第八章酶催化Word格式.docx
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（2）基于生物催化与生物转化的物质加工新模式是人类发展的必然趋势；
（3）生物催化的独特优势可以促进传统产业的升级改造；
（4）生物催化对于我国的经济发展和安全具有战略意义。
生物催化的主要方式：
生物催化几乎能应用于所有化学反应，例如氧化反应、羟基化反应、脱氢反应、还原反应、水解反应、酰基化反应等。
生物催化材料有酶、微生物菌体、动植物的组织及细胞。
在手性合成中应用较多的是水解酶、氧化-还原酶以及面包酵母等微生物。
生物催化的方式有添加前体发酵法、游离酶法、静息细胞法、固定化酶法、固定化细胞法。
可在水相、有机相和水-有机溶剂双相等系统中进行。
生物催化反应的特点：
（1）高催化效率
（2）高专一性
（3）酶活性受一些化合物调控
酶催化能力举例
底物
催化剂
温度（K）
速度常数*
脲（水解）
H+
脲酶
335
294
7.4×
10-7
5.0×
105
2H2O22H2O+O2
Fe2+
过氧化氢酶
295
56
3.5×
107
*单位：
（mol·
L-1）-1·
s-1
NH3的合成：
在植物中通常是25℃和中性pH下由固氮酶催化完成，酶是由两个解离的蛋白质组分组成的一个复杂的系统，其中一个含金属铁，另一个含铁和钼，反应需消耗一些ATP（三磷酸腺苷）分子；
工业上由氮和氢合成氨时，需在700-900K、10-90MPa下，还要有铁及其他微量金属氧化物作催化剂才能完全反应。
酶催化的最适条件几乎都为温和的温度和非极端pH值。
专一性：
有些酶专一性很低（键专一性）,如肽酶、磷酸（酯）酶、酯酶,可以作用很多底物,只要求化学键相同,例如它们可分别作用肽、磷酸酯、羧酸酯;
具有中等程度专一性的为基团专一性,如己糖激酶可以催化很多己醛糖的磷酸化;
大多数酶呈绝对或几乎绝对的专一性，它们只催化一种底物进行快速反应。
调节性：
酸浓度的调节:
诱导或抑制酶的合成,调节酶的降解;
抑制剂的调节:
酶的活性受到大分子抑制剂或小分子抑制剂抑制,从而影响活力;
金属离子的调节:
有些酶需要K+活化,但Na+不能活化这些酶,有时还有抑制作用。
生物催化研究的新进展：
1.生物催化一进入传统的化工领域，就给原料来源、能源消耗、经济效益、环境保护等方面带来了根本性的变化。
2.作为生物技术第三次浪潮标志的生物催化技术已成为发达国家的重要科技与产业发展战略，以生物催化技术为核心的生物制造产业正以指数规律加速发展。
3.目前，美国在酶催化剂及手性化合物合成方面已处于领先地位，其生物催化制造的化学品产值已超过生物医药的产值。
所以，新的生物催化剂是21世纪可持续发展的化学加工业的必需工具。
到2020年通过生物催化技术，化学加工业的原料、水资源及能量消耗将各降低30％，减少污染物排放和污染扩散30％。
生物催化技术的应用领域：
工业部门
应用领域
成熟程度及应用情况
石油炼制
生物脱硫
工业示范
大宗化学品
乙醇/甘油
已成熟/工业示范
高分子聚合物
可生物降解聚合物
工业应用
特殊有机中间体
手性中间体
医药
医用蛋白/手性药物
农用化学品
生物杀虫剂
日用化学品
乳酸/柠檬酸
接近成熟/工业应用
环境保护
废物处理技术
开发中
现状：
1996年生物催化剂已占世界催化剂90亿美元市场的11%；
美国EBC成功开发了一种生物脱硫的新工艺；
我国：
生物催化丙烯腈制丙烯酰胺、有机废水发酵法制氢技术、生物发酵法制造甘油已建成投产或通过中试验证。
§
1酶的结构和分类
蛋白质是构成人体的基础物质、酶是蛋白质、酶由长链氨基酸组成、酶结构的4个层次：
溶菌酶（lysozyme）的一级结构图：
酶的二级结构:
α-螺旋和β-褶片
蛋白溶菌酶的三级结构图：
溶菌酶部分四级结构示意图：
氨基酸的排序决定酶的功能：
酶的分类（编号的第一个数字）：
表示这个酶属于哪一大类
氧化还原酶：
用于将电子从一个分子转移到另一个分子;
转移酶：
催化原子基团从一个分子转移到另一个分子;
水解酶：
催化底物与水之间的反应,以及将水结合到某些分子上;
裂解酶：
从底物上移去一个基团;
异构酶：
催化原子基团从一个位置转移到另一个位置;
连接酶：
利用共价键将分子连接到一起.
