质谱在生物医药中的应用.docx
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质谱在生物医药中的应用
质谱在生物医药中的应用
中国教育装备采购网2012-04-1016:
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2011年7月7日，第二届质谱论坛在北京师范大学英东学术讲堂成功举办。
来自北京周边地区各研究院所、高校、检测机构的共计300余位专家和科研人员参加了此次论坛。
质谱论坛由北京师范大学质谱中心发起，并得到中国质谱学会的大力支持，协办单位为：
分析测试百科网和首都科技条件平台北京师范大学研发实验服务基地。
质谱论坛将长期定期举办，每年1-2期，每期将围绕当前质谱技术应用的热点科学问题，邀请杰出的科学家做学术报告，并提供相互间充分的交流和沟通。
第二届质谱论坛的主题是质谱技术在生物医药中的应用。
本期论坛合办和赞助方为赛默飞世尔科技公司，分析测试百科网（）将长期协助组织论坛，并进行宣传和报道。
此次报告邀请的专家有：
中科院生物物理所杨福全研究员，清华大学生命学院邓海腾教授，军事医学科学院谢剑炜研究员，以及赛默飞世尔科技公司的刘婷工程师。
质谱论坛会场
北京师范大学质谱中心主任谢孟峡教授
首先来自北京师范大学质谱中心主任谢孟峡教授致开幕词。
谢教授首先感谢大家的到来，接下来带大家一起回顾了首届质谱论坛并进行了质谱中心相关情况介绍。
质谱论坛的宗旨是为质谱技术在各学科的应用提供一个高层次的学术交流平台，推动质谱技术的学科建设发展中的支撑作用。
首届质谱论坛于去年10月份举办后受到了社会各界的广泛关注。
首届质谱论坛邀请的报告人有中国科学院北京基因组研究所刘斯奇研究员、中国医学科学院基础医学研究所的李智立教授、北京师范大学生命学院的何大澄教授。
第二届质谱论坛得到了赛默飞世尔科技的大力支持。
谢老师提到，北京师范大学和赛默飞世尔的合作长达30多年，从上世纪80年代初，北师大购买的第一台质谱就来自赛默飞世尔科技前身即菲尼根公司;之后在1999年购置菲尼根气质联用，2005年购置了气相稳定同位素质谱仪，2009年购置了赛默飞世尔公司第一台线性离子阱LC/MS等等。
北京师范大学质谱中心采用分散放置，统一管理的运行模式，现在运行12台大型质谱仪器设备，分别放置在分析测试中心、生命科学学院、化学学院、环境学院、减灾与应急管理研究院和二炮总医院。
仪器种类包括气质联用仪、气相色谱-四极杆飞行时间质谱、液相色谱-三重四极杆质谱、液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱、液相色谱-四极杆线性离子阱串联质谱、气相稳定同位素质谱等，可以对生物大分子、药物、环境等方面的研究提供技术支撑。
作为北京师范大学教师和研究人员开展科学研究的技术支撑体系，质谱中心在开展质谱检测技术、方法学及在相关领域的应用研究、促进不同学科间的交流合作、培养高水平、高素质专业人才等方面发挥着非常重要的作用。
谢孟峡教授还向大家介绍了质谱中心管理委员会成员和学术委员会成员。
学术委员会还新聘请了中国科学院生物物理研究所杨福全研究员、清华大学邓海腾教授、军事医学科学院毒物药物研究所谢剑炜研究员。
北京师范大学科技处处长高尚玉教授、生命科学学院何大澄教授和分析测试中心主任李崧主任为新聘任的学术委员会成员颁发了聘书。
向北京师范大学质谱中心新任学术委员会委员颁发聘书合影，由左向右依次为：
谢孟峡教授、高尚玉教授、谢剑炜研究员、杨福全研究员、邓海腾教授、何大澄教授
质谱论坛学术报告
赛默飞世尔科技色谱质谱部应用工程师刘婷
来自赛默飞世尔科技的应用工程师刘婷为大家作了题为《高分辨质谱提高代谢物鉴定的数量和可靠性》的报告。
代谢物鉴定的重要性
刘工程师讲到，DMPK贯穿新药研发的始终，FDA以及SFDA里面都有药物DMPK的相关指导原则，即：
新药研发中，为了评价药物的安全性和有效性，需要阐明药物的代谢过程，并考察可能的药物相互作用。
2002年MIST法案和2008年的FDA指南都规定了必须要鉴定出主要的代谢产物、活性代谢产物和具有毒性的代谢产物。
并且FDA指南规定，在人血液里，在稳态条件下，血液中的代谢产物达到了母药暴露水平的10%则必须进行定量研究。
高分辨质谱提高代谢物鉴定的数量和可靠性
从代谢物鉴定方法的发展来看，1989年以前主要是利用TLC和HPLC来进行鉴定，耗时长，效率不高，鉴定几种代谢物通常需花费几周甚至几个月的时间，且缺乏定性能力;90年代后，LC/MS技术得到应用，主要应用离子阱质谱和三重四极杆质谱，可以较好地定性，将几个代谢产物鉴定的时间缩短为几周，但是仍无法满足药物代谢研究中高通量的要求;2008年之后，高分辨质谱在药物代谢研究中的应用越来越广泛，这类质谱包括Q-TOF、Orbitrap等，在几天的时间内就能鉴定出1-3个化合物。
那么为什么要用高分辨质谱，多少分辨率才够用呢?
