植物生物技术考试重点Word文档下载推荐.doc
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组织培养中常用的培养基主要有：
MS、White、N6、B5、Heller、Nitsch、Miller、KM-8P
培养基种类
固体培养基：
加凝固剂（多为琼脂）的培养基；
液体培养基：
不加凝固剂的培养基。
初代培养基：
用来第一次接种从植物体上分离下来的外植体的培养基。
继代培养基：
用来接种继初代培养之后的培养物的培养基。
基本培养基：
只含有机和无机成分，但不包括糖、激素和复杂有机添加物等。
完全培养基：
基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如植物生长调节物质和其它复杂有机附加物等。
2、培养基的特点
MS培养基--大量元素。
特点：
无机盐的浓度高，具有高含量的氮、钾，尤其硝酸盐的用量很大，同时还含有一定数量的铵盐，这使得它营养丰富，不需要添加更多的有机附加物，就能满足植物组织对矿质营养的要求，有加速愈伤组织和培养物生长的作用，当培养物久不转移时仍可维持其生存。
White（WH）培养基。
无机盐浓度较低。
它的使用也很广泛，无论是生根培养还是胚胎培养或一般组织培养都有很好的效果。
N6培养基。
KNO3和（NH4）2SO4含量高，不含钼。
目前在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养和组织培养。
B5培养基。
含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。
铵盐可能对不少培养物的生长有抑制作用，但它适合于有些植物如双子叶植物特别是木本植物的生长。
KM-8P培养基。
特点是有机成分较复杂,它包括了几乎所有的单糖和维生素、呼吸代谢中的主要有机酸。
主要用于原生质体培养。
固体培养基和液体培养基：
固体培养基：
使用简便，一般用于组织、愈伤组织、短枝、茎尖等材料的培养。
特别适合植物的快速繁殖。
缺点：
一块外植体只能部分接触培养基，不能浸没在培养基中，结果培养物上下部因接受养分不匀而形成差异，不易使细胞群体保持一致。
液体培养基（不加琼脂）：
提供比较均匀的营养，而且细胞的增殖速度快，一般用于细胞，原生质体的培养，也可用于愈伤组织的培养，胚状体等材料的继代培养。
11、植物组织培养室需要控制的条件。
温度：
大多数植物组织培养温度在23~27℃之间。
低于15℃时培养，植物组织会表现生长停止，高于35℃时对植物生长不利。
不同植物培养的适温不同。
月季是25~27℃、番茄是28℃。
温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度，也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。
如烟草芽的形成以28℃为最好，在12℃以下，33℃以上形成率皆最低。
光照：
主要表现在光照强度、时间长短、光照质量等。
有的材料培养需要光，有的则不需光；
不同的植物所需的光照强度也不一样。
一般1000-5000Lx/12-16h/天。
湿度：
湿度影响包括培养容器内湿度和环境湿度。
容器内湿度水平主要受培养基水分含量和封口材料的影响。
封口材料直接影响容器内湿度情况。
封闭性差的材料易导致培养基干燥；
封闭性高的封口材料易引起透气性不好。
湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进行。
湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。
气体环境:
氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。
通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起污染。
固体培养基可加进活性炭来增加通气度，以利于发根。
培养室要经常换气，改善室内的通气状况。
液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等。
12、植物组织培养最常用的C源、常用的激素及其作用和浓度？
蔗糖2%~5%作为植物生长发育所需的营养物质和调节培养基中的渗透压
