组织培养实验植物部分Word格式文档下载.docx

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制备无菌水：

121℃（103kPa）灭菌40min；

配制0.1%HgCl2溶液（放置棕色瓶中）；

准备接种用培养皿、金属器械等用具。

注意：

1.实验前1天，无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。

然后紫外线消毒。

2.实验中所用的各种容器一定要洗净、烘干。

3.用电子天平称量药品时，一定要用称量纸，对于有腐蚀性的药品，应将其放置在小烧杯中称量。

4.各种母液应保存在2-4℃的冰箱中，以免变质、长霉。

5.使用高压灭菌锅时，一定要正确操作，并提前检查其中的水是否合适。

6.HgCl2属于一种腐蚀性极强的剧毒物品，配制时要注意安全。

实验二植物的离体培养（两次课程）

1：

尝试进行植物的组织培养

2：

了解植物组织培养的基本原理

材料：

胡萝卜、菊花花蕾，灭菌培养基，体积分数为70%的酒精，体积分数为20%的次氯酸钠溶液，无菌水。

用具：

锥形瓶或大试管，烧杯，酒精灯，恒温箱，接种箱，滤纸，消毒用酒精棉球，培养皿，解剖刀，镊子、打孔器。

1.外植体消毒：

在接种箱上将胡萝卜段用酒精消毒并用无菌水清洗，再用次氯酸钠处理，立即用无菌水消毒。

用无菌滤纸吸去外植体表面的水分，用无菌解剖刀锲成横切片，再选取有生命力旺盛的部位，切成小块。

2.接种：

将组织块接种到培养基上，用锡箔纸封盖瓶口，并用橡皮筋扎紧。

3.培养：

将接种后的组织块，放在23～26℃恒温避光条件下培养，一周后，检查培养材料的污染情况；

14天后，观察愈伤组织的生长状况。

诱导愈伤组织是细胞培养的基础，愈伤组织经过不断继代培养才能变得疏松，易于分散，有利于建立良好的悬浮系。

外植体组织。

1.设计不同激素比例的继代培养基。

2.选择待培养物伤口周围长出的淡黄色、疏松、生长良好的愈伤组织转移至新培养基中继代。

将接种后的组织块，放在23～26℃恒温避光条件下培养，一周后，观察愈伤组织的生长状况。

以下部分内容供你们参考。

植物组织与细胞培养技术

实验一、植物组织细胞培养及其操作的基本知识认识

植物组织与细胞培养是把植物的器官、组织或单个细胞，应用无菌操作技术，使其在人工条件下能够继续生长，甚至发育成为完整植株的过程。

植物的器官、组织或细胞在一定的培养条件下，原来已经分化不再生长的细胞又重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。

然后，在一定的条件下，愈伤组织又能重新分化，形成输导组织以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。