编号的第二个数字：
表示在类以下的大组
表示氧化反应供体基团的类型；
表示被转移基团的性质；
表示被水解键的类型；
表示被裂解键的类型；
表示异构作用的类型；
表示生成键的类型.
编号的第三和第四个数字：
编号的第三个数字：
表示大组下面的小组，各个数字在不同类别，不同大组中都有不同的含义；
编号的第四个数字：
是小组中各种酶的流水编号.
例如：
氧化还原酶的第二个数字E.C.1.（氢或电子供体）
醇（RR‘CHOH）1；
醛或酮（RR’C=O）2；
RR’CHCHRR‘3；
伯胺RCHNH24；
仲胺RR’CHNH—5；
NADH或NADPH6。
氧化还原酶的第三个数字E.C.1.1~6.（氢或电子受体）
NAD+或NADP+1；
Fe3+（如细胞色素）2；
O23；
其他未分类的受体99。
NAD+（NADP+）：
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸）
转移酶的第二个数字E.C.2.（转移的基团）
含一个碳原子的基团1；
醛基或酮基2；
酰基3；
糖基4；
含磷基团7。
转移酶的第三个数字，例如：
E.C.2.1.1转移甲基的酶类
E.C.2.1.2转移羟甲基的酶类
E.C.2.1.3转移羧基的酶类
E.C.2.4.1转移己糖基的酶类
E.C.2.1.4转移戊糖基的酶类
水解酶的第二个数字E.C.3.（水解的键）
酯键1；
糖苷键2；
肽键4；
肽键以外的C-N键5。
水解酶的第三个数字，例如：
E.C.3.1.1水解羧酸酯的酶类
E.C.3.1.2水解硫代酯的酶类
E.C.3.1.3水解磷酸单酯的酶类
E.C.3.1.4水解磷酸二酯的酶类
裂解酶的第二个数字E.C.4.（裂解的键）
C—C1；
C—O2；
C—N3；
C—S4。
裂解酶的第三个数字（以C—C裂解酶为例，移去基团为…）
E.C.4.1.1羧基（即CO2）
E.C.4.1.2醛基（CH=O）
E.C.4.1.3酮羧基（-OOC-C=O）
异构酶的第二个数字E.C.5.（反应类型）
消旋和差向异构1；
顺式-反式异构2；
分子内氧化还原酶类3；
分子内的转移反应4。
异构酶的第三个数字，例如：
底物…
E.C.5.1.1氨基羧
E.C.5.1.2羟基羧酸
E.C.5.1.3糖类
连接酶的第二个数字（合成的键）
C—O1；
C—S2；
C—C4
连接酶的第三个数字，例如：
进一步说明合成的键…
E.C.6.3.1羧酸-氨（胺）连接酶类酰胺合成酶类
E.C.6.3.2羧酸-氨基酸连接酶类肽合成酶类
2酶的分离与纯化
酶的纯化独有的特点：
特定的一种酶在细胞中的含量很少，给纯化带来了困难；
酶可以通过测定活力的方法加以跟踪，能迅速找出纯化过程的关键所在。
酶的纯化过程包括下列步骤：
••
建立一个适当的测活方法
测定酶活力方法要求高灵敏性、高准确性、是否经济、方法简单。
酶源选材要以含酶丰富、取材方便、经济为原则
例如，在分离纯化动物Cu、Zn-SOD（超氧化物歧化酶）时，一般以动物血球为原料；
Mn-SOD主要存在于线粒体中，所以肝、肾脏适宜作原材料；
利用动植物细胞体外大规模培养技术，可获得极为珍贵的原材料（如人参细胞、某些昆虫细胞等），用于酶的分离纯化；
利用基因工程重组DNA技术，使某些在细胞中含量极微的酶的纯化成为可能。
酶的提取
除在体液中提取酶或胞外酶外，一般是将含目的酶的生物组织破碎，促使酶增溶溶解，最大程度的提高抽提液中酶的浓度。
生物组织的破碎方法有：
机械法、超声波法、冻融法、渗透压法、酶消化法。
超声波法：
细菌和酵母细胞能得到很好的破碎；
问题：