生长素诱导细胞分裂和根的分化
细胞分裂素促进细胞分裂和由愈伤组织形成器官，分化不定芽
赤霉素刺激在培养中形成的不定胚发育成小植株
油菜素内酯促进伸长提高植物內源生长素
乙烯促进RNA和蛋白质合成和使细胞膜透性增加
脱落酸抑制外植体形成体细胞胚状体
13、植物组织培养中培养基配制过程中应注意的环节？
培养基的配制：
准备工作、母液的配置和保存、培养基配置、培养基的灭菌
配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。
药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。
各种药品要充分溶解再依次混合.配制时注意一些离子之间易发生沉淀（如Ca2+和S042-）。
铁盐容易发生沉淀，需单独配制。
培养基的配制注意事项：
1、溶解特征：
大量元素易沉淀；
2、标签（浓度、日期）
3、保存期：
发现沉淀不能用。
培养基的配制步骤：
1、将配制好的母液按顺序排列，
2、列表计算各母液用量
3、先取适量的蒸馏水放入容器，再依次加入母液
4、加入肌醇和蔗糖，定容后调pH
5、加入琼脂，煮开至完全溶解
6、分装到组培容器
7、封口，贴标签
14、植物组织培养的理论依据？
植物细胞全能性
组织培养的生理依据：
激素（植物生长调节剂）调控
15、植物组织培养技术在目前农业生产上的应用？
1育种上的应用:
单倍体育种：
快速纯化个体，缩短育种年限，提高育种效率等作用。
远缘杂交：
克服杂交不亲和性，用于植物的远缘杂交；
体细胞杂交；
胚珠培养。
体细胞变异的应用：
果树苗木等。
单细胞突变体的筛选：
抗性育种。
2种子繁育与生产：
快速繁育：
兰花、香蕉、甘蔗、咖啡等。
获得脱毒植株，提高种性：
病毒可通过维管束传递，茎尖细胞分裂很旺，几乎没有病毒，如土豆。
人工种子：
不受气候影响，苜蓿、芹菜、胡萝卜等。
3植物产品的工厂化生产：
喜树的喜树碱（抗癌），人参皂苷，香料植物的香油精。
4种质资源的保存：
对于难于产生种子，种子不易保存，或珍稀的植物。
番薯的块根保存很难，可以取其茎尖进行组织培养，进行保存。
16、简述植物组织无菌培养的一般步骤？
外植体表面消毒：
将外植体置于有螺丝盖的玻璃瓶中,注入含有几滴活化剂的浓度适当的消毒液,使材料完全浸没在消毒液中,盖上盖,把玻璃瓶置入超净工作台。
消毒期间摇动2-3次,使消毒液充分接触植物组织。
消毒处理后,打开瓶盖,倒出消毒液,注入适量的无菌蒸馏水,再盖上盖,摇动数次,将水倒掉如此重复3～4次。
将材料取出,置于一个已经灭菌的培养皿中。
器械消毒：
将所要使用的器械（如解剖刀、镊子、剪刀等）置入95%乙醇中,取出后于酒精灯火焰上灼烧,待冷却后即可使用。
所有操作器械需使用一次,消毒一次。
用这些消过毒的将已经过表面消毒的材料切取或剥取适当的外植体。
o将培养容器的盖或塞子打开,将外植体接种到培养基上,如果使用的是玻璃培养容器,把瓶口置酒精灯火馅上烘烤数秒钟,然后迅速用瓶盖或瓶塞封严。
17、与整体植物相比，植物离体组织有哪些特点？
整体植物不同的器官具有明显的分工，只要有水和无机盐就可以完成整个生命过程。
离体组织与植株没有了物质、能量和信息的交流，从而：
1、生长发育不受植株的控制，可以脱离原来的发育路线；
2、得不到生长发育所需要的培养，从自养变成异样。
3、所需要的营养与活体组织所需要的营养具有很大的差别。
能量来源（碳源）；
有机成分、激素等。
18、简述激素在植物组织离体培养过程中的作用？
19、常用的PCR技术有哪些？
20、PCR反应的条件？
21、PCR反应中关键的试剂有哪些？
22、什么是离体授粉？
23、柯斯质粒？
24、载体的种类以及载体应具备的特性？
25、质粒载体构建的基本原则，以及质粒载体的一般生物学特性？
26、噬菌体的特征？
什么是溶菌周期，什么是溶源周期？
27、同源基因的共抑制效应？
28、基因克隆操作中常用的工具酶种类？
29、基因克隆的本质以及基因克隆主要包括哪些内容？
30、简述植物基因组文库构建的一般步骤以及构建原则？
31、什么是转基因育种？
转基因育种有哪些特点？
32、理想的植物受体系统应符合的条件
33、根据你的理解详细说明农杆菌介导的转基因技术（包括土壤农杆菌Ti质粒转化系统和发根农杆菌Ri质粒转化系统）有哪些优点？
34、以水稻为例详细介绍农杆菌介导的转基因技术的具体操过程?