植物细胞的脱分化和再分化，充分体现了植物细胞的全能性。

一、植物组织与细胞培养实验室

植物组织与细胞培养室一般分为无菌区、培养区和准备区三部分。

无菌区应相对隔离，有空气净化装置，要求达到100000级。

而保证接种无菌的超净台，要求清洁级别达到100级。

培养区要求密闭，保湿保温。

准备区的要求相对低些，以供工作人员更衣，并起到缓冲的作用。

（一）无菌操作设施

主要有无菌操作室、净化工作台（超净台）。

无菌操作室：

为专用于进行组织培养和各种无菌操作的空间，空间大，与外界隔离，以便于进行大规模培养工作。

其中包括操作间、缓冲间和更衣间。

操作间大小应适度，过大清扫和消毒不便，一般为3～5平方米，最小也要能容纳两人同时操作。

缓冲间能保护无菌间的无菌环境，应稍宽敞，可设有恒温培养箱和小型离心机等，一些简单操作不必携出室外即可完成。

缓冲间可同时和几个操作间相通。

无菌操作室密闭不透风，温度和湿度较高，紫外线消毒后产生臭氧，均有损于工作人员健康，应安装过滤空气的恒温恒湿调节装置。

净化台：

也称超净工作台，是目前已普及应用的无菌操作装置。

其原理是利用鼓风机，驱动空气通过高效滤器净化后，徐徐通过工作台面，使工作场地构成无菌环境。

净化台按气流方向的不同有几种类型：

侧流式，即净化后气流由左或右侧通过工作台面流向对侧，也有从上向下或从下向上流向对侧的，都能形成气流屏障保持台面无菌。

但在净化气流和外边气体交界处可因气流的流动出现负压，使少许未净化气体混入，有发生污染的可能。

另一型为外流式，气流面向工作者方向流动，能保证外方气体不能混入，只是在进行有害物实验时对工作者不利，但可采用有机玻璃把上半部遮挡起来，让气体从下方流出。

另外，还有清洗和准备区、观察和研究区等。

（二）实验室设备

从事植物组织与细胞培养工作，所需设备较多，主要分仪器、器械、培养器皿和杂用品等几类。

1．大型装置和仪器

主要有：

电热恒温培养箱、电热干燥箱、冰箱、显微镜、水纯化装置、洗刷装置、抽滤装置、细胞冷冻贮存器、离心机、天平等。

2．器械

主要用于解剖、取材以及切割。

各种器械需配置几套，灭菌后保存，操作时随取随用，每次用一套。

对于刃具的器械，要注意保护好刀锋。

各种器械使用后，要及时洗刷干净，再用酒精棉球擦拭后晾干，以防生锈。

3．培养器皿

组织培养中使用大量各种瓶皿，有玻璃器皿和塑料器皿两大类。

玻璃器皿：

各种玻璃器皿应选择透明度好、由无毒的中性硬质玻璃制成。

常用的有：

玻璃瓶（主要用于配制贮存各种培养液）、培养瓶（主要用于培养细胞）、培养皿（用于盛取组织和分离组织，或用于集落形成的测定，单细胞分离等）以及吸管、离心管、烧杯、量筒、漏斗等。

塑料器皿：

近来广泛使用塑料器皿进行组织培养。

这种特制的塑料器皿具有透明平滑、无毒性、利于细胞生长等优点。

主要的塑料器皿有：

多孔培养板，每块培养板有数孔或数十孔，体积小，宜于少量细胞或单个细胞克隆的生长。

规格有4孔、6孔、24孔、96孔等。

另外还有培养皿、培养瓶等，还有一些特殊用途的塑料制品，如冻存细胞的塑料安瓿瓶，离心用微量离心管、微量加样器头等。

4．杂用品

主要包括小件用品消毒包装用的铝饭盒，套在吸管上的胶头，各种瓶塞等。

二、植物组织与细胞培养基本操作

在无菌条件下，组织培养为细胞或组织的生长和繁殖提供了充分优化的营养及适宜的温度、湿度、光照等条件。

因此，创造无菌的环境，是组织培养的前提条件。

以下分别介绍洗涤、消毒和灭菌。

（一）玻璃器皿的清洗

植物组织培养所使用的玻璃器皿是否清洁，直接影响实验结果，往往由于器皿的不清洁或被污染（主要是器皿表面的油污、金属离子、酸、碱等有害物质）造成较大的实验误差，甚至出现相反的结果。

初用玻璃器皿的清洗：

新买的玻璃器皿表面附有游离的碱性物质，可先用洗洁精洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在1～2％盐酸溶液中过夜（不少于4h），再用自来水冲洗。