药物代谢研究针对的不是标准品而是复杂的生物基质，存在大量的干扰，高分辨的意义就在于可以有效地排除干扰。
在举例Isazophos（m/z314.04941）的药物定量实验中，存在本底噪音（m/z314.07141），分辨率只有在50,000以上，才可能很好地排除干扰并准确定量。
另一个例子是测定红茶中的茶多酚，分辨率达到80,000时才足以准确地鉴定花青素（m/z577.13405）并排除干扰（m/z577.15518），和进行定量。
关于精确质量数的作用，可以发表在Clinbiochem.2010.08.018上的文献来说明，该例中，质量偏差如控制在±5ppm以内，则能消除假阳性，提高灵敏度。
稳定的高质量精度可获得优异的定量RSD重复性，并可准确定性元素组成。
而要获得提取色谱峰非常对称的峰形，和稳定的高质量精度，常常需要高分辨（比如举例中需要50,000以上的分辨率）。
代谢物研究中对高分辨质谱的要求是：
具备高分辨率和高质量精度，从而保证复杂样品测定的质量精度;同时还需质量精度稳定性好，才能保证每个扫描点的质量精度。
赛默飞世尔科技公司的Orbitrap质谱是当今分辨最高的高通量质量分析器，它包括台式Orbitrap系列（Exactive）和LTQOrbitrap系列。
今年ASMS推出的Q-Exactive，分辨率达到了140,000，采集速度提高了两倍;而新推出的LTQOrbitrapElite，分辨率达到了240,000，采集速度提高了4倍。
OrbitrapElite高场轨道阱质谱仪
QExactive台式FT轨道阱质谱仪
高分辨质谱在代谢产物鉴定的应用思路
高分辨质谱用于代谢产物鉴定，最主要的两条应用思路是应用多种数据采集和数据处理方式。
数据采集有多种模式，包括DDPT数据依赖性扫描，可自动激发做多级扫描;母药分子式如含有卤族元素可用同位素激发模式做数据依赖性扫描;依赖仪器需要运用极性切换的功能来进行代谢物确认。
数据分析时用到两类数据：
一类是全扫描数据，一类是多级扫描数据。
针对全扫描数据分析，常用方法包括质量亏损过滤（MDF）及多重质量亏损过滤（MMDF）、背景扣除、同位素过滤、提取离子流图。
针对多级扫描数据分析，常用子离子过滤和中性丢失过滤（即根据一些中性丢失碎片进行代谢物查找）。
应用实例——雷公藤甲素代谢物鉴定
接下来刘工重点列举了雷公藤甲素（Triptolide）代谢物鉴定的应用实例。
雷公藤是临床上治疗风湿性关节炎的主要用药，毒性很强，临床表现为肝肾毒性。
其中雷公藤甲素是雷公藤的主要药理成分，研究雷公藤甲素的代谢产物特别是反应性代谢产物对解释雷公藤的肝肾毒性有重要的意义。
其研究难点在于：
质谱离子化效果不佳，响应强度不高。
该实验主要运用赛默飞世尔科技AccleaU-HPLC和LTQOrbitrap与Q-Exactive质谱进行分析，分别进行了雷公藤甲素体外和体内代谢分析。
在建立LC-MSn方法中，首先对流动相进行了优化，加入了NH4AC帮助形成[M+NH4]+从而提高信号响应，解决了灵敏度问题。
