这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

退火温度越高,所得产物的特异性越高。

有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度（例如用60℃和94℃）完成整个扩增循环,既省时间又提高了特异性。

退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。

3.延伸：

延伸反应通常为72℃,接近于TaqDNA聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为TaqDNA聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,TaqDNA聚合酶每分钟约可合成1kb长的DNA。

延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列,则可适当增加延伸反应的时间。

一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间（10-30min）的延伸反应,以获得尽可能完整的产物,这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。

3.聚合酶的选择

这可是有讲究，咱论坛里有个专题讨论这个问题。

主要考虑两个方面：

用途——对保真度的要求高不高？

成本——高保真的酶总是会贵一些的。

综合考虑一下找个平衡点吧，当然啦，该花钱的时候可不能省。

TaqDNA聚合酶被看做是低保真度的聚合酶，因为其缺少3"到5"外切核酸酶（校正）活性。

使用带有3"到5"外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高保真度。

但是这些聚合酶的产量比TaqDNA聚合酶低。

在很多公司的手册中有对各种酶特性的描述，大家不妨比较一下。

提醒一点：

高保真酶除了我所知的Merck的Easy-A以外，都不会在3’端加A尾巴（因为其3’-5’外切酶活性），所以做TA克隆的时候需要一点小诀窍——扩增完了再加普通Taq去加个A。

另外还有个方法：

将TaqDNA聚合酶同带有3"到5"外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独TaqDNA聚合酶高的保真度，并可以得到高产量及扩增长模板。

4.Mg2＋浓度

镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。

dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。

最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200µMdNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM（注意：

对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液）。

在多数情况下，较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性（当然，也有相反的报道）。

为了确定最佳浓度,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。

在PCR反应混合物中,应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团,例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质,以保证最适Mg2+浓度。

5.dNTPs

高浓度的dNTPs会对扩增反应起抑制作用。

将每种dNTP的浓度从200µM降低到25-50µM可以使扩增产物获得满意的产率。

6.KCl

标准浓度为50mmol/L,对于较短片段可将其提高到70-100mmol/L.

三、PCR反应参数

1.变性：

在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解链,然后加入TaqDNA聚合酶（hotstart）,这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。

变性不完全,往往使PCR失败,因为未变性完全的DNA双链会很快复性,减少DNA产量.一般变性温度与时间为94℃1min。

在变性温度下,双链DNA解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。

对于富含GC的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。

2.退火：

这是PCR的一个关键参数。

在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。

合理的退火温度从55℃到70℃。

退火温度一般设定比引物的Tm低5℃,当产物中包含有影响实验的非可异性扩增带时,以2℃为增量，逐步提高退火温度。

较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。

如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。

或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。

这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

退火温度越高,所得产物的特异性越高。

有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度（例如用60℃和94℃）完成整个扩增循环,既省时间又提高了特异性。

退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。

3.延伸：

延伸反应通常为72℃,接近于TaqDNA聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为TaqDNA聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,TaqDNA聚合酶每分钟约可合成1kb长的DNA。

延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列,则可适当增加延伸反应的时间。

一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间（10-30min）的延伸反应,以获得尽可能完整的产物,这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。

4.循环次数：

当其它参数确定之后,循环次数主要取决于DNA浓度。

一般而言25-30轮循环已经足够。

循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加。

通常经25-30轮循环扩增后,反应中TaqDNA聚合酶已经不足,如果此时产物量仍不够,需要进一步扩增,可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板,重新加入各种反应底物进行扩增,这样经60轮循环后,扩增水平可达109-1010。

扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:

C＝Co（1+P）n。

其中：

C为扩增产物量,C0为起始DNA量,P为增效率,n为循环次数。

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。

平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。

因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。

四、提高PCR扩增特异性

1.递减PCR（TouchDownPCR）

递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。

循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃（当然，也可以每几个循环降1－2℃），直到退火温度低于Tm5℃。

特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。

递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP®DNA指纹分析。

2.热启动

热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。

尽管TaqDNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。

因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。

这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。

在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。

并且，热启动在很大程度上防止引物二聚的发生。

限制TaqDNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。

这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。

热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。

包括延缓加入TaqDNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。

其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。

在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。

象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。

3.促进PCR的添加剂

退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。

影响DNA熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。

为获得最好的结果需要模板的完全变性。

另外，二级结构会阻止引物结合和酶的延伸。

PCR添加剂，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱以及PCRxEnhancerSolution可以增强扩增。

它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。

PCRxSolution还有其他优点。

在同PlatinumTaqDNA聚合酶和Platinum