35、外源基因整合到植物染色体上的主要的分子鉴定方法？
36、转基因检测可以从哪些方面进行检测，具体的检测原理是什么？
植物基因工程理论上的三大发现：
DNA为遗传信息的携带者。
DNA的双螺旋模型和半保留不不连续复制机制。
中心法则和操纵子模型。
植物基因工程技术上的三大发明：
DNA体外切割与连接技术。
基因工程载体的使用。
DNA分析技术：
电泳、测序、杂交技术。
基因工程的定义：
用人工的方法，从不同生物中提取外源基因及载体DNA，经过体外切割、拼接和重组，然后采取某种方法，把重组后的带有外源基因的载体DNA引入植物细胞，并使其在植物细胞内进行复制和表达，以达到预期改变受体植物细胞遗传特性的目的。
它的核心是重组DNA技术。
也称：
遗传工程，基因操作，基因克隆，分子克隆。
基因工程的生产应用：
克服远缘杂交（有性杂交）的困难。
1、使基因在动物、植物，微生物不同生物系统中传递。
2、快速、定向的获取人类所需要的生物新类型。
细胞工程的定义：
利用细胞培养、细胞融合等细胞生物学方法对细胞进行改造，使细胞按人类需要生产有用的产品，或者遗传物质，从而培育新的生物类型。
包括：
细胞杂交技术、单克隆抗体、细胞大规模培养技术。
细胞工程的应用--原生质体融合
植物组织培养室设计：
准备室（培养基室）
接种室（无菌操作）
培养室（控制温光）
细胞室（细胞研究）
培养基的成分:
水、无机盐、有机成分、植物生长调节剂、碳源、凝固剂及其它附加物
1、无机营养
无机物中有16种是植物必须的，即C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl。
I虽然不是植物必需元素，但几乎所有的培养基中都添加I。
植物所需要的浓度大于0.5mmol/L的元素为大量元素，小于0.5mmol/L的元素为微量元素。
缺氮：
表现出一种很注目的花色素苷的颜色，愈伤组织不能形成导管；
缺钾或磷：
细胞过度生长，形成层组织减退；
缺硫：
愈伤组织褪绿；
缺铁：
细胞分裂停止；
缺硼：
细胞分裂停滞，细胞伸长；
而缺锰铜则会影响细胞伸长。
2、有机成分--氨基酸
氨基酸是蛋白质的组成成分，也是一种有机氮化合物。
常用的有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸以及多种氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白）等。
有机氮作为培养基中的惟一氮源时，离体组织生长不良，只有在含有无机氮的情况下，氨基酸类物质才有较好的效果。
有机成分--维生素类
能明显地促进离体组织的生长。
培养基中的维生素主要是B族维生素，如硫胺素（维生素B1）、吡哆醇（维生素B6）、烟酸（维生素B3，又称维生素PP）、泛酸（维生素B5）、生物素（维生素H）、钴胺素（维生素Bl2）、叶酸（维生素B11）、抗坏血酸（维生素C）等。
有机成分--天然有机物
有机附加物包括有些成分尚不清楚的天然提取物，如椰乳（CM）、香蕉泥、番茄汁（TJ）、马铃薯泥、苹果汁、生梨汁、西瓜汁、酵母提取液（YE）、麦芽浸出物（ME）等。
有机成分--肌醇
肌醇：
环己六醇，帮助活性物质作用
其他：
单核苷酸等。
3、碳源
糖在植物组织培养中是不可缺少的。
它不但作为离体组织赖以生长的碳源，且还能使培养基维持一定的渗透压（一般培养基渗透压维持在1.5～4.1MPa）。
渗透压对细胞的增殖和胚状体的形成都有十分明显的影响。
一般多用蔗糖调节渗透压，其浓度为1％～5％，也可用麦芽糖、葡萄糖或果糖等。
葡萄糖或果糖价格稍贵，但可防褐化。
麦芽糖价格贵，细胞培养时用。
4、激素
激素对愈伤组织的诱导、器官分化及植株再生具有重要的作用.