LTQOrbitrap和Q-Exactive质谱主要采用了数据依赖性扫描，其中LTQOrbitrap主要采用的是CID加宽带激发碰撞模式，Q-Exactive则采用HCD高能碰撞模式，从而得到更多离子碎片信息。
Metworks软件确认代谢物过程实现了数据采集和数据分析两种功能。
Metworks软件的MMDF（多重质量亏损过滤）功能用于分析体内大鼠尿液样品，中性丢失过滤功能进行反应性代谢物查找，子离子过滤功能查找代谢物，MassFrontier软件对雷公藤甲素碎片分析，最终发现了107种代谢物。
中国科学院生物物理研究所杨福全研究员
来自中国科学院生物物理研究所的杨福全研究员的演讲题为《蛋白质组学技术在生物医学研究中的应用》。
杨老师首先总结了用于蛋白质组学的定性和定量技术。
在蛋白质定性方面的主流技术包括两条路线：
基于双向电泳和生物质谱的技术路线;基于多维液相色谱-质谱联用技术路线（美国JohnYates教授创建）。
蛋白质组的定量当前更受到关注，目前也有几种技术：
（1）基于表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）的差异蛋白筛选技术，应用于临床生物标志物发现，发现的蛋白分子量小于20,000。
（2）基于双向电泳（2-DE）的差异蛋白质筛选技术，可发现10,000分子量以上的差异蛋白，后来还发展出灵敏度重现性更好的荧光差异电泳（DIGE）方法。
（3）目前主流的基于LC-MS/MS的定量蛋白质组学，包括相对定量的稳定同位素标记和无标记定量策略，以及绝对定量的基于多反应监测（MRM）的定量策略。
标记策略又分为体外标记（如H218O、ICAT、cICAT、iTRAQ），以及体内标记（如SILAC）。
无标记定量可以用比较色谱峰面积、收集所有需进行比较的多肽的谱图进行统计分析来相对定量，但为获得更好的重现性，对色谱分离条件和样品都要求较高。
在蛋白质组验证阶段，用WesternBlot法定量通量太低，所以现在流行用三重四极杆的MRM进行绝对定量。
蛋白质组学在生物医学研究中的应用包括：
蛋白质表达谱分析，疾病相关蛋白质生物标志物的发现和鉴定，蛋白质翻译后修饰，蛋白质复合物的鉴定、蛋白质-蛋白质相互作用研究，细胞分化、胚胎发育过程中蛋白质表达变化分析分析，蛋白质功能研究（降解机制、构象等）。
其中蛋白质表达谱分析用于血浆蛋白质组学、肝脏蛋白质组学、脑蛋白质组学、尿蛋白质组学、脑脊液蛋白质质组学以及亚细胞器蛋白质组学等。
接下来杨老师列举了自己开展过的多个生物医学相关的研究实例，并总结了一些经验和教训，让每个人都受益匪浅。
基质细胞衍生因子（SDF-1）在血清中降解机制研究中，杨老师用LC-MS的方法和分析化学的经验成功解决了生物学家碰到的问题，该工作发表在2004和2005年的《Blood》上。
该工作的研究目的是：
生物体内同时存在SDF-1α和SDF-1β的意义何在?
SDF-1不断在基质细胞、树枝状细胞、内皮细胞以及其它细胞中表达，在骨髓中不断被降解，其作用的酶是什么?