最后用蒸馏水冲洗2～3次。

在100～130℃烘箱内烤干备用。

使用过的玻璃器皿的清洗：

先用自来水洗刷至无污物，再用大小合适的毛刷沾取少许洗洁精，将器皿内外（特别是内壁）细心洗刷。

用自来水冲洗干净后，再用蒸馏水冲洗2～3次，烘干或倒置在清洁处备用。

吸量管、滴定管等，使用后应立即浸泡于清水中，不要使物质干涸，以除去附着的试剂、蛋白质等。

晾干后浸泡在铬酸洗液中4～6小时，再用自来水充分冲洗，最后再用蒸馏水冲洗2～3次，风干备用。

凡洗净的玻璃器皿，不应在器壁上带有水珠，否则表示没有洗干净，应按照上述方法重新洗涤。

（二）消毒和灭菌

植物组织与细胞培养是在无菌条件下的微繁殖，所有培养基和培养用具都要经过严格的灭菌。

为了防止消毒灭菌后再次遭受污染，培养用品在消毒处理前要进行严密包装。

包装材料常用皱纹包装纸、棉布、铝饭盒等。

较大的瓶皿、三角瓶等只需将瓶口部分紧密包扎即可，而较小的培养皿、金属器械和胶塞等，可先装入铝饭盒，或采用全包装法。

植物组织培养实验的一个重要方面是防止发生微生物（细菌、真菌、病毒等）污染。

污染的来源主要有操作者的疏忽、操作表面或周围空气、培养器皿和培养液消毒灭菌不彻底或存放过久等原因。

有时一个或两个培养物发生污染，会累及整个实验室。

因而，在组织培养的每一个环节，都应采取严格措施，防止发生污染。

如果用过的玻璃器皿壁上粘着了干涸的琼脂，应先用热水将其融化。

若要重新利用曾装有污染组织或培养基的培养器皿，应不开盖经高压灭菌，即使培养器皿是一次性消耗品，在丢弃之前也应进行高压灭菌，以减少细菌和真菌在实验室中的扩散。

消毒的方法主要有：

1．紫外线

紫外线直接照射法使用方便，效果好，是目前各实验室常用的方法，可以消毒空气、工作表面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿（如塑料培养皿、培养板等）。

培养室的紫外线灯应距离地面2.5米之内，使各处每平方厘米有0.06微瓦能量的照射，才能发生有效的杀菌作用。

2．干热消毒

主要用于玻璃器皿的消毒。

需加热到160℃，保持90～120min，才能杀死芽孢，达到消毒目的。

3．湿热消毒

即高压蒸汽消毒，是最有效的一种方法。

布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿以及某些培养液都可以用此法消毒灭菌。

湿热消毒时，消毒品不能装得过满，为保证消毒器内气体的流通。

各种物品有效消毒压力和时间不同，一般为：

培养用液，橡胶制品10磅10分钟

布类、玻璃制品、金属器械15磅20分钟

4．过滤消毒

大多数植物组织培养用液，如人工合成培养液，在高温下不会变性，有些添加物或生物活性物质在高温下可能会失去功能，必须采用滤过法除菌。

常用的正压或负压微孔滤膜，其孔径为0.22µ

或0.45µ

。

5．消毒剂

消毒剂主要是化学制剂，包括新洁尔灭、过氧乙酸和70％酒精等。

主要用来消毒，操作者的皮肤、操作表面、无菌室内的桌椅、墙壁等都要用消毒剂进行擦洗消毒。

三、思考题

1、了解并熟悉植物组织与细胞培养实验室的基本设施与要求?

2、了解并熟悉植物组织与细胞培养的基本要求?

实验二、植物组织与细胞培养基的配制

一、实验目的

学习并掌握植物组织与细胞培养的培养基配制及灭菌等基本技术，了解植物

组织与细胞培养的培养基的基本类型和组成。

二、实验原理

培养基（Medium）是外植体生长的营养物质，通常包括大量元素、微量元素（无机盐类）、维生素、氨基酸，还有糖和水。

迄今为止，基本培养基的配方有几百种，但较常用的仅有一二十种，如MS，改良MS、MT、White、改良White、Nirsch、Blaydes、N6、B5、NT等基本培养基。

另一种完全培养基，即在基本培养基的基础上，根据各种不同试验要求，附加一些物质，如各种植物生长调节剂：

BA、ZT、KT、2iP、2,4-D，NAA、IAA、IBA、GA等，以及其他复杂的有机附加物，包括有些成分尚不完全清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、番茄汁、酵母提取物、麦芽膏等。

培养基的组成中，除上述各种试剂外，若加入适量凝固剂（如琼脂、明胶等），则构成固体培养基，不加凝固剂，为液体培养基，固体培养基和液体培养基各有一些优缺点：

固体培养基所需设备简单，使用方便。

但固体培养基，培养物固定在一个位置上，只有部分材料表面与培养基接触，不能充分利用培养容器中的养分，而且培养物生长过程中，排出的有害物质积累，造成自我毒害，必须及时转移。

