腺病毒载体的构建Word下载.docx

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根据TakaraRNAisoPlus试剂说明提取组织中总RNA：

4.2.1.2cDNA第一链合成

同3.2.6

提取的总RNA反转录为总cDNA，表3-1为反应体系和操作流程：

表3-1cDNA第一链合成体系及操作过程

Table3-1RevertAidTMFirstStrandcDNASythesissystemandoperationprotocol

反转录合成cDNA第一链

总RNA

1.5μL

Primer：

Oligo（dT）18primer

1μL

DEPC处理水

9.5μL

轻微震荡混匀，65℃孵育5min，冰上冷却2min；

瞬时离心收集反应液，置于冰上，按顺序加入以下试剂：

5×

反应缓冲液

4μL

RiboLockTM核糖核酸酶抑制剂（20u/μL）

10MmdNTPs混合物

2μL

RevertAidTMM-MuLV反转录酶（200u/μL）

瞬时离心收集反应液，25℃孵育5min，42℃孵育60min；

70℃5min终止反应，反应产物直接用于PCR或-20℃存放备用。

4.2.1.3SOCS2基因编码区（CDS）的扩增

依照扩增CDS全长的引物设计原则，根据Genbank公布的SOCS2基因序列（NM_007706.3），用PrimerPremier5.0软件设计SOCS2扩增引物，表4-1中SOCS2-F和SOCS2-R为SOCS2基因的扩增引物。

表4-1SOCS2CDS区扩增引物

Table4-1PrimersofSOCS2CDSsequence

Primernames

Primersequence（5-3）

SOCS2-F：

CGTGTTGACTCATCTCCC

SOCS2-R

CATAGCTGCATTCGGAGA

SOCS2-F-BglⅡ

GCAGATCTATGACCCTGCGGTGCCTGG

SOCS2-R-Flag-XhoⅠ

GCCTCGAGTTACTTATCGTCGTCATCCT

TGTAATCTACCTGGAATTTATATTCTT

4.2.1.4SOCS2CDS区的扩增体系和条件

用表4-1中的SOCS2-F和SOCS2-R引物，按照表4-2中的扩增体系和条件扩增SOCS2CDS区。

表4-2SOCS2CDS区的扩增体系和条件

Table4-2PCRamplificationsystemand

10×

PCR缓冲液

1.25μL

dNTPMixture（各2.5mM）

上、下游引物（10μM）

各0.5μL

cDNA

1.3μL

ddH2O

7.45μL

瞬时离心收集反应液，按一下条件进行反应：

预变性（95℃）

5min

反应一：

（20个循环）

变性（95℃）

40s

退货（62℃，每个循环降0.5℃，共20循环）

延伸（72℃）

50s

反应二：

退火（57℃）

反应三：

8min

反应结束后，样品直接用于电泳检测，或暂时存放于4℃，-20℃可存放一周

4.2.1.6SOCS2CDS区的T载体克隆及鉴定

依照TakarapMDTM18-T克隆载体操作说明，将胶回收的SOCS2CDS全长克隆至pMDTM18-T；

A.克隆反应体系和操作步骤如下表，样品添加及试剂融解均在冰上操作；

pMD18-T（50ng/μL）

插入的目的片段（0.1-0.3pmol）

3.5μL

dH2O

0.5μL

SolutionⅠ

5μL

B.瞬时离心，收集反应液。

16℃孵育过夜（>

12h）；

将连接产物10μL加入到100μLDH5α感态中，冰浴30min；

C.42℃热击45s，迅速冰浴1min，此过程不可激烈晃动PCR管，否则影响转化效率；

D.加入1mLLB无抗性培养液，37℃、200rpm震荡培养1h；

E.室温、4000rpm离心5min，收集菌体；

吸弃900μL培养液上清，用枪头吹打100μL余液，重悬菌体；

F.无菌条件下，将100μL菌液均匀的涂于含Amp的LB固体平板，37℃倒置培养；

E.培养约12h，无菌条件下，挑取单菌落于含Amp的LB液体培养液中，37℃、250rpm震荡培养过夜，提取穿梭质粒进行PCR检测；

阳性克隆送至金斯瑞公司测序。

4.2.2DH5α感受态的制备（CaCl2）

无菌条件下，将冻存的DH5α划线接种于无抗性的LB固体平板上，37℃倒置、过夜培养，选取生长良好的单克隆接种于100mL无抗性的LB液体培养液中，于37℃、250rpm，震荡培养过夜（约16h）；