培养基中的关键物质:
主要包括生长素、细胞分裂素、赤霉素（GA3）、脱落酸（ABA）、乙烯。
激素--生长素
生长素能影响植物茎和节间的伸长、向性、顶端优势、叶片脱落、生根等现象。
离体培养中的作用：
诱导愈伤组织的产生；
促进细胞脱分化；
促进细胞的伸长；
促进生根。
常用的生长素有吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、2，4—二氯苯氧乙酸（2，4－D）。
IAA、NAA、IBA、2,4-D之类生长素，可先用少量0.1N氢氧化钠或乙醇溶解，然后再定容到所需要的体积。
激素--细胞分裂素
细胞分裂素影响植物细胞分裂、顶端优势的变化和茎的分化等。
培养基中加入细胞分裂素，主要是为促进细胞分裂和由愈伤组织形成器官，分化不定芽。
由于这类化合物有助于解除顶端优势对腋芽的抑制作用，可用于茎的增殖。
细胞分裂素有天然的和人工合成的。
常用的有玉米素（ZT）、苄氨基腺嘌呤（6－BA）、激动素（KT）等。
KT、BA等细胞分裂素则可用少量0.1N盐酸加热溶解，然后加水定容。
激素比
当配制的培养基中生长素/细胞分裂素的比例高时则有利于生根；
生长素/细胞分裂素的比例低时则有利于生芽；
若两者浓度相当时，既不利于生根，也不利于生芽，而是愈伤组织的产生占优势。
其它的一些激素：
赤霉素，植物组织培养中常用的是GA3。
脱落酸，在植物组织培养中对培养物有间接的抑制作用，它可抑制外植体形成体细胞胚状体。
水杨酸（阿司匹林），能抑制ABA的形成，有利于胚状体的形成。
5、凝固剂
在固体培养时，琼脂是使用最方便、最好的凝固剂。
琼脂是一种高分子的碳水化合物，以色白、透明、洁净的为佳，仅溶解于热水，冷后（40℃以下）即凝固为固体状的凝胶。
琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式等有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸、过碱也会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。
琼脂糖：
原生质体培养时用。
Phytogel：
新型凝固剂。
6、水
植物组织培养所必需
培养基的配制必须用超纯水
细胞培养主要用蒸馏水
7、活性炭（AC）
活性炭加入培养基中的目的主要是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响，如防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。
这在兰花组织培养中效果更明显。
活性炭使培养基变黑，有利于某些植物生根。
活性炭对物质吸附无选择性，因此使用时应慎重考虑，不能过量，一般用量为0.1％～0.5％。
活性炭对形态发生和器官形成有良好的效应。
8、培养基的pH
培养基的pH因培养材料不同而异，大多数植物都要求在pH5.6～5.8的条件进行组织培养。
在培养过程中，培养基的pH不是一成不变的，往往随着培养基的水分和养料的消耗，pH会发生一些变化。
高压灭菌会降低培养基中的pH。
配制培养基时，常用0.lmol／L的NaOH和0.lmol／L的HCl来调节培养基的pH。
pH的高低会影响琼脂的凝固能力：
pH>
6培养基变硬，pH<
5琼脂不易凝固
培养基的灭菌和存储：
培养基一般采用湿热灭菌法，压力108kPa、温度为121℃时，维持20min。
某些激素（如GA3、ZT、IAA）、抗生素以及某些维生素等，遇热时容易分解，不能进行高压灭菌。
当使用这类化合物时，可选择使用孔径为0.45μm或更小的细菌滤膜过滤灭菌。
培养基一般需冷却到60℃以下（恰在琼脂凝固之前）再加入这些遇热分解化合物。
将滤膜安在过滤器里面进行高压灭菌。
过滤器的灭菌温度不应超过121℃。
植物组培培养中污染的来源：
（1）培养容器；
（2）培养基本身；
（3）外植体；
（4）接种室的环境；
（5）操作用的器械；
（6）培养室的环境。
可以通过灭菌措施防止或减少污染源
常用的灭菌方法：
物理灭菌：
高温高压灭菌、干热灭菌（烘烧和灼烧）、湿热灭菌、辐射（紫外线、超声波、微波）灭菌、过滤灭菌。
化学灭菌：
酒精、升汞、过氧化氢、高锰酸钾、次氯酸钠、抗生素等化学药品处理，根据工作中的不同材料不同目的适当选用。
熏蒸灭菌、喷雾灭菌、消毒液灭菌。
高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。
培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解为葡萄糖和果糖。