液体培养基则需要摇床、转床之类的设备，通过震荡培养，给培养物提供良好的通气条件，有利于外植体的生长，避免上述固体培养基的缺点。

对于常用基本培养基的配制，可分别配成50倍或100倍的混合母液，贮存于冰箱中，用时再按比例稀释混合。

这样使用方便，也减少工作量。

使用时，按顺序吸取各类母液，定容到所需体积，倒入大烧杯中。

然后将蔗糖、肌醇等固体药品一一放入大烧杯。

最后，加入相应量的琼脂在电炉上加热溶解。

待琼脂充分溶解后，用0.1～1.0N的NaOH和HCl对培养基的pH进行调整，一般调整为pH＝5.8。

配制好的培养基分装于各培养瓶或试管中，扎口，与其它包扎好的杂用品一起进行高压灭菌后，放在黑暗条件下保存备用。

三、实验器材和试剂

实验工作台、手推车、试管刷、药匙、记号笔、冰箱、电炉、石棉网、电子天平、高压灭菌锅、蒸馏水洗瓶、蒸馏水瓶、试剂瓶、试管、三角瓶、玻璃瓶、培养皿、pH试纸、称量纸、塑料薄膜、牛皮纸、报纸、纱布、棉线、试管架、容量瓶、移液管、量筒、烧杯、玻棒、洗耳球、隔热手套；

MS培养基配方各试剂、蔗糖、琼脂、肌醇、植物生长调节剂各试剂、0.1NNaOH溶液、0.1NHCl溶液、蒸馏水。

四、实验步骤

（一）配制基本培养基和植物生长调节剂母液：

基本培养基母液配制时应按照配方表分为大量元素、微量元素、有机物和铁盐四部分分别配制。

配制培养基的器皿和用具应洁净，计量准确。

配制培养基用的水原则上应为纯水，一般用蒸馏水即可。

所有母液都需要用纯净的蒸馏水配制。

化学药品用分析纯或化学纯，称量须准确，每称一种药品都必须准确记载，以便日后查对。

配制大量元素母液时应考虑到各种元素的相互作用。

如KH2PO4、MgSO4与CaCl2发生作用会产生Ca3（PO4）2和CaSO4沉淀，故须将大量元素中的各种成分分别配制成各自的母液。

其中，NH4NO3和KNO3的含量较高，配制成100×

的母液在冷存时易析出晶体，故一般配制成50×

的母液，其它成分可配制为100×

的母液。

微量元素母液一般配制为100×

配制时应注意药品加入的先后顺序，避免产生沉淀，为此必须在一种药品充分融解后才能加入下一种药品。

有机物母液一般配制为100×

肌醇易引起母液变质，故不配制在有机物母液中。

配制铁盐母液时不可直接把两种药品一起溶于水中，须将称取好的FeSO4和Na2EDTA药品分别置于两个盛水的烧杯中，再将它们一起加热至50℃～60℃，搅拌使其充分溶解，再把两种溶解好的试剂混和均匀，最后定容，盛装于棕色瓶中。