超声空穴局部过热引起酶活性丧失，所以时间应尽可能短，容器周围以冰浴处理。
冻融法：
生物组织经冰冻后，细胞胞液结成冰晶，使细胞壁胀破；
简单易行，但效率不高，需反复几次才能达到破壁效果；
若冻融时间过长，还应注意胞内蛋白酶作用引起的后果，一般需在冻融液中加入络合剂EDTA等蛋白酶抑制剂以防破坏目的酶。
渗透压法：
是破碎细胞最温和的方法之一，细胞在低渗溶液中溶胀破碎；
此法对具有坚韧的多糖细胞壁的细胞，如植物、细菌和霉菌不太适用。
酶消化法：
利用溶菌酶、蛋白水解酶、糖苷酶对细胞膜或细胞壁的酶解作用，使细胞崩解破碎；
酶消化法常与其他破碎方法联合使用，如在大肠杆菌冻融液中加入溶菌酶就可大大提高破碎效果。
破碎生物组织一般在适当的缓冲溶液中进行。
典型的抽提液由以下几部分组成：
抽提液=离子强度调节剂+pH缓冲剂+温度效应剂＋蛋白酶抑制剂＋防氧化剂＋重金属络合剂＋增溶剂
酶的提纯：
常用的提纯方法如下。
性质
方法
溶解度
改变离子强度、改变pH、温度、改变介电常数
电荷极性
离子交换层析、色谱聚焦、电泳、等电聚焦
大小或重量
离心分离、透析超滤、凝胶过滤
亲和部位
亲和层析、免疫吸附层析、共价层析
酶的纯度检验
酶纯化的目标是使酶制剂具有最大的催化活性和最高纯度，以下几种方法用于检验这些指标：
1.酶纯度的检验
2.酶催化活性的检验
3.酶活性部位滴定
3酶活力测定
在酶作用下化学反应进行的速度，就代表酶的活力；
酶活力的测定，实质上就是一个测定为酶所催化的反应速度问题。
在实际测定过程中，为了保证测得的是初速度，往往使底物浓度足够大，把酶完全饱和，这样整个酶反应对于底物来说是零级反应，而对于酶来说是一级反应，这样测得的初速度可以比较可靠地反映酶的含量。
酶活力的测定方法：
中止法：
是在恒温反应系统中进行酶促反应，间隔一定的时间，分几次取出一定容积的反应液，使酶即刻停止作用，然后分析产物的生成量或底物的消耗量；
连续法：
不需取样中止反应，而是基于反应过程中光谱吸收、气体体积、酸碱度、温度、粘度等的变化用仪器跟踪监测反应进行的过程，算出酶活性。
一般的连续法包括：
光谱吸收法：
主要是指分光光度法和荧光法。
分光光度法是利用反应物和产物在紫外和可见光部分的光吸收不同，选择一适当的浓度，连续测定出反应过程中光吸收的变化。
该法适用于反应速度较快的酶；
荧光法是具有荧光性的化合物吸收了某一波长的光后发射出更长波长的光。
只要酶反应的底物或产物之一具有荧光，测定荧光的变化就可表示出酶反应的速度。
电化学法：
溶液的电势取决于被测物质的浓度和性质，采用这一原理制成的离子选择性电极，如pH电极可测定酶反应过程中反应液pH的变化，从而得知参与反应的酶的活力；
实际上，H+变化的酶促反应需要不断加入酸或碱来恒定溶液的pH值，才能使酶活力不发生变化。
量气法：
在酶反应底物或产物之一为气体时，可通过测量反应系统中气相的体积或压力的改变，计算出气体释放或吸收的量；
根据气体变化和时间的关系，即可求得酶反应速度，准确程度较光谱吸收法低。
量热法：
由于在反应过程中有反应热的变化，用非常灵敏的量热计可以测定酶反应速度；
量热法灵敏、无干扰，且很通用。
旋光法：
在某些酶催化反应中，底物和产物的旋光有所不同，这时就可以根据旋光的变化来跟踪酶反应过程；
在某些情况下，可通过形成络合物来提高旋光度。
酶活力的定义与表示方法：
国际酶学委员会曾规定：
一分钟内转化一个微摩尔底物所需的酶量为一个国际单位IU；
规定反应必须在25℃，在具有最适底物浓度、最适缓冲液离子强度和pH的系统内进行；
EC推荐一个新的酶活力国际单位kat:
一个kat单位定义为:
每秒钟能使一个摩尔底物转化的酶量,则1kat=6×
107IU。
酶反应的分析：
总反应
部分反应
一个由特定的酶所催化的化学反应，当写作计量化学方程式时，就称为总反应（Overallreaction）；
从底物A与B生成产物P与Q的总反应，可写作：
E+A+B=E+P+Q
在适当条件下（如缺少一种底物），那么总反应的一部分就能被观察到，这就称作部分反应；
举例：
Eox+S→Ered+P
Ered+O2→Eox+H2O2
编号E.C.1.1.3.4的葡萄糖氧化酶催化的总反应为：
β-D-葡萄糖+O2D-葡萄糖酸-δ-内酯+H2O2
4酶作用动力学
一、单底物酶促反应动力学
∙以底物S、生成产物P的酶催化反应为例，以E表示酶，其反应历程如下：
E+SESP+E
∙第一步：
酶和底物形成中间配合物ES；
∙第二步：
ES配合物释放能量，生成产物P和酶。
单底物酶催化反应与非酶催化反应的进程曲线图如下：
对典型的单底物酶催化反应：
酶的总浓度：
（CE）t=CE+CES
假定S、E和ES很快达到平衡，ES的分解是控速步骤，则在平衡时
其中：
kM是酶的特性常数，表明酶和底物间亲和力的大小，kM愈小的酶，其催化活性愈高。
酶催化反应的速率：
r=k2CES，代进上式，得
即Michaelis-Menten（米氏）动力学方程。
k2也称为kcat，代表酶催化反应的转化数（turnovernumber）。
在极限情况下：
1.若底物浓度很大，使催化活性中心饱和，Cs>
kM，此时上式简化为
Kcat为一级速率常数，反应速率取决于酶量。
若反应速率以每个酶分子来表示，而不是以单位体积来表示，则应为零级反应。
2.如果底物对活性中心覆盖度很低，CS《kM，动力学方程简化为：
Kcat/kM为二级反应速率常数，若反应速率以每个活性中心表示，则为表观一级反应。
∙从动力学方程可见，酶的浓度、底物浓度、产物浓度都影响酶催化反应速率。
此外温度、酸碱度、离子强度和抑制剂也会影响酶催化反应。
∙酶催化反应速率与温度的关系服从Arrhenius方程，温度升高时，反应速率呈指数上升，与化学催化的规律相同；
但酶蛋白质温度过高，则易于变性，导致酶的催化活性下降，甚至失活；
一般蛋白质在45-50℃便开始变性，到55℃变性已相当严重。
酶促反应按底物数分类：
底物数
酶分类
催化反应
酶种类占总酶
1.单底物
异构酶
AB
5%
2.单向单底物
裂解酶
AB+C
12%
3.假单底物
水解酶
A-B+H2OA-OH+BH
26%
4.双底物
氧化
还原酶
基团转移酶
AH2+BA+BH2
A+BXAX+B
27%
5.三底物
连接酶
A+B+ATPAB+ADP+P1
30%
二、酶作用于多底物时的动力学
双底物、双产物反应通式为：
考虑酶与底物是否形成三元络合物，将酶分为两大类。
1.反应过程中形成三元络合物
2.反应过程中不形成三元络合物
E+A+BEABEPQE+P+Q
形成了三元络合物。
A+EEAFPFFBEQE+Q
酶首先与一个底物结合，释放一个产物，再与另一个底物结合，再释放出产物，即底物和产物交替地与酶结合或从酶释放。
好像打乒乓一样一来一去。
反应过程中无三元络合物形成。
双底物反应恒态动力学：
Alberty推导的一般速度方程为：
Vmax—A、B都饱和时的最大初速度；
KmA—B饱和时v0=1/2Vmax的A的浓度；
KmB—A饱和时v0=1/2Vmax的B的浓度；
KsA—E+AEA的解离常数。
双底物动力学方程的简化：
（1）在[B0]很高时，方程简化为：
（2）在[A0]很高时，方程简化为：
5酶的抑制作用