A.从中吸取1mL菌液接种于100mL无抗性的新鲜培养液，37℃、250～300rpm培养2～3h，从2h开始不断对菌液测ODλ=600值，直至0.4≤ODλ=600≤0.6（0.45为最适OD值）；

B.以下步骤必须均需无菌冰上操作，0.1MCaCl2和含15～20%甘油的0.1MCaCl2需要预冷处理；

C.取30mL菌液于50mL离心管，冰上冷却10min；

D.4℃4500rpm离心5min收集菌体；

加3mL0.1MCaCl2溶液，枪头轻轻吹打，使菌体悬浮，冰上放置20min；

E.4℃4500rpm离心5min，收集菌体；

加3mL含15～20%甘油的0.1MCaCl2，枪头吹打混匀菌体；

每100μL分装一管，-80℃冻存。

4.2.3质粒转化

A.-80℃冻存的感受态，冰上融化或室温融化后立即置于冰上；

B.向100μL感受态中加入连接产物（含量≤50ng，体积≤10μL），摇匀，冰上静止30min；

C.42℃水浴热激90s，或37℃水浴5min，热击后迅速置于冰上，静止5min；

操作过程不要有激烈摇动；

C.向离心管中加1mL无抗性LB培养基，混匀后，37℃250rpm振荡培养1h，细菌恢复正常生长，抗性基因开始表达；

D.将上述菌液4000rpm离心5min，弃去1mL上清，重悬菌体，菌液均匀涂于含相应抗性的LB固体平板，放置30min后，37℃倒置培养过夜。

4.2.4质粒的小量提取

挑取最新筛选的含有穿梭质粒的单克隆于含有相应抗性的LB培养基中，37℃300rpm激烈振荡培养12~16h，获得的新鲜菌液依照OmegaE.Z.N.A.质粒小量提取试剂盒的操作说明提取穿梭质粒，所有步骤均在室温下操作。

4.2.5重组穿梭穿梭质粒的构建

4.2.5.1SOCS2CDS区的PCR扩增和回收

以pMDTM18-SOCS2穿梭质粒为模板，表4-1中SOCS2-F-BglⅡ和SOCS2-R-Flag-XhoⅠ分别为上游和下游引物，按表4-2中的反应体系和操作步骤扩增SOCS2，所用引物带有所需要的酶切位点（下划线部分）和Flag标签（斜体部分）。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行检测，切取含目的片段的胶块，按4.2.5步骤回收PCR产物，微量定量仪测定浓度待用。

4.2.5.2SOCS2基因和pAdTrack-CMV穿梭质粒的的双酶切及回收

以微量定量仪测定的浓度为参照，按下列体系对目的DNA进行BglⅡ和XhoⅠ的双酶切，穿梭质粒酶切体系：

Buffer

pAdTrack-CMV（0.5～1μg/μL）

6μL

BglⅡ

0.6μL

XhoⅠ

dH2O

10.8μL

SOCS2PCR产物酶切体系：

SOCS2

11μL

15μL

瞬时离心收集反应液，37℃孵育5h，产物进行1%琼脂糖电泳，将酶切的获得的目的条带切下，按4.2.5步骤回收双酶切的DNA，测定浓度备用。

4.2.5.3SOCS2基因与pAdTrack-CMV穿梭质粒片段的连接

将双酶切后回收产物的质量浓度计算转化为摩尔浓度，目的DNA和穿梭穿梭质粒DNA以10:

1的摩尔比混合，T4连接酶连接，连接体系如下：

2.5μL

SOCS2CDS（约0.3pmol）

5.5μL

CMV（约0.03pmol）

0.7μL

T4连接酶（350U/μL）

15.3μL

瞬时离心收集反应液，16℃孵育过夜，取10μL连接产物按4.2.3步骤将重组穿梭穿梭质粒转化DH5α感受态，于含Kan（100μg/mL）的固体LB平板，37℃倒置培养过夜。