植物生长调节剂的母液一般配制成500ppm的浓度，配制时须先用少量NaOH溶液或乙醇溶解药品，再用蒸馏水定容。

其中，NAA、IBA等生长素类药物须用热水定容，并用棕色瓶盛装冷存，以避免其见光分解。

所有的母液配制完成后须放入4℃冰箱冷藏保存，已备长期使用。

配制培养基前应先逐一检查各种试剂母液是否沉淀或变色，避免使用已失效的母液。

（二）清洗实验用品

试管、三角瓶、量杯、量筒等玻璃实验用品应先用自来水冲洗，再用少许蒸馏水润洗用品表面，晾干后备用。

（三）培养基配制和灭菌

1.根据实验计划计算出所需配制的培养基的量；

2.根据母液倍数和培养基量计算各种母液（包括植物生长调节剂母液）的吸取量，同时计算出肌醇、蔗糖、琼脂等固体药品的相应添加量；

3.在烧杯中加入少许蒸馏水，并根据步骤2的计算结果吸取相应量的培养基和植物生长调节剂母液；

4.用蒸馏水和量筒定容培养基后倒回烧杯；

5.根据步骤2的计算结果称取蔗糖、琼脂、肌醇等固体药品并加入烧杯中；

6.用电炉溶煮培养基，要不断搅拌，煮沸后须回炉数次，使得琼脂充分溶解；

7.用0.1NNaOH溶液和0.1NHCl溶液调定pH值为5.8；

8.分装并包扎，同时须用记号笔标注组别、培养基的配方及用途等；

9.将培养基和包扎好的培养皿、无菌水瓶等实验用品一起置于灭菌锅中灭菌，121℃下20min；

10.从灭菌锅中取出培养基和实验用品，放置于缓冲间中，冷凝后待用。

五、思考题

1、试述植物组织与细胞培养基的基本类型及其组成?

2、简要说明植物组织与细胞培养基中各种成份的作用与功能?

实验三外植体的分离与愈伤组织诱导

通过对胡萝卜直根和烟草叶片的外植体分离，掌握取材方法、消毒技术和植物组织培养的基本技术，同时了解外植体在培养基上细胞脱分化和愈伤组织形成的情况。

植物组织培养的基础是植物细胞的全能性。

一个植物细胞或植物组织的一部分能在培养条件卞形成愈伤组织，然后增殖或分化成完整的植株。

植物组织培养中的各种接种材料称为外植体（Explant），包括植物的各个器官、组织和原生质体等。

为了使外植体适于在组织培养条件下生长，必须对外植体进行选择与处理，包括切取外植体之前，对供试植株的预处理，接种材料的制备和灭菌等。

无论是组织培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，组织培养的材料都要择性状优良的种质，或特殊的基因型。