许多物质与酶结合以后，影响了酶与底物的结合及酶的转化数，从而改变了酶的活力。
这些降低酶催化反应速度的物质称抑制剂。
很多抑制剂结构类似底物，但不被酶所催化或与底物相比反应速度极慢。
∙可逆抑制剂：
以可逆方式与酶结合，可通过透析、直接稀释、凝胶过滤等物理手段使酶活性恢复；
∙不可逆抑制剂：
不能用上述物理手段除去。
酶的抑制作用：
a.可逆抑制作用
∙竞争性抑制
原理：
竞争性抑制剂结构往往与正常底物非常相似，因而与底物竞争酶分子上的同一结合部位，与酶结合的抑制剂缺乏具有反应活性的基团或处于不恰当的部位，使酶无法发挥催化功能，底物不能转化为产物，上述任一情形下都会形成死端复合物（dead-endcomplex）。
丙二酸（CO2-•CH2•CO2-）是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂：
丙二酸与琥珀酸结构非常相似，都具有两个羧基，因而可以占据酶分子上底物的结合位点.但由于丙二酸在两个羧基之间只有一个碳原子，不会形成双键，因而不会发生后续反应。
竞争性抑制剂与底物结合部位相同：
竞争性抑制剂与底物结合部位不同：
∙反竞争性抑制
反竞争性抑制剂（I）只与酶-底物复合物结合而不与自由酶结合。
E+SES（ESI）E+P
反竞争性抑制示意图：
ESI
∙非竞争性抑制
不论底物分子是否与酶结合，非竞争性抑制剂都能与酶分子结合，产生死端复合物。
E（EI）+SES（ESI）E+P
EIESI
非竞争性抑制示意图：
∙混合型抑制
若底物和抑制剂与酶的结合完全独立，这种现象就称为混合型抑制。
∙部分抑制
以上讨论的都是形成死端络合物的抑制，而这些复合物不会释放产物。
部分抑制就是指混合型抑制中ESI复合物也能释放产物。
ESIE+P+I
∙底物抑制
在给定的酶浓度下，酶催化反应的速度随底物浓度的增加而加快，至极限Vmax；
有时，在极高的底物浓度下，初速度仍低于最大值，有时认为测定系统与过量底物之间有相互作用，但在有些情况下的确发现高浓度的底物会抑制自身转化为产物。
∙产物抑制
产物对酶反应的抑制作用在生物体内较为常见，在细胞内，酶反应的产物虽然不断地为另外的酶所作用，但S和P总是同时存在的；
在单底物酶反应中，产物P对反应速度的影响相当于底物S的竞争性抑制对反应速度的影响。
∙变构抑制
抑制剂与酶结合，引起酶构象的改变，使底物结合部位的性质发生变化和改变了后续的催化活性，而不是指形成死端复合物.
例如：
某一生物合成途径表示为
ABCDEF
产物F作为这一合成途径中几个早期的酶（如AB的酶）的变构抑制剂，对这一合成途径加以反馈抑制，以避免产物过量堆积。
b.不可逆抑制作用
抑制剂与酶的必需基团以共价键连接，将必需基团进行了化学修饰，从而引起酶活性的丧失；
被修饰的基团可以很多，多至酶蛋白中相似性质的基团都被修饰，也可专一地只修饰某一个必需基团。
6pH值和温度对酶作用的影响
pH值对酶活性的影响主要是：
∙使酶的空间结构破坏，引起酶活性丧失；
∙影响酶活性部位催化基团的解离状态，使底物不能分解为产物；
∙影响酶活性部位结合基团的解离状态，使其不能与底物结合；
∙影响底物的解离状态，使底物不能和酶结合，或结合后不能生成产物。
综合上述种种原因，用酶活力对pH作图往往有钟罩形曲线，酶的作用存在一最适的pH值，它和酶的最稳定pH值不一定相同。
温度值对酶作用的影响：
∙影响酶的稳定程度，酶蛋白的热变性；
∙影响最大反应速度，即k2；
∙影响酶和底物的结合，即影响k1或k-1；
∙影响酶和抑制剂、激活
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