合作的生物学家用新鲜的人血清对重组的SDF-1α和SDF-1β进行20小时的孵育处理后，用SDSPAGE分析，发现了分子量变化，希望杨老师能测定和解释这种变化。
但实际上当时生物学家关心的是丢失的那段质量，所以在处理中加了分子量透析步骤，因此开始很难找到质谱信号。
在杨老师仔细了解后，建议用LC-MS测定处理后剩余的那段分子量（m/z7,000~9,000），果然得到了很好的结果。
随后对SDF-1α的变化进行了动力学的分析和表征。
最后的结果表明：
在用新鲜血清处理后，SDF-1α在C端丢失了K、在N端丢失了KP，而SDF-1β只在N端丢失KP。
动力学分析表明SDF-1α先在C端丢失K、然后在N端丢失了KP，显然有两种起作用的酶。
最后鉴定出CD26导致了N端KP丢失，CarboxypeptidaseN导致了C端断裂。
和国内某医院合作，杨老师课题组对白血病相关的生物标志物进行分离鉴定。
医院首先对健康人和白血病患者的血清进行了SELDI分析比较，找到潜在的标志物（目标蛋白质）。
随后，杨老师建立了一套综合的方法来分离鉴定目标蛋白质。
前处理包括对血清样品脱盐、去除高丰度蛋白、HPLC分离然后得到纯化的目标蛋白，然后综合运用MALDI-TOF-MS直接测定分子量、酶解后用LC-MS/MS测定肽段及蛋白质、N端序列测定等方法，最后成功地鉴定了目标蛋白质。
另一项和医院的合作是肿瘤死亡预警蛋白质的分离鉴定。
初步的临床观察显示：
对比不同肿瘤患者血清的SELDI-TOF-MS检测谱图，可发现一组与肿瘤患者病情加重和预后密切相关的异常血清蛋白特征峰，其分子量范围为11.1-11.9kDa，暂命名为死亡预警蛋白，简称LGT。
中晚期患者血清中LGT与预后的关系：
LGT持续（+）2-3个月，死亡率90%以上，LGT持续（-）为零死亡;LGT由（+）转（-），死亡率10%。
LGT疑似（±）死亡率10%。
杨老师课题组将这组LGT蛋白进行MALDI-TOF-MS分析，得到了13种蛋白的鉴定结果。
其它的研究还包括：
线虫线粒体蛋白质表达谱分析;大鼠L6肌管细胞磷酸化蛋白质组分析;胰岛β细胞线粒体的蛋白质组及其磷酸化信号网络的构建;SILAC定量蛋白质组学技术应用于L6骨骼肌细胞分化前后蛋白质表达差异分析等等。
由于时间有限，没有更多地展开介绍。
但接下来，杨老师回答了现场很多听众的热烈提问。
清华大学邓海腾教授
来自清华大学生命学院的邓海腾教授做了题为《ApplicationofmassspectrometrybeyondProteomics》的报告，主要内容是关于质谱在代谢组学方面的应用。
回顾质谱百年发展历史，从英国物理学家JosephJohnThomson研制出世界上第一台质谱仪，到现在复杂的Orbitraps，近一百年来质谱的发展非常迅速，质谱技术的开发也越来越偏重于应用。
从质谱在Nobel上的获奖情况来看（1906年Thomson获Nobel物理学奖;1922年Aston因同位素模式获Nobel化学奖;1939年Lawrence因回旋共振获Nobel物理学奖;1989年WolfgangPaul因离子阱获Nobel物理学奖;2002年JohnFenn和田中耕一因离子源获Nobel化学奖），邓教授认为下一个质谱方面的Nobel奖可能会是傅立叶变换在质谱仪上的应用。
傅立叶变换是一个非常重要的工具，通过傅立叶变换可以把时域信号转化为频率，通过频率和质量的关系，我们就能得到高精确度的质谱图。
根据文献（MannandKelleherPANSNovember25,2008vol.105No.4718135）对比，低分辨离子阱/四极杆/三重四极杆的精确度是1-0.1Da，中等分辨的飞行时间/Q-TOF的精确度为0.1-0.01Da，而高分辨的FTICRMS/FT-Orbitrap这类傅立叶质谱仪的精确度高达0.01-0.001Da。
更高的分辨将提高蛋白质组学鉴定的确信度，并能够检测多种变化、翻译后修饰等。
邓教授援引Nature上的一篇提为《2020visions》的文章，其中提到在以后十年里比较有前途的两个领域是代谢组学和微生物组学。
广义的代谢组学可分为很多小的领域，如糖的代谢组学、脂质组学等。