对材料的选择要有明确的目标，具有一定的代表性，提高成功的机率，增加其实用价值。

最好从生长健壮的无病虫害的植株上，选取发育正常的器官或组织，其代谢旺盛，再生能力强，组织培养容易获得成功。

采用外植体的大小，根据不同植物材料而异。

外植体太大容易污染；

太小，多形成愈伤组织，甚至难以成活。

一般选取外植体的大小，在0.5～1.0cm。

如果是胚胎培养或脱毒的外植体，则更小。

选择外植体的季节显得特别重要。

一般按照植物生长的最适时期取材。

多数采用茎尖分生组织和胚胎培养的愈伤组织，作为细胞培养的初始材料，进而建立胚性细胞悬浮培养系统。

但为了生产次生代谢物质，则应当选取某次生代谢物质含量高的特定器官或组织，进而筛选某次生代谢物质含量高的器官中的细胞，建立细胞培养系统。

组织培养材料一般取自田间正常生长的植株，也有从温室栽培的植株上选取。

在人工控制的环境条件下，促使母株的生长代谢活跃，外植体的生理状态可能得到改善，有利于外植体的培养。

同时方便取材，容易灭菌，降低污染率，提高成活率。

有些植物的种胚或芽，存在休眠期的问题。

为了适时进行培养，必须采用人工的方法打破休眠期。

通常用低温处理或赤霉素等化学试剂，解除材料的休眠期，促进外植体萌发生长。

组织培养中经常发生污染，材料带菌污染是重要原因。

因此接种材料必须经过严格的灭菌。

三、实验器材及试剂

超净台、酒精灯、打火机、灭菌器、蘸精筒、酒精棉罐、卫生棉、枪形镊、解剖刀、金属搁架、记号笔；

已灭菌的培养皿、打孔器、烧杯、无菌水、空玻璃瓶；

已灭菌培养基（分装于试管或三角瓶）；

95％酒精、70％酒精、0.1％HgCl2溶液、吐温80；

四、实验方法

（一）胡萝卜外植体取材与培养

1．市场上购买胡萝卜直根。

先用清水冲洗三分钟，以去掉外表面污垢。

然后削去外表皮，再用流水冲洗五分钟。

最后，再将双手用洗洁精擦洗，并用清水反复冲洗。

2．将胡萝卜直根切成2～3cm长的切段。

3．洗净双手，穿上工作服，进入无菌室。

无菌室应事先进行20分钟以上的紫外灯照射，并通风30分钟。

4．进行双手表面消毒。

5．进行超净台台面表面消毒及接种器械消毒。

6．进行外植体消毒。

具体方法为在经高压灭菌的烧杯中加入少许70％酒精（以浸没一段胡萝卜根为准），取胡萝卜直根一段，放入烧杯中进行表面消毒数秒钟。

然后将酒精倒到废液瓶中，在烧杯中加入0.1％HgCl2溶液浸没胡萝卜根段约15min。

倾去HgCl2溶液（有毒，小心不要蘸到皮肤，废液也不能直接倒在下水沟中），往烧杯中加入经高压灭菌的无菌水，轻轻晃动，倾去，如此反复冲洗4～6次。

另一种方法则是在酒精浸泡后直接将根段放在酒精灯火焰上燃烧，直至酒精完全燃尽为止，也可取得较好的灭菌效果。

5．将灭菌的根段置于垫有滤纸的无菌培养皿中，然后用无菌打孔器从根段中取出一段含有形成层部分的外植体，放于无菌培养皿中。

用解剖刀将外植体切成1～2mm厚的圆片（弃去两端两片），用镊子将圆片接种在培养基上（贴覆在培养基表面即可），每支试管接种一片，接种好后仍然扎紧管口，用记号笔在试管上写上接种日期、目的等相关信息。

6．将已接入植物组织（外植体）的试管培养在25℃的培养室中，每星期检查1～2次，剔除被污染的试管，观察并记录愈伤组织的形成及生长状况。

（二）烟草叶片外植体取材与培养

1．取烟草植株上幼嫩的叶片，用清水漂洗5min。

再用洗洁精擦洗，然后再用流水冲洗30分钟以上。

2．洗净双手，穿上工作服，进入无菌室。

3．进行双手表面消毒。

4．进行超净台台面表面消毒及接种器械消毒。

5．将已洗净的烟草叶片放入70％酒精（加入1～2滴吐温80）的无菌烧杯中30秒作表面消毒，然后用0.1％HgCl2溶液消毒10分钟，取出后用无菌水冲洗4～6遍，置于垫有无菌滤纸的培养皿中。

用解剖刀切去叶片边缘及主叶脉，并将剩下的部分切成2×

2mm的小片，然后接种到培养基中（贴在培养基表面即可），用记号笔在试管上写上接种日期、目的等相关信息。

6．置于25℃下培养，每星期检查1～2次，剔除被污染的试管，观察并记录愈伤组织的形成及生长状况。

五、结果分析与思考

1、每星期观察并记录胡萝卜直根和烟草叶片外植体在培养基上的生长情况，并对观察到的现象作出解释。

2、简要说明植物愈伤组织诱导的原理与方法?

实验四烟草愈伤组织器官分化

进一步掌握无菌操作技术，学习愈伤组织传代培养，观察植物激素对烟草愈伤组织器官分化（根）的作用。

二、实验原理

植物组织培养的基础是植物细胞的全能性，一个植物细胞或植物组织的一部分能在培养条件下形成愈伤组织，愈伤组织在一定的条件下又可分化成不同的器官或组织，并进而形成完整的植株。

三、实验器材和试剂

超净台、酒精灯、打火机、灭菌器、蘸酒精筒、酒精棉罐、卫生棉、枪形镊、解剖刀、金属搁架、记号笔；

MS培养基配方各试剂、蔗糖、琼脂、肌醇、植物生长调节剂各试剂、0.1NNaOH溶液、0.1NHCl溶液、蒸馏水；

95％酒精、70％酒精。

四、实验准备

1．配制烟草愈伤组织分化培养基，并经分装和高压灭菌后放入无菌室内备用。

2．准备实验用品，如垫有滤纸的培养皿，包扎后经高压灭菌备用；

五、实验步骤

1．洗净双手，穿上工作服，进入无菌室。

无菌