培养基值小于5.5，其水解量更多，培养基中含有活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强。
灭菌注意事项：
1、GA3、维生素、蔗糖等的降解问题；
2、灼烧问题；
3、紫外灯的危害；
4、消毒剂对皮肤的损害。
脱分化：
指高度分化的植物器官、组织或细胞，在离体培养条件下经过多次细胞分裂逐渐失去原来的结构、功能和分化状态，形成无组织结构的愈伤组织或细胞团的过程。
再分化：
指离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化，形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官，甚至形成完整植株。
植物组织培养步骤：
植物组织培养的类型：
愈伤组织培养:
最为常见的组织培养
器官培养:
根、茎、叶、花等
胚培养：
胚、胚乳、珠心、子房、
细胞培养和原生质体培养：
悬浮培养、单细胞培养
外植体消毒的一般步骤：
1、预处理，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。
经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和真菌。
2、将外植体置于无菌的玻璃瓶中，加入75%的酒精溶液浸泡材料10S左右。
倒出酒精，用无菌水冲洗一次。
3、将适当浓度的消毒液（0.1%升汞或2%次氯酸钠），使材料完全浸没在消毒液中，盖上瓶盖，把玻璃瓶置入超净工作台灭菌一定时间。
在灭菌期间须摇动玻璃瓶2-3次。
4、消毒处理后，将消毒液倒出，注入适量的无菌蒸馏水漂洗，将水倒掉，重复3-4次。
外植体培养
固体培养法：
用琼脂或植物胶固化培养基来培养植物材料的方法。
该方法操作简单，通气好，外植体固定，利于愈伤组织的诱导、分化，应用最广；
但养分分布不均，生长速度不均衡，有毒物质积累，并常有褐化中毒现象发生。
液体培养法：
即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。
一般用于愈伤组织的繁殖、分散；
主要用于分离单细胞和产生体细胞无性系，生产次生代谢物质。
由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，
优点：
生长繁殖快、均匀，工厂化生产
需要摇床，频繁继代，不利分化。
初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。
即接种某种外植体后，最初的几代培养。
初代培养时，常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。
初代培养建立的无性繁殖系包括：
茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。
根据初代培养时发育的方向可分为:
顶芽和腋芽的发育、不定芽的发育、体细胞胚状体的发生与发育。
继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程，外植体或愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。
继代培养的后代是按几何级数增加的过程。
生根培养是使无根苗生根的过程，目的是使生出的不定根浓密而粗壮。
生根培养可采用1/2或者1/4MS培养基，全部去掉细胞分裂素，并加入适量的生长素（NAA、IBA等）。
快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程，而继代培养则是经常性不停的进行过程。
但在达到相当的数量之后，则应使其中一部分转入生根阶段。
增殖只是贮备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出成品。
若不及时将培养物转到生根培养基上去，就会使久不转移的苗子发黄老化，或因过分拥挤而使无效苗增多造成抛弃浪费。
（1）愈伤组织
外植体先形成愈伤组织，再分化成完整的植株。
在愈伤组织上同时长出芽和根，以后连成统一的轴状结构（较少），育成植株；
在愈伤组织中先形成茎，后诱导成根，再发育成植株；
在愈伤组织中先形成根，再诱导出芽，得到完整植株。
但在培养中一般先形成根的，往往抑制芽的形成；
而相反，一般先产生芽的，则以后较易产生根。
（2）胚状体发生
组织培养中再生植株可通过与合子胚相似的胚胎发生过程，即形成胚状体，再发育成完整植株。
胚状体可以从以下几种培养物产生：
直接从器官上发生；
愈伤组织发生；
从游离单细胞发生；
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