目前科学家们还建立了代谢组学的数据库，如Scripps代谢组学中心建立的METLIN数据库，和HumanMetabolomeDatabase。
代谢产物检测的流程并不复杂（比蛋白质组学稍微简单一些），一般为生物化学萃取-样品制备-LC-MS（+）或LC-MS（-）/GC-MS-鉴定-定量-解释，难点集中在最后两个步骤，要借助一些软件。
比较《Sarcosinelevelsinprostatecanceranditsassociationwithcellinvasion》（ASreekumarelal.Nature457,910-914,2009），把癌症病人分为两组，一组是癌细胞还未扩散的病人，一组是已经扩散的恶性病人，进行代谢组学分析。
鉴定出1000余种小分子，并发现其中有6种小分子表达浓度在癌症病人（尤其是恶性癌症病人）中比正常人高很多，比如肌氨酸（sarcosine）。
研究者还在细胞中添加了sarcosine，发现会增加细胞的movement扩散度（虽然很多人认为这不是一个非常好的证明方法）。
研究者还解释了这个小分子发生作用的机理，并指出了一种甲基化酶，把一个甲基放在了glysine上，就变成了sarcosine;而有了酶，就有了一个药物靶向分子。
这是一个非常好的例子，通过代谢组学研究，可以发现生物标志物。
当然，正如蛋白质组学研究一样，接下来的几年尚无法证实发现的这个sarcosine小分子是非常特异的生物标志物。
目前也有种观点倡导系统生物学研究，即认为真正起作用的生物标志物可能是包含小分子、大分子等的一组物质，来协同起作用。
接下来，邓教授介绍了在结核病新药研发方面的研究，结核病（TB）是一种古老的传染病，由结核杆菌感染引起，占世界三分之一的人口感染了结核杆菌。
多种耐药性结核病菌、HIV/TB双重感染、治疗时间长、存在潜伏期，这都是目前结核病治疗面临的挑战。
邓教授分别介绍了他们利用代谢组学研究，来筛选新型结核病药物。
比如发现了三种小分子：
OPB、FAD、FMN。
然后用质谱法来做代谢组学研究，并解释了其作用的机理。
邓教授还介绍了一种方法来鉴定所有的药物相关的代谢物。
在该药物的代谢组学研究中，用质谱做代谢谱（profiling）得到5,000~6,000种小分子，即使送到所有数据库大部分也得不到结果，但毫无疑问，这其中一定有些分子是和药物有关的，邓教授介绍了一种最常用的方法，即改变药物分子（比如用D取代药物分子中的H），如果产生的代谢产物中有药物分子，比较用原来的药物产生的代谢产物分子和D代药物产生的代谢产物，会发现有些化合物有分子量的区别，通过这种代谢谱分析（MetabolicProfiling），就可鉴定出所有与药物有关的代谢物，并且推断药物的作用机理。
只是鉴定所有的代谢产物是不够的，如果要建立一个所有代谢的代谢途径，就要进行Flux分析（代谢通量分析）。
Flux分析在人身上是做不了的，一般都是在E.Coli（或yeast）上做的。
用稳定同位素标记E.Coli，然后进行代谢，在不同的时间提取代谢产物进行色谱-质谱分析，看看代谢产物的变化。
比较有影响的一篇文章是《Systems-levelmetabolicfluxprofilingidentifiesfattyacidsynthesisasatargetforantiviraltherapy》（NatureBiotechnology26,1179,2008），它对人巨细胞病毒humancytomegalovirus（HCMV）进行了Flux代谢通量分析。
用13C标记的葡萄糖和谷氨酰胺来喂养哺乳动物细胞并进行动力学监测。
感染HCMV的代谢通量通过包括糖解的多数中央碳代谢途径显著上调，特别是通过三羧酸循环和其流出到脂肪酸生物合成途径中显著地增加。
而抑制脂肪酸生物合成的药理抑制剂抑制了HCMV和A型流感的复制。
通过该实验，不仅了解了代谢产物的变化，而且可鉴定一些新的药物靶分子。
除了代谢组学外，还需要考虑如何从组学到基因功能。
这里介绍了一些合成的小分子来作为探针（Activity-basedChemicalProbes），可以和酶的活性位点反应。