挑取生长良好的单克隆，于含15mLKan（100μg/mL）的LB液体培养基，37℃摇菌过夜，培养液浑浊后，取800μL菌液甘油（15～20%）冻存备用，其余用于穿梭质粒提取和后期检测。

4.2.5.4重组穿梭质粒的菌落PCR鉴定

取10μL单克隆摇菌获得的菌液，用无菌水稀释至100μL，以0.5μL稀释后的菌液为模板，用SOCS2CDS区的扩增引物为检测引物，按照SOCS2CDS的扩增参数和体系见表1，进行PCR扩增。

产物用1%琼脂糖凝胶检测，凝胶成像观察，依照扩增片段的大小，对挑取的单克隆做初级筛选，以备后续参考。

4.2.5.5重组穿梭质粒的小量提取

选取初级筛选正确的单克隆菌液，取5mL依照4.2.4步骤小量提取穿梭质粒。

4.2.5.6重组穿梭质粒的鉴定和测序

A.PCR鉴定:

用无菌水10倍稀释提取的重组穿梭质粒，取0.5μL作为模板，用SOCS2CDS区的扩增引物为检测引物，按照表4-1SOCS2CDS全长扩增的反应体系及参数进行PCR检测。

取5μLPCR产物进行琼脂糖凝胶检测，依照扩增片段的大小鉴定SOCS2是否与重组质粒连接。

鉴定正确的质粒用将酶切鉴定。

B.酶切鉴定：

重组质粒PCR鉴定正确的质粒，进行BglⅡ和XhoⅠ双酶切鉴定，体系：

重组质粒（0.5～1μg/μL）

XhoI

Buffer

H2O

11.8μL

瞬时离心收集，37℃酶切5h，酶切产物取5μL，与2μL上样缓冲液混匀，于1%琼脂糖进行电泳检测，依照Mark大小判断是否酶切出大片段pAdTrack-CMV，和小片段SOCS2。

C.选择PCR与酶切鉴定均正确的质粒，送南京金斯瑞公司测序，测序结果与GenBank所公布的序列一致的，命为pAdTrack-CMV-SOCS2。

4.2.6pAd-SOCS2的构建

4.2.6.1E.coliBJ5183及含pAdEasy-1质粒的E.coliBJ5183感受态的制备

A.E.coliBJ5183感受态制备：

将-80℃冻存的E.coliBJ5183菌株，划线于含链霉素（30～50μg/mL）的LB平板，37℃倒置培养12～16h，如果菌液冻存时间过长，有必要进行二次活化，即挑取单克隆二次划线，最终获得的单克隆摇菌培养，CaCl2法制备感受态，具体步骤见4.2.2.

B.含pAdEasy-1质粒的BJ5183感受态制备：

依照4.2.3步骤将pAdEasy-1质粒转化于BJ5183感受态，涂于含Amp（100μg/mL）的LB平板，挑取单克隆于含Amp（100μg/mL）的液体LB培养基，待菌液浑浊后，同样用CaCl2法获得含pAdEasy-1质粒的BJ5183感受态，步骤见4.2.2。

4.2.6.2PmeⅠ酶切线性化pAdTrack-CMV-SOCS2和CIAP去磷酸化

小量提取质粒法获得质粒pAdTrack-CMV-SOCS2，用PmeⅠ酶切线性化，体系如下：

SOCS2重组质粒（≤4μg）

25μL

100×

BSA

10μL

内切酶

双蒸水

62μL

离心收集，37℃温浴8h，CIAP处理PmeⅠ单酶切的质粒，使其去磷酸化防止自我环化，体系如下：

线性化质粒

60μL（1～20pmol）

CIAP

26μL

A.酶切反应：

37℃或50℃水浴30min，

B.抽提1：

加100μL有机溶液混合物Ⅰ（苯酚：

氯仿：

异戊醇比例为25:

24:

1），用手激烈摇动，使溶液成为乳浊液，12,000rmp离心6min，取上清液；

重复此步骤一次；

C.抽提2：

加等体积（约100μL）的有机混合物Ⅱ（氯仿：

异戊醇比例为24:

1），摇动成乳浊液，离心后取上清；

D.乙醇沉淀：

加10μL即上清1/10体积的NaOAC（3M），250μL即上清2.5倍体积的-20℃预冷乙醇，-20℃冷浴1h；

E.收集和洗涤沉淀：

12000rpm离心12min；

加200μL冷乙醇（70%）洗涤沉淀，12000rpm离心6min；

F.干燥、溶解核酸：

将离心管倒置于滤纸，待管内酒精挥发后，用30μL无菌双蒸水溶解沉淀，冻存备用。

4.2.6.3线性化的重组质粒与骨架质粒重组

取一管-80冻存的BJ5183感受态，室温溶化后迅速置于冰上，加10μL线性化的质粒到感受态细胞中，冰上静止30min，热击法将线性化质粒转化如BJ5183与骨架质粒pAdEasy-1进行重组，详细步骤见4.2.3。

转化产物涂于含Kan（100μg/mL）的LB平板，37℃培养约20h。

4.2.6.4重组质粒的筛选和初级鉴定

重组质粒筛选：

生长20h的平板上可以观察到大小不一的菌落，挑取较小的菌落接种于15mL含Kan（100μg/mL）的液体培养基，37℃振荡培养，菌液浑浊后，取800μL菌液加200μL80%甘油-80℃冻存，其余菌液用作后续鉴定。

重组质粒的初级鉴定即菌液PCR，步骤同4.2.6.4。

4.2.6.5重组质粒的小量提取

取5mL初级筛选正确的菌液，依照小量提取质粒的方法提取质粒，具体步骤见4.2.4。

获得的质粒微量定量仪测定浓度，以备后续使用。

4.2.6.6重组质粒的鉴定和测序

A.质粒PCR鉴定：

同4.2.5.6A。

B.PacI酶切鉴定：

PacI酶切小量提取的重组质粒，酶切反应体系如下：

BufferⅠ

重组质粒DNA（≤1μg）

6.5μL

0.2μL

PacI酶

离心收集反应液，37℃酶切5h后，65℃孵育20min，使酶失活；

取4μL酶切产物，加2μL上样缓冲液，0.8%含EB琼脂糖凝胶进行检测，100V电泳1h后凝胶成像观察，以空穿梭质粒以骨架质粒的重组质粒为对照。

C.测序：

上述鉴定均正确的质粒，送南京金斯瑞公司测序，与GenBank比对后，把测序正确的质粒命名为pAd-SOCS2。

4.2.7大量pAd-SOCS2的获得和PacⅠ酶切线性化

BJ5183中的质粒提取率较低，所以将pAd-SOCS2转化DH5α，步骤详见4.2.3。

从Kan（100μg/mL）平板上挑取单克隆，于含Kan（100μg/mL）的100mLLB液体培养基中37℃250rpm摇菌。

待培养基浑浊后，取800μL菌液加200μL80%甘油冻存，其余菌液全部依照步骤4.2.4提取质粒pAd-SOCS2，再用PacⅠ酶大量酶切重组质粒，体系如下：

pAd-SOCS2

75μL

PacI（10,000U/mL）

3μL

55.5μL

37℃孵育8h，以下步骤同4.2.6.2B-F。

4.2.8pAd-SOCS2的包装、扩繁和滴度测定

4.2.8.1细胞株HEK293的复苏与培养

A.取液氮冻存的HEK293，迅速于37℃中水浴解冻，期间不断晃动使离心管内溶液尽量受热均匀；

B.解冻细胞迅速加到7mL含10%胎牛血清的DMEM培养液中，7mL需要提前预热至37℃，枪头轻轻吹打，无细胞团存在，1300rpm离心6min，弃去上清；

C.向离心管中加2mL提前预热到37℃的含10%胎牛血清的DMEM培养液，吹打细胞使其悬浮，按照5×

104将细胞接种于培养皿，于恒温37℃的5%CO2培养箱培养；

D.24h换液；

以后每隔2d换液一次；

细胞密度达90%时传代。

4.2.8.2pAd-SOCS2包装

转染前一天，按照每孔4×

105个HEK293细胞接种到6孔板，培养24h后细胞约有70%融合，转染前4h，用无双抗PBS清洗2次细胞，将含血清的培养液换为无双抗无血清的优化培养液Opti-MEMI（2mL/孔）；