利用这些探针，可以检测到酶到底在什么位置。
接下来，介绍了Cravatt去年发表在Cell上的文章《Monoacylglycerollipaseregulatesafattyacidnetworkthatpromotescancerpathogenesis》（Cell.140,49-61.2010）。
谈到生物医学中质谱将来的作用，邓教授谈了几点。
由于质谱具有高特异性，目前更有很多高分辨率的质谱，所以对“其它技术可能取代质谱”的担忧是不必要的。
而且相对于结构生物学和单分子分析，质谱的优点还在于可以分析混合物。
谈到未来的质谱发展，邓教授认为，十年前我们认为我们可以做蛋白质组，现在的结论是我们只能做一部分蛋白质组，所以和基因组/基因测序的差距还很大。
未来十年二十年，希望能出现一种全新的质谱，可以像基因测序仪那样应用。
军事医学科学院谢剑炜研究员
来自军事医学科学院的谢剑炜研究员做了题为《芥子气暴露的确证》的报告。
首先谢研究员介绍了芥子气暴露的确证研究的背景。
芥子气（HD）是一种糜烂性化学毒剂，曾多次应用于战争中，造成大量人员伤亡，二战期间侵华日军就曾经在中国各地遗弃可大量化学武器，对周边地区人民构成了巨大威胁。
芥子气具有复杂的生物学作用机制，可与人体内的核酸、蛋白质、酶作用，使得细胞的代谢和功能发生障碍，导致变性、炎症和坏死。
因此芥子气暴露确证技术的研究非常重要。
芥子气是一种双功能烃化剂，在生理条件下极容易发生亲电反应。
目前，对于芥子气暴露确证技术的研究的难点主要集中在以下几点：
（1）毒理机制尚不十分明确;
（2）暴露后有潜伏期，不能及时诊断;（3）症状与烧伤、化学伤类似;（4）靶器官广泛，无特效解毒药。
生物标志物是生物体内污染物暴露剂量和生物效应的指示剂。
在毒物风险评估、暴露确证、疾病预警、防治效果评价等方面起着重要作用。
生物标志物检测方法的研究是芥子气中毒或暴露确证的基础，对芥子气中毒的临床快速诊断，中毒程度的评估以及针对性的医疗救治具有重要意义。
芥子气在生物体内的主要代谢途径包括水解氧化、与蛋白质加合、与DNA加合、以及与谷胱甘肽加合后经β-裂解酶裂解形成一系列的化合物等。
芥子气的生物标志物类型包括：
原型、代谢物、DNA/蛋白加合物。
生物标志物如果是原型，则迅速反应;如果是代谢物，存在时间也较短（数日）;如果是DNA/蛋白质加合物，可以存在几周到几个月的时间，这就更有利于核查员到当地的检测（比如如何指正几个月前曾制造过芥子气的地点）。
接下来，谢研究员详细介绍了他们实验室在这方面所做的研究。
研究思路为：
合成纯化相关生物标志物参考品（含同位素标记参考品），然后建立溯源性技术方法（色谱-质谱联用技术，方法遵循FDA生物分析方法认证的要求），再研究染毒动物模型的时量效关系，并从体外实验，到体内，再到诊断治疗。
目前，其课题组已经分别建立了芥子气暴露后的DNA-加合物、蛋白质加合物、水解和代谢产物的高灵敏度、高选择性质谱分析技术方法：
（1）DNA加合物是由具有亲电集团的化合物或其体内代谢产物与DNA共价键合所形成的化合物，是DNA化学损伤最重要和最普遍的形式。
谢研究员课题组通过大鼠的体内外染毒实验-提取DNA-水解DNA-超高压液相色谱-三重四极杆离子阱串联质谱技术，揭示了N7-HETEG、O6-HETEG、Bis-G、N3-HETEA等四种DNA加合物在生物体内的分布及代谢过程，从分子水平研究HD-DNA加合物与暴露剂量、损伤效应之间的联系，为HD毒理机制的深入研究提供了技术基础;其中1-21天取血样和组织样可检测DNA加合物N7-HETEG，并可作为生物标志物。
（2）采用LC-MS/MS方法，进行HD-蛋白质加合物位点的筛选与评价。
芥子气与血液中丰度较高的蛋白（珠蛋白和HSA）均可发生多位点共价反应。
包括球蛋白的17条肽段，HSA的24条肽段以及球蛋白的N-端V残基、HSA的Q残基，另外还有16中氨基酸残基。
谢研究员分别介绍了芥子气与Glu残基、Cys残基、HSA肽段、珠蛋白间的加合反应及其加合位点。
然后设计了技术路线：
HD和
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