LipofectamineTM2000作为转染试剂将pAd-SOCS2转染至HEK293细胞，具体步骤依照说明书进行（所有试剂均为一个孔的试剂用量）：

A.用Opti-MEMI优化培养液将4μg质粒稀释至250μL，室温孵育；

B.同样用Opti-MEMI优化培养液将10μLLipofectamineTM2000稀释至250μL，室温孵育5min；

前两步操作不得超过25min；

C.将孵育的质粒和LipofectamineTM2000混匀，总体积为500μL，整个过程尽量轻柔，混合溶液室温孵育20min；

D.将500μL混合液加到培养板的一个孔中，轻轻晃动培养板混匀培养液；

E.37℃5%CO2培养箱培养，6h后将培养液换为含10%胎牛血清的DMEM培养液；

其中6孔板的4个空按上述步骤进行包装，另外两个孔一个为脂质体对照，一个为空白对照。

F.转染24h后可在荧光显微镜下观察，记录细胞内的绿色荧光蛋白GFP的表达，观察细胞病变（Cytopathiceffect,CPE）情况。

转染8～10d后形成一般会有蚀斑出现，此时可将细胞刮下，将细胞收集在冻存管中，于-196℃（液氮中）和37℃反复冻融5次，12000rpm离心5min，收集的上清液即为病毒原液，直接用于后续细胞感染或于-80℃保存，将病毒液命名为Ad-SOCS2。

4.2.8.3Ad-SOCS2的扩繁

60mm培养皿培养细胞，待细胞融合至90%时，将培养皿中的培养液换为新鲜的10%FBSDMEM培养液，将300μL病毒原液加到培养皿中，轻轻晃动培养皿，加培养24h后观察细胞形态和荧光蛋白表达，待细胞病变后收取细胞，1500rpm离心6min收集细胞，加病毒保存液，于-196℃和37℃反复冻融五次，离心去除细胞碎片，根据所需病毒量，继续扩繁病毒或进行病毒滴度测定。

4.2.8.4Ad-SOCS2滴度测定

按每孔2×

104个细胞的密度接种HEK293于96孔板中，采用TCID50法和Karbers法测定并计算Ad-SOCS2的病毒滴度。

将以倍比（10-1~10-10）稀释的病毒液感染细胞，每孔加100μL病毒稀释液，培养9~10d统计细胞的CEP病变。

依照Karbers公式即：

T=10×

101+d（s–0.5）TCID50/mL计算病毒得滴度；

其中s是阳性比率之和，也就是所用个稀释度之和。

d=log10稀释度=1（这是对于10倍的稀释度而言）；

并且根据公式：

T=1×

10XTCID50/mL=1×

10X–0.7PFU/mL，可将病毒滴度换为PFU/mL单位。

4.2.9数据统计及分析

试验所得数据用SPSS13.0统计软件中的One-wayANOVA进行方差分析和显著性检验，数据采用平均值标准差即Means±

SD的形式表示。

4.3结果与分析

4.3.1SOCS2的克隆

提取小鼠皮下脂肪组织的总RNA，反转录获得总cDNA。

用表4-1中的SOCS2-F和SOCS2-R引物进行PCR扩增，获得大小约为700bp的片段（如图4-1A）。

凝胶回收试纯化纯化扩增片段（如图4-1B），T-A克隆至p-MD18载体，获得重组质粒p-MD18-SOCS2，将重组质粒送金斯特生物公司测序，测序结果与GenBank中的NM_007706.3序列进行比对，同源性为100%。

图4-1SOCS2基因PCR及胶回收产物的凝胶电泳分析

A.SOCS2基因的PCR产物；

B.SOCS2基因的胶回收产物。

Fig.4-1SOCS2geneselectrophoresisanalysisofPCRproductandgelrecoveryproduct.

A.PCRproductofSOCS2genes;

B.G